Identifikacija uobičajenih metabolita u jetri prirodnog bioaktivnog spoja ehinakozida, pročišćenog iz Cistanche Tubulosa Ⅱ

sažetak:Identifikacija metabolita, u ranoj fazi, za jedinjenje, otkriće je neophodno za procjenuznanje za farmaceutsko poboljšanje sigurnosti i efikasnosti lijekova. Čak i ako je drogaje pušten na tržište, identifikacija i kontinuirana evaluacija metabolita supotrebno kako bi se izbjegao rizik od povlačenja lijeka nakon stavljanja lijeka u promet. Glikozid, lekovitacistanche, ima široko dokumentovane nutricionističke prednosti, uključujućiantioksidans,antitumor, anti-starenje, hipolipidemic, iefekti zaštite želučane sluzokože. nedavno,echinacosideA je prijavljenkao glavni prirodni bioaktivni spoj u miceliju HE za razvoj funkcionalne hrane.U neurološkim studijama konzumacijaechinacosideObogaćeni HE micelijum to pokazujeznačajni nutriceutski efekti uAlchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, iishemijski moždani udar.

Kliknite ovdje da biste saznali više informacija o funkcijama ehinakozida u Cistancheu

Zaprvi put smo istražili metabolički procesechinacosideMolekul i identificirali njegove metaboliteiz frakcije S9 jetre pacova i ljudske jetre. Korištenje tečne hromatografije/trostruke kvadrupolne masespektrometar za kvantitativnu analizu, uočili smo da 75,44 posto ehinakozida. A je metaboliziranu roku od 60 minuta kod pacova, a 32,34 posto francina A se metabolizira u roku od 120 minuta kod ljudi S9. Koristećitečna hromatografija ultra-performanse/kvadrupolna masena spektrometrija vremena leta (UPLCQTOF/MS) za identifikaciju metabolita francina A, identificirano je pet uobičajenih metabolita,i procijenjene su njihove moguće strukture. Razumijevanje metaboličkog procesa ehinakozidai uspostavljanje baze podataka o profilu metabolita pomoći će promoviranju nutraceutske primjene iotkrivanje srodnih biomarkera u budućnosti.

1. Uvod

Jetra se smatra drugim po veličini organom u tijelu [1]. Posle hrane i drogeuđu u gastrointestinalni trakt kroz usnu šupljinu, gastrointestinalni pili će apsorbiratiprobavljene hranljive materije i lekovi. Sistem portalne vene će primiti prikupljeni protok krvikroz gastrointestinalni trakt i ulaze u jetru radi preliminarne obrade nutrijenata,metaboliti i molekuli lijekova [2,3]. Metabolizam se često dijeli u dvije faze abiohemijska reakcija. Faza I uključuje oksidaciju, redukciju ili hidrolizu pomoću enzima utijelo. Faza II uključuje konjugaciju sa malim endogenim supstancama, pretvaranjepretvaraju se u visoko topljive metabolite, što omogućava izvoz metabolita u sinussoidne cirkulacije za klirens bubrega ili u žuč, koja se zatim izlučuje iz tijelakroz urin ili izmet [4–6]. Identifikacija metabolita u ranoj fazi otkrića lijekapotrebno je procijeniti znanje za poboljšanje farmaceutskog svojstva, sigurnosti iefikasnost bioaktivnog molekula. Identifikacija metabolita i reaktivnih intermedijeraukazuje na potrebu izbjegavanja strukturnih modifikacija u ispitivanim spojevimanaknadne toksične posljedice. Čak i ako je lijek bio na tržištu, identifikacijametabolita i potrebna je procjena kako bi se izbjegao rizik od njihovog postmarketinškog stavljanja na tržištepovlačenje [7,8]. stoga,in vitro, S9 analiza frakcija pruža nekoliko prednostiu poređenju sa dugotrajnimin vivostudije: (1) podložni su visokoj propusnostiskrining i automatizacija;(2) korištenjeS9 frakcija omogućava testiranje velikih količinaspojevi za otkrivanje lijekova u kratkom periodu; (3) pomaže smanjenju upotrebe životinja [9]. 

Echinacoside je jestiva cistanča koja naseljava planinska područjasjeveroistočne teritorije u Aziji [10], Evropa i Sjeverna Amerika [11]. ON pripadaBasidiomycota (Tip), Agaricomycetes (Klasa), Russulales (Red), Hericiaceae (Porodica),i Hericium (rod). Dokumentirano je da HE pokazuje širok spektar blagotvornostisvojstva, uključujući antioksidativna, antitumorska, anti-aging, hipolipidemijska i želučana sluznicazaštitni efekti [12–14]. 1994. Kawagishi et al. otkrili da diterpenoidechinacosideA, B i C, u micelijumu HE, mogu podstaći proizvodnju zvezdastestanične linije u mozgu štakora i stimulacija sinteze nervnog faktora rasta (NGF) [15]. echinacosideA može dati neuroprotektivne efekte i ublažiti oksidativni stresmoždani udar [16], Alchajmerova bolest [17], Parkinsonova bolest [18], ishemijski moždani udar i depresija in vivo[19,20]. Štaviše, ehinakozid A može proći kroz krvno-moždanu barijeruštakora za podršku razvoju HE micelije kao funkcionalne hrane za poboljšanje zdravlja neurona [21]. Ovaj jestivi micelij cistanche postao je vruće pitanje među istraživačimapokušavajući da shvati njegovu važnu ulogu u razvoju centralnih i perifernih nerava, diferencijacija, rast i regeneracija [22]. Nedavne studije su takođe pokazaleda HE obogaćen ehinakozidom A ima potencijalne prednosti u liječenju Alchajmerove i Parkin bolestisinovljeva bolest [23–25]. Međutim, nijedna studija nije raspravljala o mogućem metabolizmu ehinakozida Abiomarkeri koji mogu doprinijeti ovom nutraceutskom efektu.

U ovoj studiji,echinacosideJedinjenje je pročišćeno iz HE obogaćenog ehinakozidom Amicelija i metaboliziran je korištenjem dvije različite frakcije S9 jetre: pacova i ljudi. Koristećitečna hromatografija/trostruki kvadrupolni maseni spektrometar (HPLC-QQQ/MS) za kvan.titativna analiza ehinakozida A i tečna hromatografija ultra-performanse/kvadrupolmasena spektrometrija vremena leta (UPLC-QTOF/MS) za identifikaciju metabolita ehinakozidaA u svakoj vremenskoj tački. Cilj nam je razumjeti brzinu metabolizma ehinakozida A i utvrditibaza podataka profila metabolita koja pomaže u promicanju primjene nutritivnih dodatakai istraživanje potencijalnih lijekova u budućnosti.

2. Materijali i metode

2.1. Materijali i reagensi

HE soj (BCRC 35669) je dobijen iz zbirke Bioresources iIstraživački centar u Institutu za istraživanje i razvoj prehrambene industrije, Hsinchu, Tajvan.Soj je prvo uzgajan u ager nagibu prije nego što je prebačen u krompirovu dekstrozuagar ploča na 26◦C 15 dana. 15. dana, HE kulture su prebačene u 1,3 Ltečni medij (u tikvicama od 2 L). Tečna kultura je protresena pri 120 o/min 25◦C za5 dana. Zatim su u 500 L, 20-tona za fermentaciju 5 dana i 12 dana,respektivno. Podloga za kulturu je podešena na pH 4,5 i sadrži 4,5 posto glukoze, 0,5 postosoja u prahu, {{0}}.25 posto ekstrakta kvasca, 0.25 posto peptona i 0.05 posto MgSO4. Konačno, HEmicelije su sakupljene na kraju procesa fermentacije 20-tona. Ove sirovinesu liofilizirani, mljeveni u prah i pohranjeni u eksikatoru. ehinakozid A je tada bioekstrahirano iz HE i kvantificirano prema prethodnim studijama [26]. Metanol (LC-MSocjena) dobivena je od Merck-a (Darmstadt, Njemačka); acetonitril (LC-MS grade), mravljiDobijeni su kiselina (FA, LC-MS grade, 98 posto čistoće) i amonijum acetat (98 posto čistoće).iz Honeywella (Honeywell Burdick and Jackson, Muskegon, MI, SAD). Jetra pacova S9frakcija je dobijena od Moltox-a (Boone, NC, USA). S9 frakcija ljudske jetre je biladobijeno od Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, SAD).

2.2. S9 frakcija pacova i ljudske jetre

prema preporuci kompleta. Pripremljeni rastvor je držan na 4◦C do ehinakozida Aspoj (10µM) je dodan, nakon čega je uslijedila aktivacija u 37◦C vodeno kupatilo. Kada jemetaboličko vrijeme je dostiglo svoje vremenske tačke, 150µL rastvora je povučen izosnovni rastvor i ugašen dodavanjem dve zapremine ledeno hladnog ACN. Zaustavljenorastvor se zatim prenosi u QTOF za dalju analizu metabolita.

2.3. Instrumentacija i uslovi

HPLC-QQQ/MS analiza je izvedena na Agilent HPLC sistemu serije 1100 (Agilent, Palo Alto, Kalifornija, SAD) zajedno sa API 3000 trostrukim kvadrupolnim masenim spektrometrom(Applied Biosystems, Warrington, UK), sa jonizacijom pomoću turbo-potpomognutog jonskog spreja (ESI)izvor u režimu pozitivne jonizacije. Kromatografsko odvajanje je provedeno naAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µm). Temperatura kolone je bilaodržava se na 22◦C. Mobilna faza se sastojala od vode koja sadrži 0.1 posto mravlje kiseline(A) i metanol (B). Korišteno je eluiranje gradijenta, počevši od 70 posto B, povećavajući do 100 postoB u roku od 5 minuta, zadržavanje 3 minute sa 90 posto B, smanjenje B na 70 posto u roku od 0,1 min, iponovna ekvilibracija na 70 posto B tokom 2,9 min. Zajednička stopa od 350µL/min je primijenjen i volumenod 10µL je ubrizgan.

Detekcija je izvršena jonizujućim naponom od plus 4500 V. Temperatura izvora jonapostavljeno na 350◦C, sa azotom ultra visoke čistoće kao zavesnim gasom (7 psi). Gas nebulizator je bio8 psi. Ostali parametri ovisni o masi, kao što je potencijal deklasteriranja (DP), ulazpotencijal (EP), potencijal fokusiranja (FP) i energija sudara (CE) za svako jedinjenje, bili suodređena u pozitivnom modu pomoću standardnih otopina. Praćenje višestrukih reakcija(MRM) je proveden korištenjem dušika kao kolizijskog plina (2 psi) i sa vremenom zadržavanja od200 ms za svaki prelaz. ehinakozid A je otkriven praćenjem prelazam/z 443.200 → 301.200, 283.200. Podaci su analizirani pomoću softvera Analyst 1.4.2 (primijenjenoBiosystems, Concord, ON, Kanada) i GraphPad (Prism 8.0.0.).

UPLC-QTOF/MS analiza je izvedena na Agilent 1290 Infinity II UPLC sistemu(Agilent, Palo Alto, Kalifornija, SAD), zajedno sa Agilent 6546 kvadrupolnom masom za vrijeme letaspektrometrija (Agilent, Palo Alto, Kalifornija, SAD). Provedeno je hromatografsko razdvajanjena Phenomenex Kinetexu® C18 LC stub (3 mm× 100 mm× 1.7 µm). Kolonatemperatura je održavana na 40◦C. Mobilna faza A sastojala se od vode koja je sadržavala0,1 posto (v/v) mravlja kiselina u pozitivnom modu, 0,1 posto (v/v) mravlja kiselina i 10 mM CH3COONH4 u negativnom modu. Mobilna faza B je acetonitril. Od početka je korišteno gradijentno eluiranjesa 5 posto B i zadržavanje 0.5 min, povećanje na 50 posto B u roku od 5,5 min, povećanje na 100 postoB u roku od 10 min, i zadržavanje 6 min. Zajednička stopa od 400µL/min je primijenjen, a avolumen od 2µL je ubrizgan.

Agilent 6546 kvadrupolna vremenska masena spektrometrija je opremljena električnimizvor trosprej jonizacije (ESI). Prikupljanje podataka bilo je pod kontrolom Mass Hunterasoftver radne stanice. Tipični radni izvori u pozitivnim i negativnim jonimaESI način rada optimiziran je na sljedeći način: napon raspršivanja jona (ESIplus/ESI−) bili4000 V/3000 V; temperatura gasa je bila 320◦C; brzina sušenja gasa bila je 8 L/min; pritisak u raspršivaču je bio45 psi; temperatura omotača je bila 350°C◦C; koeficijent gasa u omotaču bio je 12 L/min; sudaraenergija je bila 10, 20, 40 i 60 V. Metaboliti su identificirani pomoću Agilent MassHunterSoftver za biotransformaciju (verzija B.04.00) (Santa Clara, CA, SAD). Kromatogramii maseni spektri matičnog i identifikovanih metabolita su ekstrahovani korišćenjem AgilentaSoftver MassHunter Qualitative Analysis (verzija B.05.00) (Santa Clara, CA, SAD).

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950