In vitro i in vivo Metabolizam ekstrakta Cistanche Tubulosa kod normalnih i kroničnih nepredvidivih depresivnih štakora izazvanih stresom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

SAŽETAK

Cistanche tubulosa, jedna vrsta Cistanches Herba, nedavno je potvrđeno da ima antidepresivnu efikasnost kod pacova kod hroničnog nepredvidivog stresa (CUS) obnavljanjem homeostaze crijevne mikrobiote. U ovom radu, cilj nam je da istražimo metabolički profil C. tubulosa kod normalnih i CUS-indukovanih depresivnih modela štakora in vitro i in vivo. Koristeći UPLC-Q-TOF-MS, in vitro gastrointestinalni metabolizamEkstrakt Cistanche tubulosa(CTE) je evaluiran i kod normalnih i kod CUS pacova. Istovremeno, in vivo metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod normalnih i depresivnih pacova je također ispitivan u urinu i izmetu pacova. Ukupno 20 i 26 metabolita je okarakterisano iz in vitro i in vivometabolizma kod normalnih i CUS pacova, respektivno. CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)se metabolizira u aglikone i produkte razgradnje feniletanoidnih glikozida (PhG) i iridoidnih glikozida, bilo normalnom ili depresivnom crijevnom mikrobiotom štakora in vitro. Metaboliti faze II aglikona i produkti razgradnje PhGs i iridoidnih glikozida bili su glavni metaboliti u urinu i izmetu pacova. Dodatno, metabolička sposobnost stvaranja sekundarnih glikozida i aglikona u depresivnoj crijevnoj mikrobioti štakora bila je mnogo slabija od one u normalnoj crijevnoj mikrobioti štakora, što se pripisuje poremećenim glikozidnim hidrolazama koje proizvodi crijevna mikrobiota kod pacova s ​​depresijom CUS. Rezultati ove studije postavili su temelj za razumijevanje metaboličkog procesa i terapijskog mehanizma antidepresivnog svojstva CTE.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa, DepresijaMetabolizam, In vitro, In vivo, Intestinalna mikrobiota

1. Uvod

Cistanches Herba je službeno zabilježena kao osušena sočna stabljika Cistanche deserticola (YC Ma) i C. tubulosa (Schrenk), koja se koristi za liječenje nedostatka bubrega, impotencije, ženske neplodnosti, morbidleukoreje, obilne metroragije i senilne konstipacije [1]. Moderne farmakološke studije su pokazale da Cistanches Herba posjeduje različite biološke aktivnosti kao što su anti-neurodegeneracija, imunoregulacija i anti-inflamacija [2,3]. Naše prethodne istrage su to potvrdileEkstrakt Cistanche tubulosa(CTE), koji se sastoje od 48,6 posto feniletanoidnih glikozida (PhG), 6,9 posto iridoidnih glikozida i 20,0 posto ukupnih saharida, mogu značajno ublažiti simptome depresije kod depresivnih štakora izazvanih kroničnim nepredvidivim stresom (CUS) obnavljanje homeostaze crijevne mikrobiote [4]. Nedavne studije pokazuju da su promjene u sastavu crijevne mikrobiote bile povezane s razvojem i napredovanjem depresije [5,6]. Relativna brojnost mikrobnih rodova bila je značajno poremećena kod pacova sa modelom CUS-depresiva u poređenju sa normalnim kontrolama [7]. Kod depresivnih pacijenata, različitost i bogatstvo crijevne mikrobiote također su značajno izmijenjeni [8]. Štoviše, različita jedinjenja uključujući feniletanoidne glikozide (PhGs) i iridoidne glikozide smatrani su glavnim sastojcima Cistanches Herba [2,3], koji su se lako metabolizirali u svoje sekundarne glikozide i aglikone uključujući hidroksitirosol (HT), 3,4-enethyldihydroxy glikozid, deglikozilovana geniposidna kiselina, itd. od strane ljudske crijevne mikrobiote. Ovi metaboliti se lakše apsorbiraju kroz crijeva i ispoljavaju biološku aktivnost u skladu sa komponentom prototipa[9–11]. Stoga smatramo da će tokom nastanka i razvoja depresije, poremećaj strukture crijevne mikroflore neizbježno utjecati na metabolizam oralnih tradicionalnih kineskih lijekova (TCM) u gastrointestinalnom traktu, osim što utiče na fiziološko stanje domaćina. Većina postojećih metaboličkih podataka Cistanches Herba dolazi iz metaboličkih studija na zdravim životinjama[12–15]. Stoga bi bilo od većeg kliničkog značaja istražiti metabolički profil CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u patološkom stanju u rasvjetljavanju njegovih bioaktivnih komponenti i razumijevanju mehanizma djelovanja za njegovu antidepresivnu efikasnost.

U ovoj studiji, cilj nam je da okarakteriziramo metaboličke profile CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kako kod zdravih tako i kod depresivnih pacova izazvanih CUS-om pomoću tečne hromatografije ultra-performanse kvadrupolne masene spektrometrije vremena leta (UPLC-Q-TOF-MS). Želučani sok, crijevna tekućina i mikrobiota normalnih i depresivnih patoloških štakora korišteni su za simulaciju metaboličkog procesa CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u gastrointestinalnom traktu in vitro, nezavisno i uzastopno. Metaboliti in vivo su također razjašnjeni nakon oralne primjene CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod normalnih i CUS pacova. Ova studija pruža nove uvide u metabolizam i aktivne metabolite CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)za depresiju.

2. Materijal i metode

2.1. Materijal

Osušene stabljike C. tubulosa sakupljene su iz okruga Hetian (Xinjiang, Kina). Uzorke vaučera je potvrdio prof. Xiaobo Li i deponovao ih je u herbarijum Farmaceutskog fakulteta Univerziteta Jiao Tong u Šangaju (Šangaj, Kina). Metoda ekstrakcije je korištena kako je navedeno u našoj prethodnoj publikaciji [4]. TheEkstrakt Cistanche tubulosa(CTE) uzorci su čuvani na 4 stepena i ponovo rastvoreni u sterilnoj vodi pre upotrebe. Sterilne vodene otopine CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)uzorci su zatim filtrirani kroz 0.22 μm membranu, a filtrati su sakupljeni u sterilne epruvete.

Echinacoside je obezbijedila laboratorija dr Pengfei Tu, Pekinški univerzitet (Peking, Kina). Akteozid, izoakteozid, 2′-acetilakteozid i cistanozid A su kupljeni od Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Hidroksitirosol, kafeinska kiselina, 3,4-dihidroksibenzenpropionska kiselina, 3-hidroksifenilpropionska kiselina i 3-fenilpropionska kiselina kupljeni su od Aladdin IndustrialInc. (Šangaj, Kina). Čistoća svake komponente određena je na > 95 procenata pomoću HPLC-UV. HPLC acetonitril je nabavljen od Merck-a (Darmstadt, Njemačka). Dejonizovana voda je pripremljena od destilovane vode korišćenjem Milli-Q sistema za prečišćavanje vode (Millipore, Bedford, MA, SAD). Svi ostali korišćeni reagensi i hemikalije su bile analitičke čistoće.

2.2. Eksperimenti na životinjama

Mužjaci Sprague-Dawley pacova (200 ± 20 g) nabavljeni su od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Kina) i smješteni u Centru za laboratorijske životinje Šangajskog univerziteta JiaoTong (Šangaj, Kina). Životinje su bile grupno-držane pod kontrolisanom sobnom temperaturom (25 ± 2 stepena, 55 ± 10 procenata relativne vlažnosti) sa ciklusom svetlosti i mraka od 12:12 h. Pacovima je omogućen slobodan pristup redovnim laboratorijskim pacovima koji jedu i vodu tokom 1 nedelje. Objekti i protokoli za životinje odobreni su od strane Komiteta za etiku životinja na Šangajskom univerzitetu Jiao Tong (Šangaj, Kina).

Nakon jednonedeljne aklimatizacije, dvanaest naivnih pacova nasumično je podijeljeno u dvije grupe (n=6), kontrolnu grupu i grupu sa hroničnim nepredvidivim stresom (CUS). CUS štakori su razvijeni kao u našem prethodnom izvještaju [4], koji su bili izloženi raznim stresorima: bijeli šum (100 dB) 1 h, stroboskopsko osvjetljenje niskog intenziteta preko noći (120 bljeskova/min), nedostatak vode 24 h, prazan flaše za vodu 1 h (nakon uskraćivanja vode), uskraćivanje hrane 24 h, fizičko obuzdavanje (1-2 h), prisilno plivanje (5 min), zaprljan kavez 24 h (200 mL vode u 100 g podloge od piljevine), štipanje repa ( 1 min), šok od 30 min, nagib kaveza od 45 stepeni 24 h, i osvjetljenje preko noći (12 h). Stresori su primjenjivani kontinuirano i nasumično 4 sedmice, detaljan raspored je opisan u Tabeli S1. Nakon 4 sedmice stresa, test preferencije saharoze, test otvorenog polja i test hranjenja suzbiti novosti su izvedeni kao što je prethodno opisano [4]. Obris CUS-a i testa ponašanja prikazani su na slici S1. Nakon testova ponašanja, najmanje 4 fekalne pelete su dobijene od svakog štakora i stavljene u sterilne konične epruvete za in vitro analizu CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)metabolizam.

2.3. Gastrointestinalni metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod normalnog i CUS štakora in vitro

2.3.1. Metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranim želučanim i crijevnim sokovima

Pedeset miligrama CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)dodani su u 10 mL simuliranog želučanog soka i crijevnog soka, respektivno. Zatim CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)inkubiran je na 37 stepeni 4 h u želučanom soku i 6 h u crevnom soku. Kultivisana smeša (1 mL) je ugašena sa 3 mL vode zasićenog n-butanola odmah u 0 i 4 h u želučanom soku, a na 0 i 6 h u crevnom soku. Metoda obrade korišćenog uzorka je prethodno opisana [9].

2.3.2. Metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora

Svježi normalni i CUS uzorci izmeta štakora su prvo pomiješani i homogenizirani sa 25 puta većom zapreminom GAM bujona. Sedimenti su uklonjeni filtracijom kroz tri komada gaze. Suspenzija je zatim inkubirana na 37 stepeni u anaerobnom inkubatoru u kojem je zrak zamijenjen plinskom mješavinom (H2 5 posto, CO2 10 posto, N2 85 posto). Pedeset miligrama CTE je odvojeno dodato u 5 mL normalne i CUS fekalne suspenzije pacova, a suspenzija je inkubirana na 37 stepeni tokom 48 h. Uzgojna smjesa je uklonjena i ekstrahirana vodom zasićenim n-butanolom u 0, 12, 24 i 48 h. Metoda obrade uzorka je prethodno opisana [9].

2.3.3. Sekvencijski metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)želučanim sokom, crijevnim sokom, normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora

Prvo, 100 mg CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)je dodan u 1{{10}} mL simuliranog želučanog soka i inkubiran na 37 stepeni 4 h. Cijela reakcija je ugašena 3 puta većom količinom vode zasićenog n-butanola i centrifugirana na 3000 o/min 15 minuta, nakon čega je uslijedilo isparavanje supernatanta pod strujom dušika gas na 37 stepeni. Drugo, ostatak je ponovo rastvoren u 0,4 mL sterilne vode, dodat u 8 mL simuliranog crevnog soka i inkubiran na 37 stepeni tokom 6 h. Na isti način pripremljen je i uzorak sa želučanim sokom. Konačno, ostatak je ponovo rastvoren u 0,3 mL sterilne vode, dodan u 6 mL normalne i CUS fekalne suspenzije pacova, respektivno, i inkubiran na 37 stepeni tokom 48 h u anaerobikkubatoru. Jedan mililitar reakcije je ugašen sa 3 mL vode zasićenog n-butanola odmah na 0 i 4 h u želučanom soku, na 0 i 6 h u crevnom soku i 0, 12, 24 i 48 h u crevnoj mikrobioti pacova. . Uzorak je obrađen identično CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranom želučanom soku.

2.4. Metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod normalnog i CUS štakora in vivo

Svaki štakor u dvije grupe je potom smješten u individualni metabolički kavez. Nakon gladovanja preko noći koje je omogućilo samo slobodan pristup vodi, svim pacovima je oralno dato 2 mL vode preko agastrične sonde. Prazni uzorci urina i fekalija prikupljeni su od svih pacova od 0 h do 12 h. Nadalje, CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) je primijenjen putem sonde. Uzorci urina i fekalija su prikupljani od 0 h do 24 h. Svi uzorci urina i fekalija su odmah pohranjeni na -80 stepeni.

Uzorci urina i fekalija normalnog i CUS štakora su prethodno tretirani kao što je prethodno opisano [12]. Svi dobijeni uzorci su analizirani pomoću UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Analitička metoda

UPLC je izveden na Waters ACQUITY UPLC sistemu (WatersCorp., Milford, MA, SAD) sa ACQUITY UPLC BEH C18 kolonom (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , SAD) gradijentom elucije upotrebom {{10}}.1 posto mravlje kiseline acetonitrila (A) i 0.1 posto mravlje kiseline u vodi (B) pri brzini protoka od 0,4 mL/min . Profil gradijenta je bio: 0–5 min (A:5–20 posto), 5–7,5 min (A: 20–30 posto), 7,5–10 min (A: 30–70 posto), 10–11 min (A : 70–100 posto), i držao se 1,5 min. Gradijent je vraćen na 5 posto za 0,5 min i držan je 2,5 min za sljedeću vožnju. Zapremina injekcije bila je 3 μL. Temperatura peći na koloni postavljena je na 35 stepeni.

Masena spektrometrija je izvedena korišćenjem Waters Vion IMS masenog spektrometra (Waters Corp., Milford, MA, SAD). Ionizacija je izvedena u negativnom elektrosprej (ESI−) modu. MS parametri su bili sljedeći: kapilarni napon, −2.0 kV; napon konusa, 20 V; temperatura izvora, 120 stepeni; temperatura desolvatacije, 500 stepeni ; protoci gasa konusa i desolvatacije, 50 i 1000 L/h, respektivno. Za precizno merenje mase, leucin-enkefalin je korišćen kao blokada mase za generisanje jona [M–H]− (m/z 554,2615). Eksperiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) u dvije funkcije skeniranja izveden je na sljedeći način: funkcija 1 (niska energija): m/z 50–1000, vrijeme skeniranja 0,25 s, kašnjenje između skeniranja 0,02 s, energija sudara 6 eV; funkcija 2 (visoka energija): m/z50–1000, vrijeme skeniranja 0,25 s, kašnjenje između skeniranja 0,02 s, rampa energije sudara od 20–45 eV.

2.6. Obrada podataka

Podaci su obrađeni pomoću softvera UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, SAD) za identifikaciju metabolita u okviru tačne mase sirovih podataka potpunog skeniranja prikupljenih putem MSE. Jedinjenja su identifikovana na osnovu tačne mase, fragmenata u masspektrometriji visoke energije. Prag intenziteta je postavljen na 100,0 broj. Identifikacija cilja, tolerancija podudaranja fragmenata i drugi parametri su automatski postavljeni.

3. Rezultati

3.1. Promjene u ponašanju u CUS-u izazvale su depresiju štakora

Pacovi sa simptomima depresije izazvanim CUS-om procijenjeni su testovima ponašanja uključujući test preferencije saharoze, test otvorenog polja i test hranjenja suzbijanog novostima. Studentov t-test je otkrio da su preferencija saharoze u testu preferencije saharoze (p < .001),="" ukupna="" pređena="" udaljenost="" u="" testu="" otvorenog="" polja="" (p="">< .001)="" i="" latencija="" za="" jelo="" u="" testu="" hranjenja="" sa="" suzbijanjem="" novosti="" (p="">< .01)="" bili="" značajno="" različito="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnom="" grupom="" nakon="" 4-sedmičnog="" tretmana="" cus-om="" (slika="" 1).="" ovi="" nalazi="" su="" pokazali="" da="" je="" model="" kroničnog="" nepredvidivog="" stresa="" uspješno="">

3.2. Karakterizacija hemijskih sastojaka CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)

Sveobuhvatna analiza prototipnih sastojaka CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)je izveo UPLC-Q-TOF-MS. Ukupno 27 sastojaka iz CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)otkriveni su i probno okarakterizirani, uključujući 20 PhG, 5 iridoidnih i iridoidnih glikozida i 2 oligosaharida. Detaljne informacije, uključujući vrijeme zadržavanja, tačne MS i MS/MS fragmentne jone, navedene su u pratećim informacijama (Tabela S2) kako bi se pružio uvid u strukturu ovih hemijskih sastojaka. UPLC-Q-TOF-MS ukupni jonski hromatogram (TIC) CTE prikazan je na slici S2.

3.3. Gastrointestinalni metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod normalnog i CUS štakora in vitro

U ovoj studiji, potencijalni metaboliti CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod normalnih i CUS štakora in vitro su otkriveni iz TIC-a i identificirani kombinacijom elementarnih sastava i masenih spektra MS/MS fragmenta nakon poređenja sa kontrolnim uzorcima. Svi metaboliti iz CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranim želučanim i crijevnim sokovima, normalna i CUS crijevna mikrobiota pacova navedena su u Tabeli 1.

3.3.1. Metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranim želučanim i crijevnim sokovima

Sedam metabolita CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranom želučanom soku probno su identificirani tačnim informacijama o masi i fragmentima MSE: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12,2,36 min), M5 (m/z,171035, C14H20O8 2.60 min), M7 (m/z179.0338, C9H8O4, 2.85 min), M12 (m/z 785.2481, C35H46O20,4.77 min), M16 (m/z 827.2580, C37H48O23 min., i 6.z. .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglikozilacija, dehidroksilacija, dehidrogenacija i izomerizacija smatraju se glavnim metaboličkim putevima za CTE u želučanom soku. Utvrđeno je da M4 i M5 imaju molekularnu težinu od 2 Da i 16 Da nižu od njihove prototipske komponente, dekafeoilakteozida, te su stoga identificirani kao njegovi dehidrogenirani i dehidroksilirani proizvodi, respektivno. M12 je identificiran kao izomer ehinakozida, koji proizvodi iste jone kao i ehinakozid na m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Isti metaboliti su otkriveni nakon CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)inkubacija u crijevima. Važno je napomenuti da se kafeoilna grupa na poziciji C-6′ u PhGs lako metabolizira pomoću probavnih enzima u crijevnom soku kako bi se proizveli dekafeil metaboliti i kafeinska kiselina.

3.3.2. Metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora

Ukupno 20 metabolita biotransformisanih iz CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnoj ratintestinalnoj mikrobioti su otkriveni i identificirani (slika 2). Iz tih rezultata uočeno je da su PhGs degradirani do aglikon hidroksitirozola (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min), i kafeinske kiseline (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O5 min, 2) zatim. su dalje metabolizirani u M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 4,115 min. , C9H10O3, 4,36 min) dehidroksilacijom, redukcijom i metilacijom. Osim toga, centralni metabolički putevi koji proizvode direktne metabolite prototipskih spojeva PhG iz CTE u normalnoj crijevnoj mikrobioti štakora su redukcija, metoksilacija, deglikozilacija, dekafeoil, dehidrogenacija i izomerizacija.

Nakon inkubacije u crijevnoj mikrobioti štakora izazvane depresijom, CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)je pretvoren u 20 metabolita istim metaboličkim putevima kao i normalni pacovi.

3.3.3. Sekvencijalni metabolizam CTE želučanim sokom, crijevnim sokom, normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora

Nakon sekvencijalne inkubacije u želučanom soku, crijevnom soku, normalnoj i CUS crijevnoj mikrobioti štakora, CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)se metabolizira u 14 metabolita (uključujući 8 sa želučanim sokom, 7 sa crevnim sokom, 11 sa normalnom i 10 sa CUS crevnom mikrobiotom štakora). Među njima, M2(HT) i M11 (3-hidroksifenilpropionska kiselina, 3-HPP) su bili konačni metaboliti PhG nakon sekvencijalne inkubacije CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u želučanom soku, crijevnom soku i crijevnoj mikrobioti. Nije bilo značajne razlike u metabolitima između normalnog i CUS štakora.

M8, M9, M14, M17, M19 i M20 otkriveni su samo u nezavisnom metabolizmu CTE normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora. Ovi metaboliti su uglavnom bili metabolički intermedijeri koji su se u potpunosti metabolizirali u konačne metabolite u proučavanju sekvencijalnog metabolizma CTE i stoga ih je teško otkriti.

3.3.4. Razlike između metaboličke stope CTE prema normalnoj i CUS ratintestinalnoj mikrobioti

Da bi se razjasnile razlike između stope metabolizma CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)binormalna i CUS crijevna mikrobiota pacova, relativni sadržaj 27 prototipskih spojeva i 20 metabolita nakon inkubacije sa želučanim sokom, crijevnim sokom, normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora određivani su odvojeno i uzastopno (tablice S3 i S4). Rezultati su pokazali da iako nije bilo značajnih razlika između CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)metabolita normalnih i depresivnih pacova, uočena je značajna razlika u njihovim metaboličkim stopama. Na primjer, C2 i C5 su identificirani kao 8-epiloganska kiselina ili njen izomer. Potpuno su metabolizirani u normalnim uzorcima unutar 12 h inkubacije. U patološki depresivnoj crijevnoj mikrobioti štakora, međutim, oni su temeljito metabolizirani nakon 48 h inkubacije. Bilo je evidentno da je brzina metabolizma kod normalnog štakora bila brža nego kod CUS štakora. Slični rezultati su otkriveni iz C18 (izoakteozid). Štaviše, važno je napomenuti da je površina vrha M12 (izomerizacija ehinakozida) i M16 (izomerizacija tubulozida A) u normalnim uzorcima bila mnogo veća od one u CUS uzorcima, što ukazuje da je reakcija izomerizacije CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)bio je češći u normalnoj crijevnoj mikrobioti štakora nego kod depresivne crijevne mikrobiote štakora.

3.4. Metabolizam CTE kod normalnog i CUS štakora in vivo

Poređenjem bioloških uzoraka grupe tretirane CTE sa praznim biološkim uzorcima, ukupno 26 metabolita (spoj 1-26) CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)otkriveni su innormalni i CUS pacovi (Tabela 2). Tipični UPLC hromatogrami normalnih i CUS uzoraka urina pacova prikazani su na slici 3.

3.4.1. Karakterizacija metabolita CTE u normalnom i CUS raturine

Ukupno 18 in vivo metabolita CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnom uzorku urina štakora su probno identificirani. Metaboliti razgradnje PhG uključujući HT i CA i njihova daljnja sulfatizacija (jedinjenje 1, 2, 3, 5, 8 i 16), metilacija (6, 21, 22 i 24) i metoksilacija (13 i 14) su bili metaboliti. glavni metaboliti u normalnom urinu štakora. Iridoidni glikozidi su se lako metabolizirali u aglikone (23, 25 i 26) kroz deglikozilaciju. Važno je napomenuti da nijedna prototipna komponenta nije otkrivena u normalnom uzorku urina štakora.

U uzorku urina depresivnog štakora, 22 metabolita CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)su otkriveni i okarakterisani. Jedan prototip jedinjenja, 8-epiloganska kiselina, otkriven je u patološkom urinu pacova. Ostali metaboliti bili su u skladu s onima pronađenim u normalnom urinu štakora, uključujući sulfatirane metabolite (1, 2, 3, 8, 10 i 16), metilirane metabolite (6, 11, 19 i 22), metoksilovane metabolite (13 i 14) HT i CA i teaglikoni iridoidnih glikozida (25 i 26).

3.4.2. Karakterizacija metabolita CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnom i CUS pacovskom izmetu

U ovoj studiji, samo jedan metabolit (jedinjenje 20, 3-HPP) CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)je identificiran u normalnom izmetu pacova. Većina PhG-a je prvo razgrađena u CA i posljedično je podvrgnuta daljem metabolizmu do svog glavnog mikrobnog metabolita, 3-HPP. U uzorku fekalija od CUS štakora, 3 metabolita su uslovno karakterizirana, uključujući sulfatirani 3-HPP (jedinjenje 16) i sulfatirani HT (jedinjenja 2 i 3).

3.4.3. Razlike između in vivo metabolita CTE kod normalnih i CUS štakora

Nakon oralne primjene CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa), in vivo metaboliti su pokazali očigledne razlike kod zdravih i depresivnih modelnih štakora. 21 metabolit (jedinjenje 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 i 19–26) je detektovan iu zdravim i CUS uzorcima pacova. Jedinjenje 23 (deglikozilovana genipozidna kiselina) je identificirano samo u uzorcima zdravih pacova, dok jedinjenja 4 (HT), 7 (8-epiloganska kiselina), 15 (3, 4-dihidroksibenzenpropionska kiselina) i 18 ({{ 19}}HPP glukuronidna konjugacija) otkriveni su samo u uzorcima pacova CUS modela. Ukratko, prototipni sastojci su otkriveni samo kod CUS pacova, dok su metaboliti više faze II otkriveni kod normalnih pacova.

4. Diskusija

U ovoj studiji, tri in vitro modela inkubacije, uključujući želučani sok, crijevni sok, normalnu i CUS crijevnu mikrobiotu štakora, korištena su nezavisno i uzastopno za istraživanje gastrointestinalnog metaboličkog profila CTE.(Ekstrakt Cistanche tubulosa)in vitro. Utvrđeno je da PhG i iridoidni glikozidi u CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)su se lako metabolizirali u svoje sekundarne glikozide i aglikone od strane CUS-indukovane depresivne crijevne mikrobiote štakora. Nakon toga, in vivo metabolizam CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod normalnih i CUS pacova je također potvrđeno. Predloženi metabolički putevi za CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod zdravih i depresivnih pacova izazvanih CUS-om prikazani su na slici 4. PhGs, kao što su ehinakozid i akteozid, metabolizirani su u HT i CA, a CA je podvrgnut daljem metabolizmu do svog glavnog mikrobnog metabolita, 3-HPP. HT, CA i 3-HPP su zatim metabolizirani u njihove sulfatirane, metilirane i metoksilirane metabolite. Iridoidni glikozidi, uključujući geniposidnu kiselinu, kankanozid A i kankanozid N, metabolizirani su u svoje aglikone deglikozilacijom. Ovo je dalje pokazalo da PhGs i iridoidni glikozidi u CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)su se lako metabolizirali u sekundarne glikozide i aglikone kod CUS pacova. Ovi metaboliti obično pokazuju bolju crijevnu apsorpciju i bioraspoloživost da bi se dalje apsorbirali u krv kako bi ispoljili biološku aktivnost [16–18]. Vrijedi napomenuti da je izomerizacija bila preovlađujuća za PhG u gastrointestinalnom traktu, relevantni metaboliti su identificirani nakon upoređivanja sa UPLC vremenom zadržavanja njihovih prototipnih spojeva na osnovu optimiziranog idealnog UPLC gradijentnog profila.

Kafeinska kiselina bila je primarni proizvod razgradnje CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)depresivnom patološkom mikrobiotom crijeva štakora. Prethodne publikacije su objavile da kafeinska kiselina proizvodi efekte slične antidepresivima u testu prisilnog plivanja na miševima. Nivo mRNA oba mozga neurotrofičnog faktora (BDNF) u frontalnom korteksu i nivo TrkB mRNA u amigdali je značajno smanjen nakon testa prisilnog plivanja, a prvo smanjenje je značajno inhibirano kafeinskom kiselinom [19]. Hidroksitirosol je bio aglikon PhGs, koji štiti neurogenezu i kognitivne funkcije sprečavajući stresom izazvanu smanjenje neuralnog proteina BDNF [20]. Stoga je potrebno više pažnje posvetiti nekim bioaktivnim metabolitima (npr. HT i CA) transformiranim crijevnom mikrobiotom nakon oralne primjene.

Osim toga, sadašnji nalazi pružaju dokaz da je kod depresivne crijevne mikrobiote, metabolička sposobnost stvaranja sekundarnih glikozida i aglikona bila znatno slabija od nenormalne crijevne mikrobiote štakora. Razlog se vjerovatno može pripisati depresijom izazvanim strukturnim promjenama crijevne mikrobiote, što dovodi do smanjene aktivnosti metaboličkih enzima koje proizvodi crijevna mikrobiota [21]. Zanimljivo je da je prethodna studija pokazala da tip Bacteroidetes kodira najzastupljenije gene glikozidne hidrolaze i polisaharid liaze za hidrolizu glikozida i cijepanje složenih ugljikohidrata s mehanizmom eliminacije [22]. Konkretno, Bacteroides spp. uključujući B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis i B. ksilanisolveni su pokazali dominantan ukupan broj gena koji kodiraju GH i PL. Parabacteroides distasonis također posjeduje iste karakteristike [22]. Naše prethodne studije su potvrdile da je 28-dnevna hronična nepredvidiva stresna stimulacija smanjila relativnu brojnost rodova Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas i Weissella, dok je povećala Ruminococcus i Deinococcus kod pacova [4]. Važno je napomenuti da su Bacteroides i Parabacteroides bile dvije najrasprostranjenije mikrobne taksone koje su činile približno 20 posto relativne zastupljenosti kod normalnih pacova. Nakon tretmana CUS-om, relativna količina Bacteroides i Parabacteroides naglo je pala na približno 5 posto kod depresivnih modelnih štakora. Stoga će to neminovno dovesti do smanjenja ukupnog broja GH i PL enzima kod CUS štakora i dodatno remeti deglikoziliranu reakciju CUS depresivne crijevne mikrobiote nakon oralne primjene CTE.(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kod modela pacova.

5. Zaključak

U ovoj studiji, UPLC-Q-TOF-MS tehnika je uspostavljena i primijenjena za skrining i identifikaciju metabolitaCistanche tubulosaextractkod normalnih i CUS depresivnih pacova in vitro i in vivo. Rezultati su pokazali da je CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)se metabolizira u aglikone i produkte razgradnje PhGs i iridoidnih glikozida od strane zdrave i depresivne crijevne mikrobiote. Nakon oralne primjene CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa), metaboliti faze II aglikona i produkti razgradnje PhGs i iridoidglikozida pretežno su pronađeni u urinu pacova. Metabolička sposobnost stvaranja sekundarnih glikozida i aglikona u depresivnoj intestinalnoj mikrobioti bila je mnogo slabija od one u normalnoj crijevnoj mikrobioti štakora, što se pripisuje poremećenim glikozidhidrolazama koje proizvodi crijevna mikrobiota kod pacova s ​​depresijom CUS. Ova studija pruža novu perspektivu za kasniju perspektivu razvoj CTE(Ekstrakt Cistanche tubulosa)kao potencijalni antidepresiv.

Priznanja

Ovaj rad je podržan grantovima iz Nacionalnog ključnog programa za istraživanje i razvoj Kine (2017YFC1702400).

Dodatak A. Dodatni podaci

Dodatni podaci za ovaj članak mogu se naći na mreži na HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Od: ' In vitro i in vivo metabolizamEkstrakt Cistanche tubulosakod normalnih i kroničnih nepredvidivih depresivnih pacova izazvanih stresomYang Li, et al

--Časopis za kromatografiju B 1125 (2019) 121728

Reference

[1] Kineska farmakopejska komisija, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Peking, Kina, 2015, str. 135 Dio I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analiza hemijskih sastojaka u vrstama Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: pregled njegove hemije, farmakologije i farmakokinetike, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Efekti slični antidepresivimaEkstrakt Cistanche tubulosana štakorima od kroničnog nepredvidivog stresa kroz obnovu homeostaze crijevne mikrobiote, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Osa crijeva i mozga: kako mikrobiom utječe na anksioznost i depresiju, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Nedavni razvoji u razumijevanju uloge crijevne mikrobiote u zdravlju i bolesti mozga, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Varijacije u crijevnoj mikrobioti i fekalnom metaboličkom fenotipu povezane s depresijom sekvenciranjem 16S rRNA gena i LC/ MS-based metabolomics, J. Pharm. Biomed. Anal. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Prenošenje bluesa: crijevna mikrobiota povezana s depresijom inducira neurobihejvioralne promjene kod pacova, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Humani gastrointestinalni metabolizam vodenog ekstrakta Cistanches Herba in vitro: razjašnjavanje metaboličkog profila zasnovanog na sveobuhvatnoj identifikaciji metabolita u želučanom soku, crijevima sok, ljudske crijevne bakterije i crijevni mikrozomi, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identifikacija metabolita ehinakozida koje proizvode ljudske crijevne bakterije korištenjem tečne hromatografije ultra-performanse/kvadrupolne masene spektrometrije vremena leta, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Skrining i identifikacija tri tipična metabolita feniletanoidnih glikozida iz Cistanches Herba od strane ljudskih crijevnih bakterija korištenjem UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Brzi skrining i identifikacija razlika između metabolita Cistanche deserticola i C. tubulosa vodenog ekstrakta kod pacova pomoću UPLC- Q-TOF-MS kombinovana analiza prepoznavanja obrazaca, J. Pharm. Biomed. Anal. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Sistematski karakteriziraju metabolite ehinakozida i akteozida iz Cistanche tubulosa u plazmi, žuči, urinu i fecesu štakora na osnovu UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Pristup identifikaciji sekvencijalnih metabolita tipičan feniletanoidni glikozid, ehinakozid, zasnovan na tečnoj hromatografiji-vreme zarobljavanja jona
analiza masene spektrometrije leta, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolizam ehinakozida, dobrog antioksidansa, kod pacova: izolacija i identifikacija njegovih bilijarnih metabolita, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Razumijevanje molekularnih mehanizama međudjelovanja između biljnih lijekova i crijevne mikrobiote, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Apsorpcija i dispozicija ginsenozida nakon oralnog primjena ekstrakta Panax notoginseng pacovima, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interakcije crijevne mikrobiote s funkcionalnim komponentama hrane i nutraceuticima, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Kafeinska kiselina ublažava smanjenje ekspresije kortikalne BDNF mRNA izazvane izlaganjem prisilnom stres plivanja kod miševa, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Primjena hidroksitirozola kod majke poboljšava neurogenezu i kognitivne funkcije kod prenatalnog stresa potomstvo, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Utjecaj crijevne mikrobiote na metabolizam i toksičnost lijekova, Stručno mišljenje. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Obilje i raznolikost enzima aktivnih ugljikohidrata u mikrobioti ljudskog crijeva, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.