Ekstrakt Cistanche Deserticola povećava formiranje kostiju u osteoblastima--I dio

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Abstract
Ciljevi Istražili smo efekatCistanchedeserticolaMa. (CD) uključenkostformiranjekultivisanim osteoblastima. Metode Za ispitivanje in vitro efekata CD-a korišten je test formiranja mineraliziranih nodula(Cistanchedeserticola)onkostformiranje. Ekspresija mRNA alkalne fosfataze (ALP), koštanih morfogenetičkih proteina (BMP)-2 i osteopontina (OPN) analizirana je kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze u realnom vremenu. Mehanizam djelovanja CD-a(Cistanchedeserticola)Ekstrakt je istražen pomoću Western blotinga. In vivo anti-osteoporotski efekat CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt je procijenjen kod miševa sa ovariektomijom.
Ključni nalazi

CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije imao efekta na proliferaciju, migraciju ili zacjeljivanje rana kultiviranih osteoblasta, ali je povećao ALP, BMP-2 i OPN mRNA i mineralizaciju kostiju. Mitogen-aktivirana protein kinaza (MAPK) ili inhibitori nuklearnog faktora (NF)-kB smanjuju CD(Cistanchedeserticola)indukovano ekstraktomformiranje kostijui ALP, BMP-2 i OPN izraz. Međutim, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije utjecao na osteoklastogenezu. Osim toga, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt spriječio gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom in vivo.
Zaključci

CD(Cistanchedeserticola)može biti romanformiranje kostijusredstvo za liječenje osteoporoze.

Ključne riječiformiranje kostiju; Cistanchedeserticola; Kinesko bilje; osteoblasti

Cistanche deserticolaje dobro zaformiranje kostiju

Uvod

Kost je složeno tkivo sastavljeno od nekoliko tipova ćelija koje prolaze kroz kontinuirani proces obnove i popravke koji se naziva 'remodeliranje kosti'. Dva glavna tipa ćelija odgovorna za remodeliranje kosti su osteoklasti, koji resorbuju kost, i osteoblasti, koji formiraju novu kost. Remodeliranje kostiju reguliše nekoliko sistemskih hormona (npr. paratiroidni hormon, 1, 25-dihidroksi vitamin D3, polni hormoni i kalcitonin) i lokalni faktori (npr. dušikov oksid, prostaglandini, faktori rasta i citokini).[1] Osteoporoza nastaje kada su resorpcija i formiranje kosti nekoordinirane i višak razgradnje kosti premašuje izgradnju kosti.[2] Trenutni tretmani za osteoporozu uključuju bisfosfonate, kalcitonin i estrogen, koji su inhibitori resorpcije kostiju koji održavaju koštanu masu inhibirajući aktivnost osteoklasta.[3] Međutim, učinak ovih lijekova na povećanje ili oporavak koštane mase je relativno mali, svakako ne više od 2 posto godišnje.[3] Stoga postoji potreba za sredstvima za izgradnju kostiju, kao što je teriparatid, koji stimulišu novekostformiranjei korigovati promjenu trabekularne mikroarhitekture koja je karakteristična za uspostavljenu osteoporozu.[4,5] Jer nova.kostformiranjeje prvenstveno funkcija osteoblasta, agensi koji djeluju ili povećanjem proliferacije stanica osteoblastne loze ili indukcijom diferencijacije osteoblasta mogu poboljšati formiranje kosti.[5,6]
Iako mehanizmi osteoporoze ostaju nejasni, oni su vjerovatno povezani sa smanjenom dostupnošću ili efektima faktora rasta kostiju, kao što su koštani morfogenetski proteini (BMPs).[7] BMP, koji su strukturno povezani sa transformišućim faktorom rasta-b superfamilije, prvobitno su identifikovani po njihovom kapacitetu da izazovu ektopičnukost formiranjekod glodara.[8] BMP igraju važnu ulogu ukostformiranjei diferencijaciju koštanih ćelija stimulacijom aktivnosti alkalne fosfataze (ALP), kao i sintezom proteoglikana, kolagena i osteopontina (OPN).[9] Nedavna studija je otkrila vezu između osteoporoze i specifičnih polimorfizama u genima BMP-2, ALP i OPN, sugerirajući da su povezani s razvojem osteoporoze.[10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; skraćeno kao CD)(Cistanchedeserticola)je autohtona biljka u Kini i široko se koristi u tradicionalnoj medicini kao terapeutsko sredstvo zbog svojih sedativnih, analgetskih i imunostimulirajućih svojstava.[11] Moderne farmakološke studije su pokazale da CD(Cistanchedeserticola)ekstrakti mogu stimulirati imunitet,[12] ukloniti slobodne radikale[13] i povećati aktivnost superoksid dismutaze.[14] Protuupalni i antioksidativni agensi imaju potencijal za liječenje osteoporoze povećanjemkost formiranjei/ili suzbijanje resorpcije kosti.[15,16] Međutim, efekat CD-a(Cistanchedeserticola)o funkciji koštanih ćelija još nije utvrđeno. Evo, prijavljujemo taj CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije uticao na proliferaciju, migraciju ili aktivnost zacjeljivanja rana kultiviranih osteoblasta, ali je povećao ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN i mineralizaciju kostiju. Osim toga, pokazujemo da signalni putevi protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) i nuklearnog faktora (NF)-kB mogu biti uključeni u CD-posredovano povećanje ekspresije gena i mineralizacije kostiju. Nasuprot tome, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije potisnuo osteoklastogenezu in vitro. Posebno, tretman miševa CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt spriječio gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom in vivo. Naši podaci, dakle, sugeriraju da je CD(Cistanchedeserticola)može se koristiti za stimulacijukostformiranjeza liječenje osteoporoze.

Cistanche deserticolapojačati imunitet

Materijali i metode

Ekstrakt i materijali Cistanche deserticola

CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt je kupljen od Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Tajvan). Ekstrakcija i izolacija CD-a(Cistanchedeserticola)su praćeni kako je prethodno opisano (na osnovu spektralnih podataka identifikovali su hemijski sastav uključujući beta-sitosterol, daukosterol, jantarnu kiselinu, triakontanol, akteozid, betain i polisaharid).[17] Zečja poliklonska antitijela specifična za p-ekstracelularne signalno regulirane kinaze (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminalne kinaze (JNK), JNK, p-p65 i p65 kupljena su od Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, SAD). ELISA komplet za osteokalcin kupljen je od Biosource Technology (Nivelles, Belgija). C-terminalni telopeptidi ELISA kompleta tipa I kolagena dobijeni su od Cross Lapsa (Herlev, Danska). Dominantno negativni mutant p38 dao je dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, SAD). JNK dominantno-negativnog mutanta dao je dr. M. Karin (Univerzitet Kalifornije, San Dijego, SAD). ERK2 dominantno-negativni mutant dao je dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Svi ostali reagensi su nabavljeni od Sigma-Aldrich (St Louis, SAD).

Ćelijska kultura

Mišja ćelijska linija osteoblasta MC3T3-E1 je kupljena od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, SAD). Ćelije su uzgajane u 95 posto zraka, 5 posto CO2 sa a-MEM koji je dopunjen sa 20 mm HEPES i 10 posto toplinom inaktiviranim fetalnim telećim serumom, 2 mm glutamina, penicilina (100 U/ml) i streptomicina (100 mg /ml).

Mjerenje formiranja mineraliziranih nodula

Formiranje mineralizovanih nodula je procenjeno kako je opisano.[18] Ukratko, osteoblasti su kultivisani u medijumu koji sadrži vitamin C (50 mg/ml) i b-glicerofosfat (10 mm) tokom dve nedelje, a podloga je menjana svaka tri dana. Nakon inkubacije sa CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakta 12 dana, ćelije su isprane dva puta sa 20 mm Tris puferiranim fiziološkim rastvorom koji sadrži 0,15 m NaCl (pH 7,4), fiksiran u ledeno hladnom 75 posto (v/v) etanolu 30 minuta, i na zraku osušeni. Depozicija kalcijuma određena je bojenjem alizarinom crvenom-S. Ukratko, ćelije i matriks fiksirane etanolom obojeni su 1 h sa 40 mm alizarinskim crvenim-S (pH 4,2) i opsežno isprani vodom. Vezana mrlja je eluirana sa 10 posto (w/v) cetilpiridinijum hlorida, a alizarin crveni-S u uzorcima je kvantifikovan merenjem apsorbancije na 550 nm i upoređen sa standardnom krivom. Jedan mol alizarin crvenog-S selektivno veže približno dva mola kalcijuma.

Cistanche deserticolaje dobro zaformiranje kostiju

Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu

Ukupna RNK je ekstrahirana iz osteoblasta pomoću TRIzol kita (MDBio Inc., Tajpej, Tajvan). Reverzna transkripcija je izvedena korišćenjem 2 mg ukupne RNK i oligo(dT) prajmera.[19,20] Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qPCR) izvedena je korišćenjem TaqMan® jednostepene PCR Master Mix-a (Applied Biosystems, Carlsbad, Carlsbad, PCR). SAD). Dodata je ukupna cDNK (100 ng po 25-ml reakciji) sa prajmerima specifičnim za sekvencu i Taqman® sondama. Svi ciljni genski prajmeri i sonde su kupljeni komercijalno, uključujući b-aktin kao internu kontrolu (Applied Biosystems). qPCR testovi su izvedeni u tri primjerka na StepOnePlus sistemu za detekciju sekvenci (Applied Biosystems). Uslovi ciklusa bili su 10-min aktivacije polimeraze na 95 stepeni praćeno 40 ciklusa od 95 stepeni tokom 15 s i 60 stepeni tokom 60 s. Prag je postavljen iznad kontrolne pozadine bez šablona i unutar linearne faze amplifikacije ciljnog gena da bi se izračunao broj ciklusa u kojem je transkript otkriven (označen CT).

Western blot analiza

Ćelijski lizati su pripremljeni kako je prethodno opisano.[21,22] Proteini su razdvojeni pomoću SDS-PAGE i prebačeni na Immobilon polivinil difluoridne membrane (Millipore, Billerica, SAD). Mrlje su blokirane sa 4 posto goveđeg serumskog albumina 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim ispitane zečjim anti-humanim antitijelima protiv p-65, ili p-p65 (1:1000) 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon tri ispiranja, mrlje su inkubirane sa sekundarnim anti-zečjim antitelom konjugovanim s peroksidazom (1:1000) 1 h na sobnoj temperaturi. Mrlje su vizualizirane pojačanom hemiluminiscencijom korištenjem X-OMAT LS filma (Eastman Kodak, Rochester, SAD).

Osteporoza izazvana ovarijektomijom

Za ovo istraživanje korištene su ženke ICR miševa, stare četiri sedmice, težine 22~28 g. Miševi su obostrano podvrgnuti ovariektomiji pod anestezijom trikloroacetaldehidom (100 mg/kg), a kontrolni miševi su lažno operisani (Sham) radi poređenja. Mineralna gustina kostiju i mineralni sadržaj kostiju mjereni su nakon oralne primjene različitih koncentracija CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt svaka dva dana tokom četiri nedelje. Ukupna tjelesna mineralna gustina kostiju i mineralni sadržaj kostiju određeni su dvoenergetskim rendgenskim apsorpciometrom (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, SAD) koristeći način rada za male subjekte kao što je prethodno opisano.[18, 23] Svi protokoli su bili u skladu sa institucionalnim smjernicama i odobreni su od strane Komiteta za brigu o životinjama Kineskog medicinskog univerziteta.

Statistička analiza

Statistička analiza je izvršena korištenjem Prism 4.01 softvera. (GraphPad Software Inc., San Diego, SAD). Date vrijednosti su srednje vrijednosti SEM. Statistička analiza između dva uzorka izvršena je pomoću Studentovog t-testa. Statistička poređenja više od dvije grupe izvršena su korištenjem jednosmjerne analize varijanse sa Bonferronijevim posthoc testom. U svim slučajevima, P < 0,05="" se="" smatra="">

Cistanche deserticolaje dobro zaformiranje kostiju

Rezultati

Cistanche deserticolaekstrakt povećava mineralizaciju kostiju osteoblastima Dodavanje CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt tokom 24 ili 48 h nije uticao na proliferaciju mišjih osteoblastnih MC3T3-E1 ćelija u MTT testu (podaci nisu prikazani). Budući da je diferencijacija osteoblasta složen proces koji uključuje proliferaciju i migraciju stanica, testirali smo i migratornu sposobnost MC3T3-E1 ćelija nakon tretmana CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt. Koristeći Transwell i testove zacjeljivanja rana, pronašli smo taj CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije uticao na migraciju osteoblasta (podaci nisu prikazani). Formiranje mineraliziranih nodula jedan je od markera sazrijevanja osteoblasta. Bojenje Alizarinom crvenom S pokazalo je da se mineralizirani noduli formiraju kada su osteoblasti kultivirani dvije sedmice u podlozi koja sadrži vitamin C (50 ug/ml) i -glicerofosfat (10 mm), na način koji ovisi o koncentraciji dodavanjem CD-a.(Cistanchedeserticola)(Slika 1a). Stoga, CD(Cistanchedeserticola)ekstrahovanjem izazvano formiranje koštanih nodula kultivisanim osteoblastima, ali ne i njihovu proliferaciju ili migraciju. Također smo ispitali ulogu CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt u osteoklastogenezi izazvanoj RANKL-om, ali nije našao nikakav učinak (podaci nisu prikazani).

Ekstrakt Cistanche deserticola povećava alkalnu fosfatazu, koštani morfogenetski protein-2 i ekspresiju osteopontina u kultivisanim osteoblastima

Diferencirani osteoblasti pokazuju povišenu aktivnost ALP, što je u korelaciji sa visokim nivoom ekspresije enzima.[18] Našli smo taj tretman sa CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt tokom 72 h značajno povećava aktivnost osteoblasta ALP (slika 1b). S obzirom na ključnu ulogu BMP-2, ALP i OPN u diferencijaciji osteoblasta, testirali smo da li je CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt djeluje na diferencijaciju osteoblasta regulacijom ekspresije BMP-2, ALP i OPN. Tretman ćelija CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrahuje povećanu ekspresiju mRNA ALP, BMP-2 i OPN na način ovisan o koncentraciji (Slika 1c), pokazujući da CD(Cistanchedeserticola)ekstraktom indukovanu diferencijaciju osteoblasta povećanjem ekspresije ALP, BMP-2 i OPN.

Ekstrakt Cistanche deserticola povećava formiranje koštanih nodula putem puta protein kinaze aktiviranog mitogenom

Prijavljeno je da MAPK igra važnu ulogu ukostformiranje[24,25] pa smo zatim ispitali da li je ovaj signalni put uključen u CD(Cistanchedeserticola)mineralizacija kostiju izazvana ekstraktom. Predtretman ćelija sa ERK inhibitorom U0126, inhibitorom p38 SB203580 ili JNK inhibitorom SP600125 reducira CD(Cistanchedeserticola)mineralizacija kostiju povećana ekstraktom (slike 2a, 3a i 4a). Nadalje, inhibitori su blokirali i CD(Cistanchedeserticola)ekspresija ALP, BMP-2 i OPN izazvana ekstraktom (Slike 2b-4c). Transfekcija ćelija sa ERK2, p38 ili JNK mutantom redukovanim CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt-povećanje ekspresije mRNA ALP, BMP-2 i OPN (Slike 2c, 3c i 4c). Zatim smo direktno ispitali aktivaciju ERK, p38 i JNK nakon CD-a(Cistanchedeserticola)tretman ekstraktom. Inkubacija ćelija sa CD-om(Cistanchedeserticola)ekstraktom indukovana ERK, p38 i JNK fosforilacija (Slike 2d, 3d i 4d). Dakle, ERK, p38 i JNK posreduju u povećanjukostformiranjeizazvano CD-om(Cistanchedeserticola)tretman osteoblasta.

Ekstrakt Cistanche deserticola povećava formiranje koštanih nodula putem nuklearnog faktora-kB puta

Kao što je već spomenuto, NF-kB aktivacija je neophodna zakostformiranje.[26,27] Zatim smo tretirali osteoblaste inhibitorima NF-kB pirolidin ditiokarbamatom (PDTC) i N-tozil-L-fenilalanin hlorometil ketonom (TPCK) kupljenim od Calbiochema (Darmstadt, Njemačka) kako bismo utvrdili da li je aktivacija NF-kB aktivna. uključen u CD(Cistanchedeserticola)mineralizacija kostiju izazvana ekstraktom. Slika 5a pokazuje da je predtretman osteoblasta sa PDTC ili TPCK inhibirao CD(Cistanchedeserticola)formiranje koštanih nodula izazvano ekstraktom, a također je smanjilo povećanje ekspresije ALP, BMP-2 i OPN (Slike 5b i 5c). Fosforilacija NF-kB p65 podjedinice je pokazatelj aktivacije NF-kB;[28] u skladu s tim, otkrili smo da CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt povećao fosforilaciju p65 u osteoblastima (slika 5d). Ovi rezultati su pokazali da je aktivacija NF-kB važna za ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN-a izazvanu ekstraktom CD-a i formiranje koštanih nodula.

Slika 4 Učešće c-Jun N-terminalnih kinaza (JNK) uCistanchedeserticola(CD) mineralizacija kostiju u osteoblastima izazvana ekstraktom. (a) Ćelije su postavljene u ploče sa 24-jažicama i kultivisane u medijumu koji sadrži vitamin C (50 mg/ml) i b-glicerofosfat (10 mM) tokom dve nedelje. Ćelije su istovremeno tretirane CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). Formiranje mineraliziranih nodula procijenjeno je bojenjem alizarinom crvenom-S (n=5). (b, c) Ćelije su prethodno tretirane SP600125 30 minuta ili transficirane sa JNK mutantom ili 24 h, nakon čega je uslijedila stimulacija ekstraktom CD-a, aktivnost alkalne fosfataze (ALP) i ALP, koštani morfogenetski protein (BMP)-2 i Ekspresija osteopontina (OPN) mRNA mjerena je pomoću ALP kompleta i kvantitativne lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu. (d) Ćelije su tretirane CD ekstraktom u naznačenim vremenskim intervalima, a ekspresija p-JNK je ispitana Western blot-om. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)grupa tretirana ekstraktom.

Inhibicija gubitka koštane mase ekstraktom Cistanche deserticola kod miševa sa ovariektomijom

Da ispitamo efekat CD-a(Cistanchedeserticola)ekstraktom na gubitak koštane mase, osteoporoza je inducirana kod ženki miševa ovariektomijom. Kao što se i očekivalo, miševi sa ovariektomijom pokazali su smanjenu ukupnu tjelesnu mineralnu gustinu kostiju i sadržaj minerala u kostima (Slike 6a i 6b). Tretman CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt četiri sedmice inhibirao je gubitak mineralne gustine kostiju i mineralnog sadržaja kosti na način ovisan o dozi (Slike 6a i 6b). Koncentracije ALP u krvi mogu odražavati aktivnost osteoblasta.[29] Kao što je prikazano na slici 6c, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt inhibirao smanjenje aktivnosti ALP u serumu izazvano ovariektomijom. Osim toga, CD(Cistanchedeserticola)Ekstrakt takođe povećava nivo osteokalcina, markerakostformiranje, i smanjio nivo C-terminalnih telopeptida kolagena tipa I, markera resorpcije kosti (Slike 6d i 6e). Ovi nalazi stoga podržavaju potenciju i efikasnost CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt u prevenciji gubitka kosti in vivo.

Slika 6 Inhibicija ovariektomije izazvana smanjenjem mineralne gustine kostiju i mineralnog sadržaja kostijuCistanchedeserticola(CD) ekstrakt. Ženke ICR miševa su podvrgnute lažnoj operaciji ili su ovariektomizirane. Miševi sa ovarijektomijom tretirani su naznačenim koncentracijama CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt oralnim hranjenjem. Ukupna tjelesna mineralna gustina kostiju (a), sadržaj minerala u kostima (b), aktivnost alkalne fosfataze (ALP) u serumu (c), serumski osteokalcin (d) i serumski C-terminalni telopeptidi kolagena tipa I (e), određeni su četiri sedmicama nakon operacije. Podaci su predstavljeni kao srednji SE, n=8–10 miševa/grupa. *P < 0.05,="" u="" poređenju="" sa="" lažnim;="" #p="">< 0,05,="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" sa="">

DISKUSIJA

Kliknite ovdje za informacije o dijelu II (Diskusija i zaključak) ovog članka.

Od: 'Cistanchedeserticolaekstrakt se povećavakostformiranjekod osteoblastaTe-Mao Li^aet al

---© 2012 Autori. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Časopis za farmaciju i farmakologiju, 64, str. 897–907