Echinacoside Rb1 ublažava vaskularno oštećenje povezano sa starenjem modulacijom puta gasa6

SAŽETAK

Kontekst:EchinacosideRb1 (Rb1) ispoljava mnoge korisne efekte i štiti od kardiovaskularnih bolesti.

Cilj: Istražiti može li Rb1 ublažiti vaskularno oštećenje uzrokovano starenjem i identificirati mehanizam. Materijali i metode: Ženke miševa C57BL/6J starosti 2 i 18 mjeseci, nasumično raspoređene u grupe mladih, mladih þ 20 mg/kg Rb1, Oldþ vozila, starih þ 10 mg/kg Rb1 i starih þ 20 mg/kg Rb1, svakodnevno intraperitonealno ubrizgan vehikulum ili Rb1 tokom 3 meseca. Segmenti torakalne aorte korišteni su za inspekciju vazorelaksacije zavisne od endotela. Tkiva lijeve torakalne aorte sakupljena su za histološke ili molekularne ekspresijske analize, uključujući proteine ​​povezane sa starenjem, markere relevantne za kalcifikacija i fibrozu, i ekspresiju Gas6/Axl.

Rezultati: Otkrili smo da je u grupi sa Oldþ nosačem ekspresija proteina starenja i molekula ćelijske adhezije značajno povećana, uz lošiju relaksaciju torakalne aorte ovisno o endotelu (58,35 posto ± 2,50 posto) nego u grupi Young (88,84 posto ± 1,20 posto). ). Međutim, tretman Rb1 značajno je smanjio nivoe ekspresije ovih proteina i očuvao opuštanje ovisnu o endotelu kod starijih miševa. Štaviše, tretman Rb1 je takođe smanjio taloženje kalcijuma, taloženje kolagena i nivoe ekspresije proteina kolagena I i kolagena III kod starijih miševa. Nadalje, otkrili smo da je smanjenje ekspresije Gas6 proteina za 41,72 posto i ekspresije mRNA za 52,73 posto kod starijih miševa u poređenju sa mladim miševima ukinuto tretmanom Rb1. Ali nije bilo značajne razlike u ekspresiji Axla među grupama.

Zaključci: Naša studija potvrđuje da bi Rb1 mogao ublažiti vaskularne ozljede, sugerirajući da bi Rb1 mogao biti potencijalsredstvo protiv vaskularnog oštećenja povezanog sa starenjem.

Kupite Cistanche Rich In Echinacoside

Uvod

U narednih 30 godina u Kini postoji procijenjeno povećanje sa 12,6 posto na 26 posto odraslih u dobi od 65 i više godina (Zhou i Walker 2021). Iako se ljudski životni vijek produžava, bolesti povezane sa starenjem i dalje su tema za zabrinutost.Kardiovaskularne bolestisunajčešćih bolestikoje pogađaju starije osobe.Vaskularno starenjepraćena vaskularnim strukturnim i funkcionalnim promjenama važan je nezavisni faktor rizika zakardiovaskularnih bolesti(Lakatta i Levy 2003). Epidemiološka istraživanja su pokazala da 82 posto pacijenata koji umiru od kardiovaskularnih bolesti imaju 65 ili više godina (Moslehi et al. 2012). Stoga, istraživanje mehanizma vaskularnog oštećenja povezanog sa starenjem i pronalaženje agenasa koji mogu zaštititi vaskularnu funkciju od opadanja uzrokovanog starenjem mogu igrati važnu ulogu u smanjenju incidencije i prevalencije kardiovaskularnih poremećaja povezanih sa dobi kod starijih osoba.

Starenje arterija je implicirano u patogenezi vaskularne disfunkcije i raznih kardiovaskularnih bolesti i obilježje je starenja (Minamino i Komuro 2007). Vaskularne promjene uzrokovane starenjem variraju i uključuju endotelnu disfunkciju, hipertrofiju glatkih mišićnih ćelija krvnih sudova (VSMC), arterijsku dilataciju, reorganizaciju ekstracelularnog matriksa (ECM), vaskularnu kalcizaciju i povećanje omjera kolagena i elastina s fragmentacijom. i vaskularno ukočenost (Tolle et al. 2015). Brandes et al. (2005) izvještavaju da se endotelna disfunkcija povezana sa starenjem obično karakterizira neravnotežom u relaksaciji i kontraktilnim faktorima uzrokovanim endotelom. Dalja studija Herrera et al. (2010) su također pokazali da je endotelna disfunkcija usko povezana s progresivnim padom vazodilatacije ovisne o endotelu. Međutim, još uvijek je nejasno kako starenje utječe na vazodilataciju ili pokreće neravnotežu povezanih faktora i na kraju dovodi do vaskularne disfunkcije. Acosta et al. (2008) su pokazali da vaskularne stanice koje su podvrgnute starenju mogu proizvesti molekule adhezije, uključujući inhibitor aktivatora plazminogena 1 (PAI-1), protein adhezije vaskularnih stanica 1 (VCAM-1) i međućelijski adhezioni molekul{{ 14}} (ICAM-1). Smatralo se da svi ovi adhezioni molekuli igraju važnu ulogu u regrutaciji monocita na aterosklerotična mjesta, a zatim započinju vaskularno remodeliranje, što u konačnici rezultira smanjenjem usklađenosti i povećanjem krutosti (Acosta et al. 2008; Kovačić et al. 2011). Vaskularna ukočenost je najvažnija manifestacija vaskularnog starenja. Pripisuje se remodeliranju ECM-a i doprinosi smanjenju vazodilatacije. Prethodne studije su pokazale da se vaskularna ukočenost i starenje VSMC-a pripisuju medijalnoj kalcizaciji i taloženju kolagena (Mauriello et al. 1992; McClelland et al. 2006; Nakano-Kurimoto et al. 2009; Wendorff et al. 2015; Kim et al. 2015; 20 ). Stoga, disfunkcija vazodilatacije može biti rezultat kalcifikacije i fibroze. Smanjenje taloženja kalcija ili kolagena može odgoditi oštećenje arterija uzrokovano starenjem.

EchinacosideRb1 (Rb1) je jedna od aktivnih komponenti koje se nalaze u ginsengu. Istraživanja su objavila da Rb1 ispoljava mnogo korisnih antisenescencijskih i anti-apoptotičkih efekata, posebno u zaštiti miokarda i endotela (Zheng et al. 2017; Zhou et al. 2017; Zheng et al. 2020). Nedavne studije su pokazale da Rb1 može smanjiti vaskularnu kalcifikaciju povezanu s kroničnom bolešću bubrega i ekspresiju kolagena tipa I kod pacova (Zhou et al. 2019b). Nalazi također sugeriraju da Rb1 smanjuje ekspresiju kolagena tipa I (Kwok et al. 2012). Međutim, efekti Rb1 na vaskularno oštećenje povezano sa starenjem nisu istraženi.

Prijavljeno je da Rb1 inhibira vaskularnu kalcifikacija kroz transaktivaciju gena 6 specifičnog za zaustavljanje rasta (Gas6) in vitro (Nanao-Hamai et al. 2019). Gas6, član porodice proteina zavisnih o vitaminu K, uključen je u regulaciju višestrukih ćelijskih funkcija nakon vezivanja za svoj receptor Axl, membranski receptor tirozin kinaze (Nakano et al. 1997; Fridell et al. 1998; Yanagita et al. 2001). Neke studije su pokazale da Gas6/Axl put igra ključnu ulogu u vaskularnoj biologiji i bolestima kao što su vaskularna kalcifikacija, vaskularno remodeliranje i ateroskleroza (Korshunov et al. 2006; Hurtado et al. 2010; Son et al. 2010). Pretpostavljamo da Rb1 može ublažiti vaskularno oštećenje povezano sa starenjem suzbijanjem kalcifikacije i fibroze, što je potencijalno povezano s regulacijom Gas6/Axl puta.

materijali i metode

Eksperimentalni reagensi

Rb1 (čistoća veća od 98 posto) dobijen je iz Victory-a (Sichuan, Kina). Antitela protiv p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) i GAP16a AbdDH su kupljena od (MA, SAD). Antitela protiv kolagena I (14695), kolagena III (22734) i Axl (13196) nabavljena su od Proteintech Group (MA, SAD). Antitijela protiv Gas6 (A8545) i p16INK4a (A0262) kupljena su od ABclonal Technology (Hubei, Kina). Modifikovani Krebs-Henseleit (KH) pufer, fenilefrin (snažan vazokonstriktor) i acetilholin (Ach, endotelijalno ovisan NO donor) kupljeni su od Sigma-Aldrich (MO, SAD). Svi ostali korišćeni reagensi bili su analitičke čistoće.

Životinje i upravljanje

Ovu studiju je odobrio Institucionalni komitet za njegu i korištenje životinja (IACUC) Univerziteta Sun Yat-Sen. Većina studija o dugovječnosti je pokazala efekte na žene (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); stoga smo izveli našu dugoročnu studiju koristeći ženke miševa. Ženke C57BL/6J miševa stare 2 i 18 mjeseci su dobijene iz Centra za eksperimentalne životinje Univerziteta Sun Yat-Sen. Miševi su hranjeni normalnom ishranom i smešteni u kontrolisanim uslovima (24 ± 2 C i 50 ± 5 procenata vlažnosti) sa svetlosnim/tamnim fotoperiodima od 12 h u specifičnim uslovima bez patogena. 40 mladih ženki C57BL/6J miševa u dobi od 2 mjeseca nasumično je raspoređeno u grupe Young and Young þ 20 mg/kg Rb1 (Young þ Rb1-20) (n=20 svaka). Ovi miševi su tretirani dnevnom intraperitonealnom injekcijom vehikuluma (sterilni fiziološki rastvor) ili 20 mg/kg Rb1 rastvorenog u nosaču tokom 3 meseca pre eutanazije gušenjem CO2 u dobi od 5 meseci. 60 ženki miševa C57BL/6J u dobi od 18 mjeseci nasumično su raspoređene u Old þ vozilo, Old þ 10 mg/kg Rb1 (Stari þ Rb1-10) i Old þ 20 mg/kg Rb1 (Stari þ Rb 1-20) grupe (n ¼ 20 svaka). Miševi koji su preživjeli do kraja ovog eksperimenta primali su dnevne intraperitonealne injekcije samog nosača ili Rb1 (10 ili 20 mg/kg) tokom 3 mjeseca, nakon čega su miševi eutanazirani u dobi od 21 mjesec. Eksperimenti su ponovljeni najmanje tri puta sa 4-5 miševima po grupi.

Materijali i metode Eksperimentalni reagensi

Rb1 (čistoća veća od 98 posto) dobijen je iz Victory-a (Sichuan, Kina). Antitela protiv p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) i GAP16a AbdDH su kupljena od (MA, SAD). Antitela protiv kolagena I (14695), kolagena III (22734) i Axl (13196) nabavljena su od Proteintech Group (MA, SAD). Antitijela protiv Gas6 (A8545) i p16INK4a (A0262) kupljena su od ABclonal Technology (Hubei, Kina). Modifikovani Krebs-Henseleit (KH) pufer, fenilefrin (snažan vazokonstriktor) i acetilholin (Ach, endotelijalno ovisan NO donor) kupljeni su od Sigma-Aldrich (MO, SAD). Svi ostali korišćeni reagensi bili su analitičke čistoće.

Životinje i upravljanje

Ovu studiju je odobrio Institucionalni komitet za njegu i korištenje životinja (IACUC) Univerziteta Sun Yat-Sen. Većina studija o dugovječnosti je pokazala efekte na žene (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); stoga smo izveli našu dugoročnu studiju koristeći ženke miševa. Ženke C57BL/6J miševa stare 2 i 18 mjeseci su dobijene iz Centra za eksperimentalne životinje Univerziteta Sun Yat-Sen. Miševi su hranjeni normalnom ishranom i smešteni u kontrolisanim uslovima (24 ± 2 C i 50 ± 5 procenata vlažnosti) sa svetlosnim/tamnim fotoperiodima od 12 h u specifičnim uslovima bez patogena. 40 mladih ženki C57BL/6J miševa u dobi od 2 mjeseca nasumično je raspoređeno u grupe Young and Young þ 20 mg/kg Rb1 (Young þ Rb1-20) (n=20 svaka). Ovi miševi su tretirani dnevnom intraperitonealnom injekcijom vehikuluma (sterilni fiziološki rastvor) ili 20 mg/kg Rb1 rastvorenog u nosaču tokom 3 meseca pre eutanazije gušenjem CO2 u dobi od 5 meseci. 60 ženki miševa C57BL/6J u dobi od 18 mjeseci nasumično su raspoređene u Old þ vozilo, Old þ 10 mg/kg Rb1 (Stari þ Rb1-10) i Old þ 20 mg/kg Rb1 (Stari þ Rb 1-20) grupe (n ¼ 20 svaka). Miševi koji su preživjeli do kraja ovog eksperimenta primali su dnevne intraperitonealne injekcije samog nosača ili Rb1 (10 ili 20 mg/kg) tokom 3 mjeseca, nakon čega su miševi eutanazirani u dobi od 21 mjesec. Eksperimenti su ponovljeni najmanje tri puta sa 4-5 miševima po grupi.

Određivanje vazorelaksacije u prstenovima torakalne aorte

Nakon što su životinje eutanazirane, prstenovi torakalne aorte su brzo uklonjeni i stavljeni u hladnu KH pufersku otopinu (118 mmol/L NaCl, 4,75 mmol/L KCl, 25 mmol/L NaHCO3, 1,18, mmol/L MgSO4 1. 18 mmol/L KH2PO4, 2,54 mmol/L CaCl2 i 11,1 mmol/L glukoze), a okolna masnoća i tkivo pažljivo su debridovani. Dužina aortnih prstenova bila je približno 3 mm. Segmenti aorte su suspendirani na kukicama od nehrđajućeg čelika, aerirani u KH puferu i kontinuirano oksigenirani sa 95 posto O2 na 37 C. Aortni prstenovi su zatim povezani sa FORT-10 pretvaračima sile za MacLab prikupljanje podataka. Početna pasivna napetost u aortnim prstenovima postavljena je na 3 mN tokom 30 minuta da bi se postigla stabilnost prstena krvnih žila prije daljnjeg eksperimentiranja. KH pufer je zamijenjen svakih 10 min. Fenilefrin je dodan u kupku za tkivo u koncentraciji od 10 5 mol/L da izazove vazokonstrikciju. Nakon postizanja stabilnosti prstena krvnih žila, vazorelaksant Ach (10 9 – 10 5 mol/L) je dodan u kupku za tkivo odmah za redom kako bi se dobila kriva doza-odgovor. Relaksacija pri svakoj koncentraciji je izmjerena i izražena je kao postotak sile generirane kao odgovor na fenilefrin.

Imunohistohemija

Tkiva torakalne aorte su fiksirana u formalinu, dehidrirana, usađena u parafin i izrezana na poprečne presjeke od 4 lm. Ove sekcije su inkubirane u citratnom puferu (pH 6.0) i dva puta stavljene u mikrovalnu po 10 minuta nakon deparafinizacije i rehidracije. Kozji serum (10 posto) (Gibco, BRL, NY, USA) korišten je za blokiranje nespecifičnog vezivanja 1 h na 37 C, nakon čega je uslijedila inkubacija preko noći s primarnim antitijelima protiv p21Cip1 (1:1000) i p16INK4a (1:200). ) na 4 C u vlažnoj kutiji. Nakon tri ispiranja u PBS, dodana su sekundarna antitijela konjugirana s peroksidazom hrena (HRP) (Abcam) i inkubirana 60 minuta na 37 C, nakon čega je uslijedilo bojenje diaminobenzidinom (1:100, Abcam). Hematoksilin je primijenjen da se suprotstavi ćelijska jezgra. Sekcije su prekrivene neutralnom gumom i fotografisane pod Zeiss mikroskopom.

Bojenje hematoksilin-eozinom (HE).

Presjeci torakalne aorte ugrađeni u parafin obojeni su hematoksilinom 2 min. Nakon pranja i tretiranja 1% kiselog alkohola, rezovi su tretirani eozinom bojenjem 3 min. Nakon toga, sekcije su oprane, dehidrirane i tretirane ksilenom prije mikroskopskog promatranja. Presjeci torakalne aorte fotografirani su pod Zeiss mikroskopom.

Massonovo trihromno bojenje

Sekcije torakalne aorte ugrađene u parafin su obojene u Weigertovom željeznom hematoksilinu 10 minuta nakon deparafinizacije i rehidracije, a zatim su isprane PBS-om 5 minuta. Tkiva su zatim obojena u Biebrich-ovom škrlatnom rastvoru fuksina 5 minuta i isprana u destilovanoj vodi. Sekcije su zatim nekoliko puta podvrgnute diferencijaciji i dehidraciji u 75 posto i 90 posto alkohola, nakon čega su isprane u vodi iz slavine. Konačno, sekcije su očišćene u ksilenu i montirane sa medijumom za montažu. Sekcije su vizualizirane mikroskopom. Intersticijalno taloženje kolagena je naznačeno plavo-zelenim bojenjem.

Alizarin crveno S bojenje

Za bojenje kalcifikacije aorte, dijelovi torakalne aorte su obojeni 2 posto otopinom alizarin crvenog S u trajanju od 10 minuta i isprani PBS-om. Zatim su sekcije natopljene u bezvodni aceton 30 s, miješanu otopinu bezvodnog acetona i ksilena (volumenski omjer ¼ 1:1) 15 s i bezvodni ksilen 1 min. Intersticijske soli kalcijum fosfata označene su crvenim bojenjem.

Western blotting

Torakalne aorte su stavljene u RIPA pufer za lizu (HaiGene, Haerbin, Kina) sa dodatkom inhibitora proteaze (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, SAD) i potom homogenizirane ultrazvučnom obradom na ledu. Lizat tkiva je centrifugiran na 12,000 g na 4 C tokom 15 minuta, a supernatant je sakupljen u novu epruvetu. Nakon toga, koncentracija proteina u supernatantu je određena korištenjem kompleta za analizu proteina BCA (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, Kina). SDS PAGE je izveden sa jednakim količinama proteina iz svakog uzorka kao što je prethodno opisano (Zheng et al. 2020), a proteini su zatim prebačeni na PVDF membrane (EMD Millipore, Billerica, MA, SAD). Membrane su inkubirane na 4 C preko noći s jednim od sljedećih primarnih antitijela nakon što su blokirane sa 5 posto goveđeg serumskog albumina (Gibco) 1 h na sobnoj temperaturi: p21Cip1 (1:1000), p16INK4a (1:1000), ICAM{ {16}} (1:1000), VCAM-1 (1:5000), PAI-1 (1:1000), kolagen I (1:1000), kolagen III (1:300), Gas6 (1:1000), Axl (1:500) i GAPDH (1:1000). Nakon ispiranja, membrane su inkubirane sa HRP-konjugiranim sekundarnim antitijelom (Boster, Wuhan, Kina) 1 h na sobnoj temperaturi. Vezivanje sekundarnog antitela je analizirano korišćenjem ECL kompleta (EMD Millipore), a intenziteti traka su analizirani korišćenjem softvera ImageJ (verzija 1.41; National Institutes of Health, MD, USA). GAPDH ekspresija je korištena kao interna kontrola.

Kvantitativni RT-PCR (qPCR) u realnom vremenu

Prvo, ukupna RNK je izolirana iz torakalnih aorta korištenjem TaKaRa MiniBEST univerzalnog kompleta za ekstrakciju RNK (9767, TaKaRa) u skladu sa protokolima proizvođača. Koncentracija RNK je zatim izmjerena DS-11 FX spektrofotometrom (DeNovix). Zatim je ekstrahirana RNK (1000 ng svaka za 20 mL reakcijski sistem) reverzno transkribirana u cDNK koristeći PrimeScriptTM RT Master Mix (RR360A, TaKaRa) prema uputama proizvođača u ProFlex PCR sistemu (Thermo Scientific ). Konačno, proizvodi reverzne transkripcije korišćeni su kao šabloni za dalje PCR amplifikaciju sa SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa). Korištene su sljedeće sekvence prajmera: Gapdh: naprijed 50 -CAGCAACTCCCCA CTCTTCCAC-30 i obrnuto 50 - TGGTCCAGGGTTTCTTAC TC-30; i Axl: naprijed 50 -GGAACCCAGGGAATATCACAGG- 30 i nazad 50 -AGTTCTAGGATCTGTCCATCTCG-30; i Gas6 naprijed 50 -TGCTGGCTTCCGAGTCTTC-30 i nazad 50 -CGGGGTCGTTCTTCGAACAC-30. Svaka reakciona jažica u 96-prozirnoj ploči (Thermo Scientific) koja je sadržavala 0,4 pmol/lL prajmera naprijed i nazad, 1 SYBR Premix Ex Taq II (RR820A, TaKaRa) i 10 ng cDNK. Konačni volumen reakcije bio je 20 mL, a svi uzorci su analizirani u tri primjerka. Amplifikacija cDNK je izvedena na sljedeći način: preddenaturacija na 95 C u trajanju od 30 s, nakon čega slijedi 40 ciklusa denaturacije na 95 C u trajanju od 5 s, i žarenje na 60 C tokom 35 s u QuantStudio5 (Thermo Scientific). Za relativnu kvantitativnu analizu prikupljenih podataka korištena je 2–DDCT metoda. Relativni nivo ekspresije mRNA ciljnih gena dobijen je poređenjem podataka iz eksperimentalne grupe sa podacima kontrolne grupe u odnosu na Gapdh.

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950