Ljudske amnionske mezenhimalne matične ćelije ublažavaju AGVHD nakon Allo-HSCT regulacijom interakcija između crijevne mikrobiote i crijevnog imuniteta
Oct 18, 2023
Abstract
Akutna bolest graft-versus-host (aGVHD) nakon alogenske transplantacije hematopoetskih matičnih stanica predstavlja jedan od najzahtjevnijih izazova. Disbioza crijevne mikrobiote može se nastaviti s aGVHD, a mezenhimalne matične ćelije (MSC) imaju obećavajući terapeutski potencijal za aGVHD. Međutim, ostaje nepoznato da li hAMSC utječu na mikrobiotu crijeva tokom ublažavanja aGVHD-a. U skladu s tim, nastojali smo definirati efekte i temeljne mehanizme MSC-a (hAMSC) dobivenih iz ljudske amnionske membrane koji reguliraju crijevnu mikrobiotu i crijevni imunitet kod aGVHD-a. Uspostavljanjem humaniziranih aGVHD mišjih modela i tretmana hAMSCs, otkrili smo da su hAMSC značajno poboljšali simptome aGVHD, preokrenuli imunološku neravnotežu podskupina T stanica i citokina i obnovili crijevnu barijeru. Štoviše, raznolikost i sastav crijevne mikrobiote poboljšani su nakon liječenja hAMSC-ima. Spearmanova korelaciona analiza pokazala je da postoji korelacija između crijevne mikrobiote i proteina čvrstog spoja, imunih stanica i citokina. Naše istraživanje je sugeriralo da hAMSCs ublažavaju aGVHD promicanjem normalizacije crijevne mikrobiote i regulacijom interakcije između crijevne mikrobiote i crijevne barijere, imuniteta.
cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem
Ključne riječi
Akutna bolest presatka protiv domaćina · Amnionske mezenhimalne matične ćelije · Mikrobiota crijeva · Crijevna barijera · Intestinalni imunitet
Uvod
Primarna prednost alogenske transplantacije hematopoetskih matičnih stanica (alo-HSCT) je snažan antitumorski odgovor zbog efekta graft-versus-leukemia (GVL) koji je pokrenut prepoznavanjem peptida koji proizlaze iz razlika u genomskim polimorfizmima između pacijenta i donator. Međutim, akutna bolest graft-versus-host (aGVHD) vrti se oko razvoja oštećenja tkiva primaoca uslijed napada alo-reaktivnih T-ćelija donora i predstavlja veliku komplikaciju opasnu po život u aloHSCT-u [1, 2]. Prijavljeno je da mikrobni poremećaj crijeva izaziva upalne odgovore i korelira s bolestima povezanim s upalom [3, 4]. Brojne studije su pokazale da su poremećaji u mikrobioti crijeva esencijalni faktor koji pokreće aGVHD nakon alo-HSCT i da postaju nova meta za liječenje [5, 6]. Konkretno, disbiozu crijevne mikrobiote kod aGVHD obično karakterizira gubitak raznolikosti crijevnih bakterija i rast oportunističkih patogena [6]. U gastrointestinalnom GVHD-u, kompromitirana mukozna barijera inicira aktivaciju ćelija koje predstavljaju antigen domaćina i T ćelija donatora, što kulminira diferencijacijom T-ćelija duž paradigmi patogenog tipa-1 i tipa-17 na račun tolerogenih regulatornih T-stanica. ćelijski uzorci [7]. Prvenstveno na osnovu 16S ribosomalne RNK (16S rRNA) sekvenciranje je pokazalo da je više vrsta crijevne mikrobiote povezano s GVHD, a na primjer, klostridije koje proizvode butirat su povezane s održavanjem funkcije epitelne barijere i slabljenjem akutnog GVHD-a [8 ]. Mezenhimalne matične ćelije (MSC) privukle su veliku pažnju u protekloj deceniji zbog svojih potencijala za samoobnavljanje i višelinijske diferencijacije, kao i imunomodulatornih svojstava [9]. Smatra se da MSC omogućavaju oštećenje tkiva iz uravnoteženog upalnog i regenerativnog mikrookruženja u prisustvu snažne upale i naširoko se koriste za liječenje imunoloških poremećaja, u kojima je najuspješnija klinička primjena uključena u liječenje GVHD-a [10]. Ljudske amnionske mezenhimalne matične ćelije (hAMSC) su perinatalne matične ćelije koje posjeduju sposobnost diferencijacije nalik embrionalnim matičnim stanicama i imunomodulatorna svojstva slična matičnim stanicama odraslih. Dijeleći fenotipove slične tipičnim MSC-ima, hAMSC su postali obećavajući izvor matičnih stanica zahvaljujući lakoći, neinvazivnosti i sigurnosti uzimanja tkiva, obilnom prinosu ćelija i vrlo niskim etičkim i moralnim sporovima u poređenju sa matičnim ćelijama iz drugih izvora. Ljudski AMSC imaju prednosti niske imunogenosti i odsustva tumorigenosti, što ih čini idealnim izvorom ćelija za ćelijsku terapiju [11, 12]. In vitro eksperimenti su potvrdili da hAMSC pokazuju veći proliferativni kapacitet i veću sposobnost dugoročnog rasta od MSC-a izvedenih iz koštane srži [13, 14]. Brojne studije su pokazale da hAMSC imaju potencijal za ublažavanje mnogih upalnih bolesti, uključujući inflamatornu bolest crijeva, osteoartritis i autoimune bolesti [11]. Naša nedavna studija je pokazala da hAMSC poboljšavaju aGVHD regulacijom ravnoteže T efektorskih i Treg ćelija [15]. Međutim, učinak i mehanizam hAMSC-a na mikrobni poremećaj crijeva kod GVHD-a su nepoznati. Ovdje nam je cilj istražiti potencijalni utjecaj hAMSC-a na aGVHD, kao i mikroekosistem crijeva. To bi bila prva studija koja bi otkrila mikrobiotu crijeva i njenu korelaciju s crijevnim imunitetom nakon liječenja aGVHD hAMSC-om.
Materijali i metode
Izolacija, kultura i identifikacija hAMSC-a
hAMSC su ekstrahovani kao što je prethodno opisano [15]. Ćelije trećeg prolaza (P3) su sakupljene iz identifikacije fenotipa bojenjem antitelima protiv CD34 (581, BD Pharmingen, SAD), CD45 (HI30, BD Pharmingen, SAD), HLA-DR (G46-6, BD Pharmingen) , SAD), CD11b (ICRF44, BD Pharmingen, SAD), CD90 (5E10, BD Pharmingen, SAD), CD73 (AD2, BD Pharmingen, SAD) i CD105 (SN6, bionauka, SAD), a zatim analiziran protočnim citometrom ( BD FACS Canto II). Ćelije su provjerene na njihovu višelinijsku diferencijaciju korištenjem specifičnog indukcionog medija (BGscience, Kina) i obojene Oil Red-O i Alizarin Red za adipogenezu i osteogenu diferencijaciju, respektivno. Za eksperimente su korišteni hAMSC u pasusima 3 do 6.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Zbirka ljudskih PBMC
Uzorci plazme su nabavljeni od zdravih dobrovoljaca uz pismeni informirani pristanak. Mononuklearne ćelije ljudske periferne krvi (PBMC) izolovane su iz periferne krvi Ficoll-Hypaque (Tianjin Haoyang, Kina) centrifugiranjem gustine, isprane sa PBS, suspendovane u puferu za lizu crvene krvi (Solarbio, Kina) na 4 stepena tokom 15 minuta. Ponovo isperite i zatim suspendirajte u PBS-u za injekciju u repnu venu u NPG miševe.
Miševi
8-10 sedmica starosti i 25-30 g mužjaka i ženki NPG miševa kupljeni su od Beijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd. i uzgajani u uslovima SPF-a u ciklusu svjetlo-mrak od 12 sati sa konstantnom temperaturom i vlagom. Sve postupke na životinjama odobrio je Institucionalni komitet za brigu i upotrebu životinja Južnog medicinskog univerziteta (br. L2019132) u skladu sa smjernicama Nacionalnog vijeća za zdravlje i medicinska istraživanja Kine o eksperimentiranju na životinjama.
Akutni GVHD životinjski model i liječenje
Model miša aGVHD je uspostavljen kao što je prethodno opisano [15]. Za liječenje, 5×105 hAMSCs po mišu (ovdje hAMSCs grupa) i PBS (ovdje aGVHD grupa) su ubrizgani preko repne vene u svakog miša trećeg dana nakon transplantacije. U svim modelima miševa, miševi su provjeravani svaka dva dana na morbiditet i promjene težine. Svaki miš je ocijenjen za patološke karakteristike uključujući gubitak težine, pogrbljeno držanje, naborano krzno, lezije na koži, smanjenu pokretljivost i dijareju, a zatim ocijenjen prema aGVHD kliničkom sistemu bodovanja prilagođenom onom koji je originalno opisao Cooke [16]. U nekim slučajevima, miševi u grupi aGVHD patili su od teškog aGVHD-a, a miševi u grupi hAMSCs trećeg dana nakon tretmana žrtvovani su za uzimanje periferne krvi i ciljnih organa uključujući jetru, slezinu, pluća i crijeva. Izmet ovih miševa je sakupljen prije žrtvovanja.
GFP-obilježeni hAMSC i in vivo praćenje
GFP-obilježeni hAMSC su uspostavljeni i identificirani kao što je prethodno opisano [15]. Ukratko, transficirali smo gen za protein zelene fluorescencije (GFP) u hAMSC sa lentivirusom kao vektorom. 5× 105 GFP-obilježenih hAMSC-a suspendiranih u 500 μL PBS ubrizgano je u aGVHD miševe preko repne vene. Nakon 24 h i 72 h, miševi su eutanazirani kako bi se sakupila crijeva, a zatim su napravljeni smrznuti dijelovi. DAPI kontrastno bojenje je korišteno za razlikovanje ćelija primatelja.
Histopatološka evaluacija
Ciljni organi aGVHD-a su sakupljeni u vrijeme nekropsije, a zatim obrađeni u blokove ugrađene u parafin kako bi se generirali 5- μm-deblji dijelovi za bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E). Histološki rezultati su procijenjeni na osnovu destrukcije strukture tkiva i infiltracije limfocita [17]. Za imunohistohemiju, sekcije su deparafnizovane, rehidrirane i tretirane sa 3% H2O2 u metanolu tokom 20 minuta kako bi se inaktivirala aktivnost endogene peroksidaze. Zatim su sekcije podvrgnute preuzimanju antigena i tretirane serumskim albuminom 1 h. Nakon toga, sekcije su inkubirane sa zečjim anti-humanim CD45 antitelima (EP322Y, Abcam, Engleska) ili ZO{12}} antitelima ((EPR19945-296, Abcam, Engleska) 1 h na 37 stepeni. antitijela su detektirana sekundarnim antitijelima konjugiranim s HRP (Genentech, SAD) i vizualizirana pomoću DAB-a. Pozitivno područje je analizirano pomoću Image J.
cistanche biljka koja povećava imuni sistem
16S rRNA Sekvenciranje fekalne mikrobiote
Fekalna genomska DNK ekstrahirana je iz 0.1 g smrznutih fekalnih uzoraka korištenjem EZNA® DNK kompleta stolice (Omega BioTek, Norcross, GA, SAD) prema protokolu proizvođača. Koristeći genomsku DNK kao šablon, specifični prajmeri (338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′, i 806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) sa barkodovima i PremixplTaq (TaKa) korišteni su za ampliranje V3-V4 hipervarijabilne regije bakterijskog 16S rRNA gena. Nakon amplifikacije i pročišćavanja, cijeli genom uzorka je sekvencioniran na Illumina Hiseq ili Miseq platformi za visoko propusno sekvenciranje od strane Magigene Technology Co., Ltd. (Guangzhou, Kina) kako bi se dobili neobrađeni podaci u FASTQ formatu. Analize podataka o sekvenci uglavnom su vršene pomoću platforme Magichand.
Protočna citometrijska analiza
Dobijeni su aGVHD ciljni organi i periferna krv miševa i pripremljeni u jednoćelijsku suspenziju. Ćelije su obojene monoklonskim antitelima protiv CD3 (UCHT1, Biolegend, SAD), CD4 (RPA-T4, Invitrogen, SAD), CD8 (RPA-T8, Biolegend, SAD), CD25 (BC96, Biolegend, SAD) ili izotipova kontrolisati IgG (eBioscience, SAD) 30 min na sobnoj temperaturi u mraku. Zatim su ćelije obrađene puferom za liziranje (BD Pharm Lyse™) na 4 stepena u mraku 15 minuta. Intracelularno Foxp3 (236A/E7, Invitrogen, SAD) bojenje je obavljeno prema preporukama proizvođača (Fixation/Permeabilization Solution Kit; eBioscience). Zatim su izvršene polihromatske protočne citometrijske analize na protočnom citometru.
Cytokines Quantitation
Nivoi citokina u serumu i supernatantu tkiva miševa određivani su korištenjem Cytometric Bead Array (CBA) Human Th1/Th2/Th17 citokinskog kompleta (BD Pharmingen, SAD) prema uputama proizvođača. Ukratko, 50 μL svakog od uzoraka supernatanta inkubirano je sa 50 μL miješanih perli za hvatanje Th1/Th2/Th17 citokina i 50 μL humanog Th1/Th2/Th17 PE detekcionog reagensa na sobnoj temperaturi u mraku, a zatim suspendirano za analizu protočne citometrije 3 h kasnije.
Kvantitativni PCR u realnom vremenu
Ukupna RNK je ekstrahirana iz tkiva debelog crijeva miša nakon izolacije pomoću Trizol reagensa (TaKaRa, Kina). Ukupna RNK je korištena kao šablon za reverznu transkripciju cDNK. -aktin je korišten kao interna referenca. Ekspresija mRNA je mjerena qPCR korištenjem sljedećih prajmera: ZO-1-F, 5'-ACCACCAACCCGAGAAGAC-3' i ZO- 1-R, 5'-CAGGAGTCATGGACGCACA-3 '; Occludin-F, 5'-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3', i OccludinR, 5'-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3'; -actin-F, 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3', i -actin-R, 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'. 2-ct metoda je korištena za mjerenje nivoa ekspresije RNK.
Enzimski imunološki test (ELISA)
Nivoi D-LA i DAO u plazmi mjereni su korištenjem ELISA kompleta (Jingmei, Kina) prema uputama proizvođača. Ukratko, sakupljeni supernatanti plazme su stavljeni u 96-ploče obložene antitijelima sa dobro specifičnim antitijelima, respektivno. Apsorpcija je zabilježena na 450 nm pomoću čitača mikroploča (Multiskan MK3, Thermo Fisher Scientific).
Statistička analiza
Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. Izveden je t-test nezavisnih uzoraka i vizualiziran pomoću GraphPad Prism8.0. Analiza podataka sekvenciranja 16S rRNA izvršena je korištenjem Magichand platforme (http://cloud.magigenecom/). Analiza korelacije između crijevne mikrobiote i imuniteta provedena je pomoću R paketa (v3.6.3) kako bi se prikazala matrica korelacije. P vrijednosti<0.05 were considered statistically significant. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, n.s. not signifcant.
Rezultati
Identifikacija hAMSC-a
hAMSC-ovi su pokazali poligonsku ili fibroblastnu morfologiju u kulturi (slika 1A) i bili su jako pozitivni na površinsku ekspresiju MSC-specifičnih markera CD90, CD105 i CD73, ali negativni na CD34, CD45, HLA-DR i CD11b (slika 1C). Što se tiče višelinijske diferencijacije, naši rezultati su pokazali da hAMSC pokazuju adipocitnu i osteoblastičnu diferencijaciju (slika 1B).
hAMSC su značajno ublažili simptome aGVHD kod miševa
Prvo smo procijenili terapeutski učinak hAMSC-a na aGVHD. U poređenju sa grupom aGVHD, hAMSC su značajno poboljšali aGVHD, što je dokazano značajno smanjenim gubitkom težine (slika 2B) i smanjenim kliničkim rezultatom aGVHD (slika 2C). Nadalje, grupa hAMSCs imala je značajno veću stopu preživljavanja u poređenju sa aGVHD miševima (slika 2D). Patološka histološka analiza je pokazala da je aGVHD uzrokovao teška oštećenja tkiva i infiltraciju leukocita. hAMSCs, kao što je pokazao H&E, oslabio je poremećaj tkiva i infiltraciju egzogenih T ćelija u aGVHD ciljnim organima (slika 2E). Dosljedno, rezultati IHC-a su također potvrdili da hAMSC poboljšavaju abnormalne patološke manifestacije (slika 2F). Ovi rezultati sugeriraju da hAMSC imaju potencijal da poboljšaju simptome aGVHD kod aGVHD miševa.
hAMSC su utjecali na imunitet domaćina kod aGVHD miševa
Da bismo razumjeli temeljne imunomodulatorne mehanizme pomoću kojih hAMSC smanjuju aGVHD, izmjerili smo aktivaciju i ekspanziju T stanica u perifernoj krvi i ciljnim organima. Test protočne citometrije otkrio je da hAMSC značajno inhibiraju broj CD3+CD4+T i CD3+CD8+T ćelija u krvi i ciljnim organima (slika 3A, B). Štaviše, udio CD4+CD25+Foxp3+Tregova u krvi i ciljnim organima miševa u grupi hAMSCs bio je značajno veći od onog u aGVHD grupi (slika 3C) . Zatim smo istraživali uticaj hAMSC-a na profil citokina (slika 4). primjena hAMSC-a rezultirala je evidentnim smanjenjem nivoa IL-17A, IFN-, TNF, IL-6 i IL-2 u ciljnim organima i krvi u poređenju sa onima iz grupe aGVHD, osim nivoa TNF-a u slezeni. U međuvremenu, pored nivoa IL-10 u jetri, miševi koji su tretirani hAMSCs su pokazali značajno povećane nivoe IL-10 i IL-4 u ciljnim organima i krvi. Uzeti zajedno, hAMSC su igrali zaštitnu ulogu u aGVHD tako što su preokrenuli imunološku neravnotežu podskupina T ćelija i citokinske oluje.
Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem
Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity
【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
hAMSCs poboljšao oštećenje crijevne barijere kod aGVHD miševa
Da bismo istražili mogu li hAMSC popraviti crijevnu barijeru kod aGVHD, prvo smo primijetili da li hAMSC mogu migrirati u crijeva. Kao što je prikazano na slici 5A, GFP-obilježeni hAMSC su otkriveni u crijevima nakon injekcije u hAMSC i mogli su se usaditi i infiltrirati u crijevima. Zatim smo osmislili histopatološki pregled tkiva tankog crijeva. U grupi aGVHD, crijevo je bilo erodirano i nekrotizirano, crijevne resice su očigledno uništene, resice su slomljene i masivni leukociti infiltrirali su crijevnu sluznicu, submukozu i lamina propria. Intestinalne resice su bile redovno raspoređene i nije bilo loma crevnih resica ili odvajanja epitela vilusa nakon tretmana hAMSC (slika 5B). Infiltracija humanih limfocita je takođe uočena imunohistohemijskim ispitivanjem u crevima u grupi aGVHD, dok je tretman hAMSCs mogao da smanji njihovu infiltraciju (slika 5C). Da bismo procijenili zaštitni efekat hAMSC-a na integritet crijevne sluzokože, uradili smo imunohistohemiju kako bismo otkrili učinak na ZO-1. U grupi koja je primala hAMSCs, nivo ekspresije proteina čvrstog spoja ZO-1 je značajno povećan u poređenju sa grupom aGVHD (slika 5D). Također smo ispitali nivoe ekspresije mRNA intestinalnih proteina čvrstog spoja (TJs) i nivoe D-mliječne kiseline (D-LA) i diamin oksidaze (DAO) u plazmi kako bismo odredili funkciju crijevne barijere i crijevnu permeabilnost. Kada se daju intravenozno, hMASC mogu značajno povećati nivoe ekspresije mRNA ZO-1 i Occludina, ključnih proteina TJs (Slika 5E, F), dok smanjuju nivoe D-LA i DAO (Slika 5G, H). Dakle, kada se pojavio aGVHD, crijevna barijera je oštećena smanjenjem crijevnih proteina tesnih spojeva i povećanjem crijevne permeabilnosti. U međuvremenu, hAMCS bi mogli značajno preokrenuti poremećaj crijevne barijere.
Slika 1 Fenotipska i funkcionalna karakterizacija hAMSC-a. (A) Reprezentativne mikrografije hAMSC-a od pasusa 0 do 3 (bez bojenja, 100×). (B) Sposobnost višelinijske diferencijacije hAM SC-a. Adipogena diferencijacija hAMSC-a (lijevo) obojena je Oil Red-O, a osteoblastična diferencijacija hAMSC-a (desno) obojena je Alizarin crvenom (bojenje, 100×). (C) Analiza protočne citometrije koja pokazuje da su hAMSC pozitivni na CD90, CD105 i CD73 dok su negativni na CD34, CD45, CD11b i HLA-DR
Slika 2 hAMSC su ublažili aGVHD kod NPG miševa. (A) Šematski dijagram koji ilustrira raspored primjene hAMSC u aGVHD modelima miša. (B) Promjene tjelesne težine u različitim grupama (n=10). (C) aGVHD klinički skor (zasnovano na gubitku težine, pogrbljenom držanju, narušenom krznu, lezijama kože, smanjenoj pokretljivosti i dijareji) u različitim grupama (n=10). (D) Opstanak među različitim grupama (n=10). (E) Reprezentativne mikroskopske slike H&E bojenja (400×) i histološki rezultat (na osnovu destrukcije strukture tkiva i infltracije limfocita) (n=4). (F) Reprezentativne mikroskopske slike imunohistohemije (400×) i udio CD45 pozitivnog područja (n=4). Vrijednosti su predstavljene kao srednja vrijednost±SD
Slika 3 hAMSCs inhibirao je ekspanziju T ćelija donora dok je pojačao stvaranje ili ekspanziju Tregs in vivo. (A) Analiza protočne citometrije CD3+CD4+T ćelija (n=6), (B) Analiza protočne citometrije CD3+CD8+ T ćelije (n=6), (C) Analiza protočne citometrije CD4+CD25+Foxp3+Tregova (n=6). Vrijednosti su predstavljene kao srednja vrijednost±SD
Slika 4 hAMSCs snižavaju regulaciju proinflamatornih citokina IL-17A, IFN-, TNF, IL-6, IL-2 i pojačano reguliraju protuupalne citokine IL-10 i IL -4 in vivo (n=5). Vrijednosti su predstavljene kao srednja vrijednost±SD
Promjene crijevne mikrobiote nakon tretmana hAMSC kod aGVHD miševa
Sekvenciranje 16S rRNA je izvedeno u DNK fekalnih bakterija izoliranih iz različitih grupa miševa. Indeksi -diverziteta, uključujući OUT, Chao1 i Shannon indekse, ispoljili su slične tendencije, a miševi koji su tretirani hAMSC su imali mikrobiotu sa značajno većom -diverzitetom u odnosu na grupu aGVHD (slika 6A). Analiza glavnih koordinata (PCoA) zasnovana na Un weighted-unifrac distance, Manhattan distance i Bray-Curtis metričke udaljenosti, dala je dispergirane tačke podataka na dijagramima dvije grupe, uprkos tome što razlika nije bila značajna (slika 6B). Nakon toga, procijenili smo krajolik crijevne mikrobiote kako bismo dalje istražili potencijalnu razliku u sastavu između dvije grupe. Izračunato je ukupno 773 OTU-a, a grupa hAMSCs imala je veće OTU u poređenju sa grupom aGVHD (slika 6C). U pogledu bakterijskog sastava na nivou filuma, Firmicutes i Bacteroidetes su bili dva najprevladavajuća tipa (slika 6D). Također smo organizirali uporednu toplotnu mapu za analizu crijevne mikrobiote između dvije grupe (slika 6E). Rod Odoribacter i Ruminococcus_1 pokazao je relativno visoku zastupljenost u grupi hAMSC, koji su važni mikrobi za održavanje crijevne homeostaze (slika 6F, G). Da bismo potvrdili koja je bakterija promijenjena liječenjem hAMSC-om i zauzvrat utječe na progresiju bolesti protiv aGVHD-a, izvršili smo poređenja visokodimenzionalnih klasa koristeći linearnu diskriminantnu analizu (LDA) veličine efekta (LEfSe) koja je otkrila značajne razlike u prevlasti bakterijskih zajednica između dvije grupe. Kao što je prikazano na (Slika 6H, I), Streptococcaceae (porodica i rod Streptococcus), Paludibacteraceae, F0058 i Delftia bile su ključne vrste bakterija koje doprinose disbiozi crijevne mikrobiote u aGVHD grupi. Ipak, korisne bakterije Lachnospiraceae, Roseburia, Ruminococcaceae, Ruminiclostridium, Oscillibacter i Clostridia (klasa i red Clostridiales) pokazale su relativno obogaćivanje grupe hAMSC, što bi moglo biti povezano sa ublažavanjem aGVHD-a posredovanog hAMSC-ima. Zajedno, raznovrsnost i sastav crijevne mikrobiote poboljšani su nakon primjene hAMSC-a i kretali se u ukupnom trendu koji je bio koristan za tijelo.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
hAMSC su regulirali interakcije između crijevne mikrobiote i crijevnog imuniteta
Da bi se razumjela potencijalna povezanost između crijevne mikrobiote i crijevne mukozne barijere, korelacije između TJ i crijevne mikrobiote na nivou roda analizirane su Spearmanovom korelacijskom analizom. Kao što je prikazano na slici 7, postojala je pozitivna veza između ZO-1 i korisnih bakterija, Ruminococcaceae_UCG.014, Muribaculum, Ruminococcus_1 i Ruminiclostridium_9. Relativna brojnost korisnih bakterija, Roseburia, Odoribacter, Ruminococcus_1, i Ruminococcaceae_UCG.014, pokazala je dramatičnu pozitivnu korelaciju sa Occludinom. Zatim smo sproveli analizu korelacije između crijevne mikrobiote i crijevne imunološke barijere Spearmanovom metodom korelacije ranga (slika 7). Primijetili smo da je povećanje Roseburia, Muribaculuma i Ruminococcus _1 negativno korelirano sa procentom CD{11}}CD4+T ćelija. Dodatno, povećanje korisnih bakterija, Ruminococcus_1 i Ruminiclostridium _9, pozitivno je koreliralo sa procentom Treg-ova, dok je negativno korelirano sa IL-17. Brojnost Lactobacillusa i Candidatus_Arthromitusa bila je u negativnoj korelaciji sa IFN-. Postojala je negativna korelacija između obilja Muribaculuma i IL-2. Povećanje brojnosti Candidatus{19}}Saccharimonas i smanjenje Escherichia. Brojnost šigela bila je u pozitivnoj korelaciji sa nivoom IL-10 (slika 7). Rezultati korelacijske analize su pokazali da hAMSC poboljšavaju inflamatorno okruženje domaćina i reguliraju crijevnu homeostazu koja može biti povezana s modulacijom crijevne mikrobiote, te posljedično sprečava aGVHD.
Slika 5 hAMSCs je poboljšao disfunkciju crijevne barijere kod aGVHD miševa. (A) GFP-obilježeni hAMSC infiltrirani u crijeva. (B) Reprezentativne mikroskopske slike H&E bojenja crijeva (400×) i histološki rezultat (na osnovu destrukcije strukture tkiva i infiltracije limfocita) (n=4). (C) Reprezentativne mikroskopske slike imunohistohemije (400×) crijeva i proporcija CD45 pozitivnog područja (n=4). (D) Reprezentativne mikroskopske slike imunohistohemije (400×) crijeva i proporcije ZO-1 pozitivne površine (n=4). (E) nivoi ekspresije mRNA ZO-1 i okludina (n=3). (F) Nivoi D-LA i DAO u plazmi (n=4).Vrijednosti su predstavljene kao srednja vrijednost±SD
Diskusija
Napredna mikrobna analiza pružila je novi uvid u složene interakcije između domaćina i crijevne mikrobiote [18]. Mikrobiota crijeva mogla bi biti izmijenjena nakon alo-HSCT i usko je povezana s aGVHD, što sugerira da bi crijevna mikrobiota mogla biti nova meta za liječenje aGVHD [5]. Brojne studije, uključujući našu nedavnu studiju, istražile su i potvrdile terapeutski učinak MSC-a na aGVHD [15, 19, 20]. Međutim, efekat na mikrobiotu crijeva tokom ovog perioda ostaje nejasan. U ovoj studiji smo istraživali uticaj hAMSC-a na aGVHD i potencijalne mehanizme u njemu in vivo. U skladu s prethodnim studijama [15, 21–23], naši rezultati su pokazali da hAMSC imaju povoljan zaštitni učinak na aGVHD kod miševa, što je dokazano oslabljenim simptomima aGVHD i produženim preživljavanjem. Takođe smo pokazali da hAMSC pokazuju imunosupresivni efekat kroz smanjenje ekspanzije T ćelija donora, dok istovremeno povećavaju generisanje Tregs kod aGVHD. U međuvremenu, hAMSC bi mogli smanjiti proinflamatorne citokine i pojačati protuupalne citokine in vivo, kako bi inhibirali upalne odgovore. Intestinalna barijera, gusta struktura sastavljena od monosloja crijevnih epitelnih stanica, održava svoj integritet i sprječava translokaciju luminalne mikrobiote u zdravo stanje [24]. Tokom alo-HSCT-a, režimi kondicioniranja oštećuju crijevnu barijeru, što je početni korak u razvoju aGVHD, jer dozvoljava translokaciju bakterija preko barijere i dovodi do narušavanja crijevne imunološke homeostaze [24, 25]. Akumulirani dokazi pokazuju da MSC posjeduju sposobnost popravke tkiva, za koju je dokazano da popravlja integritet crijevne barijere kod miševa s kolitisom [26]. Proteini čvrstog spoja, uključujući ZO-1 i Occludin, imaju bitnu ulogu u funkciji crijevne barijere i translokacija crijevne mikrobiote preko oštećene crijevne barijere izaziva upalu [27]. D-LA se izvodi iz crijevnih bakterija, a DAO se uglavnom koncentrira u crijevnoj sluznici. Stoga, visoke koncentracije D-LA i DAO u plazmi mogu djelomično odražavati promjene u crijevnoj permeabilnosti i funkciji crijevne barijere [28]. Trenutno smo otkrili da su se nivoi ekspresije TJ-a dramatično povećali nakon primjene hAMSC-a, dok su se nivoi D-LA i DAO u plazmi značajno smanjili, što ukazuje da hAMSC-i mogu poboljšati disfunkciju crijevne barijere i obnoviti crijevnu propusnost. Crijeva su jedan od organa koji su najteže pogođeni aGVHD-om, a istraživanja su istakla da bakterija, posebno crijevna mikrobiota, igra centralnu ulogu u patogenezi i razvoju aGVHD-a [5, 6]. Kao što je objavljeno u prethodnim studijama, gubitak bakterijske raznolikosti pacijenata sa alo HSCT bio je povezan sa povećanom smrtnošću od aGVHD [29, 30]. Fekalna dominacija oportunističkih patogena Enterococcus i Proteobacteria također je povezana s povećanom GVHD [6, 31]. Posljednjih desetljeća povećana je pažnja posvećena korelaciji između crijevne mikrobiote i liječenja MSC kod upalnih bolesti. Dokazano je da MSC poboljšavaju disbiozu crijevne mikrobiote kod reumatoidnog artritisa, sepse i inflamatorne bolesti crijeva [32-34]. Kako bismo dalje istražili mehanizam kojim hAMSC poboljšavaju aGVHD, istražili smo utjecaj hAMSC-a na crijevnu mikrobiotu. U trenutnoj studiji, primjena hAMSC-a pokazala je značajan učinak na -raznovrsnost mikrobnih zajednica u poređenju sa bez transplantacije, što ukazuje da bi se obilje crijevne mikrobiote moglo promijeniti nakon tretmana hAMSC-ima. Međutim, nije bilo značajne razlike u mjerenjima diverziteta, vjerovatno zbog male veličine uzorka obje grupe ili nedovoljnog ciklusa liječenja hAMSC-a. Analiza korištenjem uporedne toplotne karte u nivoima roda pokazala je da je primjena hAMSC-a povećala obilje korisnih bakterija, Odoribacter i Ruminococcus_1 u crijevnoj flori, koji su proizvođači kratkolančanih masnih kiselina (SCFA) s protuupalnim svojstvima [35 , 36]. Kako bi se identificirale osnovne dominantne bakterije posredovane transplantacijom hAMSC, LEfSe analiza je provedena između dvije grupe. U poređenju sa grupom aGVHD, tretman hAMSC-om značajno je povećao obilje nekih korisnih mikroba povezanih s protuupalnim efektima, kao što su Lachnospiraceae, Roseburia, Ruminococcaceae, Ruminiclostridium, Oscillibacter, Clostridia, za koje je sve opisano da su korisni za proizvodnju SC metabolita. 37–42]. Stoga su naša zapažanja pokazala da je nakon primjene hAMSC-a došlo do poboljšanja disbioze crijevne mikrobiote, što se manifestira poboljšanom raznovrsnošću i povećanim relativnim obiljem korisnih bakterija.
Slika 6 Alternacije crijevne mikrobiote kod aGVHD miševa. (A) poređenje -različitosti. (B) poređenje -različitosti. (C) Venov dijagram OTU-a. (D) Relativna brojnost bakterija na nivou vrste. (E) Toplotna karta brojnosti vrsta na nivou roda. (F) Relativna brojnost Odoribacter na nivou roda. (G) Relativna brojnost Ruminokoka_1 na nivou roda. (H) Kladogram zasnovan na LEfSe analizi. (I) LDA skor izračunat iz karakteristika različito zastupljenih između aGVHD i hAMSC grupa. (AI) n=3 miševa po grupi. Vrijednosti su predstavljene kao srednja vrijednost±SD
aGVHD je složen upalni proces koji je iniciran razaranjem integriteta crijevne barijere nakon čega slijedi translokacija crijevne mikrobiote i njenih komponenti. Prepoznavanje molekularnih obrazaca povezanih s oštećenjem i molekularnih obrazaca povezanih s patogenom od strane stanica koje predstavljaju antigen inducira pro-upalni odgovor uključujući aktivaciju T stanica i citokinske oluje kako bi se pogoršalo oštećenje crijevne barijere i promovirao razvoj aGVHD [24, 43]. S druge strane, mikrobiota crijeva i metaboliti dobiveni iz mikrobiote, kao što su SCFA, igraju važnu ulogu u održavanju integriteta crijevne barijere i crijevne homeostaze, kao i u oblikovanju imunološkog sistema sluznice i balansiranju odbrane domaćina s mikrobnim komponentama i metabolitima [24, 44] . Interkomunikacija između domaćina i crijevne mikrobiote na crijevnoj barijeri reguliše mukozne i sistemske imune odgovore i, u patološkim stanjima, može rezultirati GVHD [6, 45, 46]. Sugerira da je crijevna mikrobiota usko povezana s ekspresijom proteina čvrstog spoja [47]. Ova studija je pokazala da je ekspresija mRNA TJs ZO-1 i Occludina bila u negativnoj korelaciji s relativnom brojnošću štetnih bakterija, dok je imala pozitivnu korelaciju s korisnim bakterijama, što ukazuje da je mikrobiota crijeva važna za održavanje integriteta crijevnu barijeru. Osim toga, crijevna mikrobiota je također vrlo važna u održavanju crijevne imunološke barijere [47]. Primijetili smo da su neke od korisnih bakterija u negativnoj korelaciji sa procentom CD{15}CD4+T ćelija, ali u pozitivnoj korelaciji sa procentom Treg-ova. Ovdje smo otkrili da su korisne bakterije, uglavnom proizvođači SCFA, u negativnoj korelaciji s proinflamatornim citokinima, ali u pozitivnoj korelaciji s protuupalnim citokinima, dok su štetne bakterije u obrnutoj korelaciji. Ukratko, značajna razlika u mikrobioti crijeva između tretmana sugerira potpunu sliku interakcije između crijevne mikrobiote i crijevne barijere, imuniteta. Još uvijek je bilo nekoliko ograničenja o kojima vrijedi razgovarati u našim eksperimentima. Prvo, iako je naša studija istraživala efekte hAMSC-a na imunitet, crijevnu barijeru i crijevnu mikrobiotu kod aGVHD-a, osnovni mehanizam još uvijek treba provjeriti u daljnjoj studiji. Drugo, iscrpljivanje crijevne mikrobiote i transplantacija fekalne mikrobiote potrebni su kako bi se riješile uzročne korelacije između crijevne mikrobiote, crijevne barijere i imuniteta. Treće, opravdana su daljnja istraživanja koja istražuju utjecaj hAMSC-a na SCFA-e izvedene iz mikrobiote i druge metabolite. Zaključno, naše istraživanje sugerira da hAMSCs ublažavaju aGVHD promicanjem normalizacije crijevne mikrobiote i regulacijom interakcije između crijevne mikrobiote i crijevne barijere, imuniteta. Naša studija je prva koja je sistematski definirala efekte i osnovne mehanizme hAMSC-a koji regulišu crijevnu mikrobiotu i crijevni imunitet kod aGVHD-a.
Slika 7 Analiza korelacije između crijevne mikrobiote i crijevnog imuniteta. Spearmanova korelaciona analiza provedena je između relativne količine 15 različitih crijevnih mikrobiota (na nivou roda) i nivoa ekspresije mRNA TJs, procenta imunih ćelija kao i koncentracije citokina u crijevima među dvije grupe. Spearman r vrijednosti se kreću od -0.5 (plavo) do 0.5 (crveno)
Reference
1. Schmid, C. (2021). Korak bliže GVL-u bez GVHD-a. Blood, 137(19), 2565–2566. https://doi.org/10.1182/blood.2020010132
2. Chang, Y., Zhao, X., & Huang, X. (2018). Strategije za poboljšanje i očuvanje efekata protiv leukemije bez pogoršanja bolesti transplantata protiv domaćina. Frontiers in Immunology, 9, 3041. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.03041
3. Zhu, W., Winter, MG, Byndloss, MX, Spiga, L., Duerkop, BA, Hughes, ER, Büttner, L., de Lima Romão, E., Behrendt, CL, Lopez, CA, Sifuentes- Dominguez, L., Huf-Hardy, K., Wilson, RP, Gillis, CC, Tükel, Ç., Koh, AY, Burstein, E., Hooper, LV, Bäumler, AJ, & Winter, SE (2018). Precizno uređivanje crijevne mikrobiote ublažava kolitis. Nature, 553(7687), 208–211. https://doi.org/10.1038/nature25172
4. Zhao, L., Zhang, F., Ding, X., Wu, G., Lam, YY, Wang, X., Fu, H., Xue, X., Lu, C., Ma, J. , Yu, L., Xu, C., Ren, Z., Xu, Y., Xu, S., Shen, H., Zhu, X., Shi, Y., Shen, Q., … Zhang, C (2018). Crijevne bakterije selektivno promovirane dijetalnim vlaknima ublažavaju dijabetes tipa 2. Science (New York, NY), 359 (6380), 1151–1156. https:// doi.org/10.1126/science.aao5774
5. Shono, Y., & van den Brink, MRM (2018). Povreda crijevne mikrobiote u alogenoj transplantaciji hematopoetskih matičnih stanica. Recenzije o prirodi. Cancer, 18(5), 283–295. https://doi.org/10.1038/nrc.2018.10
6. Stafas, A., Burgos da Silva, M., i van den Brink, MRM (2017). Intestinalna mikrobiota u alogenoj transplantaciji hematopoetskih ćelija i bolesti presatka protiv domaćina. Blood, 129(8), 927–933. https://doi.org/10.1182/blood-2016-09-691394
7. Wu, K., Yuan, Y., Yu, H., Dai, X., Wang, S., Sun, Z., Wang, F., Fei, H., Lin, Q., Jiang, H ., & Chen, T. (2020). Metabolit crijevnih mikroba trimetilamin N-oksid pogoršava GVHD indukujući polarizaciju M1 makrofaga kod miševa. Blood, 136(4), 501–515. https://doi.org/10.1182/blood.2019003990
8. Mathewson, ND, Jenq, R., Mathew, AV, Koenigsknecht, M., Hanash, A., Toubai, T., Oravecz-Wilson, K., Wu, S., Sun, Y., Rossi, C ., Fujiwara, H., Byun, J., Shono, Y., Lindemans, C., Calafore, M., Schmidt, TM, Honda, K., Young, VB, Pennathur, S., … Reddy, P. (2016). Metaboliti dobiveni iz crijevnog mikrobioma moduliraju oštećenje epitelnih stanica crijeva i ublažavaju bolest transplantata protiv domaćina. Nature Immunology, 17(5), 505–513. https://doi.org/10.1038/ni.3400
9. Dave, JR, Chandekar, SS, Behera, S., Desai, KU, Salve, PM, Sapkal, NB, Mhaske, ST, Dewle, AM, Pokare, PS, Page, M., Jog, A., Chivte , PA, Srivastava, RK, & Tomar, GB (2022). Ljudske mezenhimalne matične ćelije gingive zadržavaju svoj rast i imunomodulatorne karakteristike neovisno o dobi donora. Science Advances, 8(25), m6504. https://doi.org/10. 1126/sciadv.abm6504
10. Zhao, K., & Liu, Q. (2016). Klinička primjena mezenhimskih stromalnih stanica u transplantaciji hematopoetskih matičnih stanica. Journal of Hematology & Oncology, 9(1), 46. https://doi.org/ 10.1186/s13045-016-0276-z
11. Liu, Q., Huang, Q., Wu, H., Zuo, G., Gu, H., Deng, K., & Xin, H. (2021). Karakteristike i terapeutski potencijal matičnih ćelija ljudskih amniona. International Journal of Molecular Sciences, 22(2), 970. https://doi.org/10.3390/ijms22020970
12. Li, J., Zhou, Z., Wen, J., Jiang, F., & Xia, Y. (2020). Ljudske amnionske mezenhimske matične ćelije potiču endogenu regeneraciju kostiju. Frontiers in Endocrinology, 11, 543623. https://doi.org/10.3389/fendo.2020.543623
13. Díaz-Prado, S., Muiños-López, E., Hermida-Gomez, T., Cicione, C., Rendal-Vázquez, ME, Fuentes-Boquete, I., de Toro, FJ, Blanco, FJ ( 2011). Ljudska amnionska membrana kao alternativni izvor matičnih ćelija za regenerativnu medicinu. diferencijacija; Istraživanje biološke raznolikosti, 81(3), 162–171. https:// doi.org/10.1016/j.dif.2011.01.005
14. Hong, J., Gao, Y., Song, J., Zhuo, W., Sun, H., & Ping, B. (2016). Usporedba bioloških karakteristika i imunosupresivne aktivnosti između ljudskih amnionskih mezenhimalnih matičnih stanica i mezenhimalnih matičnih stanica ljudske koštane srži. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 24(3), 858–864. https:// doi.org/10.7534/j.issn.1009-2137.2016.03.041
15. Gao, Y., Li, W., Bu, X., Xu, Y., Cai, S., Zhong, J., Du, M., Sun, H., Huang, L., He, Y ., Hu, X., Liu, Q., Jin, H., Wang, Q., & Ping, B. (2021). Ljudske amnionske mezenhimalne matične ćelije inhibiraju aGVHD regulacijom ravnoteže Treg i T efector ćelija. Journal of Inflammation Research, 14, 3985–3999. https://doi.org/10.2147/ JIR.S323054
16. Cooke, KR, Kobzik, L., Martin, TR, Brewer, J., Delmonte, JJ, Crawford, JM, & Ferrara, JL (1996). Eksperimentalni model sindroma idiopatske pneumonije nakon transplantacije koštane srži: I. Uloge minornih H antigena i endotoksina. Blood, 88(8), 3230–3239.
17. Yañez, R., Lamana, ML, García-Castro, J., Colmenero, I., Ramírez, M., & Bueren, JA (2006). Mezenhimske matične ćelije dobijene iz masnog tkiva imaju in vivo imunosupresivna svojstva primenljiva za kontrolu bolesti transplantata protiv domaćina. Matične ćelije (Dejton, Ohajo), 24(11), 2582–2591.
18 Hooper, LV, Littman, DR, i Macpherson, AJ (2012). Interakcije između mikrobiote i imunog sistema. Science (New York, NY), 336(6086), 1268–1273. https://doi.org/10.1126/ science.1223490
19. Kelly, K., & Raško, JEJ (2021). Mezenhimalne stromalne stanice za liječenje bolesti presatka protiv domaćina. Frontiers in Immunology, 12, 761616. https://doi.org/10.3389/fmmu.2021.761616
20. Macías-Sánchez, MDM, Morata-Tarifa, C., Cuende, N., Cardesa-Gil, A., Cuesta-Casas, M. Á., Pascual-Cascon, MJ, Pascual, A., Martín-Calvo , C., Jurado, M., Perez-Simón, JA, Espigado, I., Garzón López, S., Carmona Sánchez, G., Mata-Alcázar-Caballero, R., & Sánchez-Pernaute, R. (2022. ). Mezenhimalne stromalne stanice za liječenje akutne i kronične bolesti transplantata protiv domaćina otporne na steroide: iskustvo višecentrične saosećajne upotrebe. Translaciona medicina matičnih ćelija, 11(4), 343–355. https://doi.org/10.1093/stcltm/szac003
21. Tago, Y., Kobayashi, C., Ogura, M., Wada, J., Yamaguchi, S., Yamaguchi, T., Hayashi, M., Nakaishi, T., Kubo, H., & Ueda, Y. (2021). Mezenhimske matične ćelije koje potiču iz ljudskog amniona ublažavaju ksenogenu bolest transplantata protiv domaćina sprečavanjem aktivacije i proliferacije T ćelija. Scientifc Reports, 11(1), 2406. https://doi. org/10.1038/s41598-021-81916-y
22. Yamahara, K., Harada, K., Ohshima, M., Ishikane, S., Ohnishi, S., Tsuda, H., Otani, K., Taguchi, A., Soma, T., Ogawa, H. ., Katsuragi, S., Yoshimatsu, J., Harada-Shiba, M., Kangawa, K., & Ikeda, T. (2014). Poređenje angiogenih, citoprotektivnih i imunosupresivnih svojstava mezenhimskih matičnih ćelija ljudskih amniona i horiona. PLoS One, 9(2), e88319. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0088319
23. Yamahara, K., Hamada, A., Soma, T., Okamoto, R., Okada, M., Yoshihara, S., Yoshihara, K., Ikegame, K., Tamaki, H., Kaida, K ., Inoue, T., Ohsugi, Y., Nishikawa, H., Hayashi, H., Ito, YM, Iijima, H., Ohnishi, S., Hashimoto, D., Isoe, T., … Fujimori, Y (2019). Sigurnost i efikasnost mezenhimskih matičnih ćelija izvedenih iz amniona (AM01) kod pacijenata sa akutnom bolešću graft-versus-host otpornom na steroide nakon alogene transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija: protokol studije za fazu I/II japansko ispitivanje. BMJ Open, 9(7), e26403. https://doi.org/10.1136/bmjop en-2018-026403
24. Lin, D., Hu, B., Li, P., Zhao, Y., Xu, Y., & Wu, D. (2021). Uloga crijevne mikrobiote i mikrobnih metabolita u akutnoj GVHD. Eksperimentalna hematologija i onkologija, 10(1), 49. https://doi.org/10.1186/s40164-021-00240-3
25. Ghimire, S., Weber, D., Mavin, E., Wang, XN, Dickinson, AM, & Holler, E. (2017). Patofiziologija GvHD i drugih velikih komplikacija povezanih s HSCT. Frontiers in Immunology, 8, 79. https://doi.org/10.3389/fmmu.2017.00079
26. Xu, J., Wang, X., Chen, J., Chen, S., Li, Z., Liu, H., Bai, Y., & Zhi, F. (2020). Mezenhimske matične ćelije izvedene iz embrionalnih matičnih ćelija promovišu integritet epitela debelog crijeva i regeneraciju podizanjem cirkulirajućeg IGF-1 kod miševa s kolitisom. Theranostics, 10(26), 12204–12222. https://doi.org/10.7150/thno.47683
27. Zhao, Y., Huang, J., Li, T., Zhang, S., Wen, C., & Wang, L. (2022). Berberin poboljšava aGVHD remodeliranjem crijevne mikrobiote, supresijom TLR4 signala i popravkom barijere debelog crijeva za inhibiciju NLRP3 inflamasoma. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 26(4), 1060–1070. https://doi.org/10. 1111/jcmm.17158
28. Yuan, M., Lin, L., Cao, H., Zheng, W., Wu, L., Zuo, H., Tian, X., & Song, H. (2022). Intestinalna mikrobiota učestvuje u zaštitnom efektu HO-1/BMMSC na transplantaciju jetre sa steatotičnim transplantacijama jetre kod pacova. Frontiers in Microbiology, 13, 905567. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.905567
29. Taur, Y., Jenq, RR, Perales, M., Littmann, ER, Morjaria, S., Ling, L., No, D., Gobourne, A., Viale, A., Dahi, PB, Ponce , DM, Barker, JN, Giralt, S., van den Brink, M., & Pamer, EG (2014). Učinci bakterijske raznolikosti crijevnog trakta na smrtnost nakon alogenske transplantacije hematopoetskih matičnih stanica. Blood, 124(7), 1174–1182. https://doi.org/10.1182/ krv-2014-02-554725
30. Jenq, RR, Taur, Y., Devlin, SM, Ponce, DM, Goldberg, JD, Ahr, KF, Littmann, ER, Ling, L., Gobourne, AC, Miller, LC, Docampo, MD, Peled, JU, Arpaia, N., Cross, JR, Peets, TK, Lumish, MA, Shono, Y., Dudakov, JA, Poeck, H., … van den Brink, MRM (2015). Intestinalna Blautia je povezana sa smanjenom smrtnošću od bolesti transplantata protiv domaćina. Biologija transplantacije krvi i srži: časopis Američkog društva za transplantaciju krvi i srži, 21(8), 1373–1383. https://doi.org/10.1016/j.bbmt.2015.04.016
31. Le Bastard, Q., Chevallier, P., & Montassier, E. (2021). Mikrobiom crijeva u alogenskoj transplantaciji hematopoetskih matičnih stanica i specifične promjene povezane s akutnom bolešću presatka protiv domaćina. World Journal of Gastroenterology, 27(45), 7792–7800. https:// doi.org/10.3748/wjg.v27.i45.7792
32. Li, X., Lu, C., Fan, D., Lu, X., Xia, Y., Zhao, H., Xu, H., Zhu, Y., Li, J., Liu, H ., & Xiao, C. (2020). Ljudske pupčane mezenhimske matične ćelije pokazuju terapeutski potencijal kod reumatoidnog artritisa regulacijom interakcije između imuniteta i crijevne mikrobiote preko aril-ugljikovodičnih receptora. Granice u ćelijskoj i razvojnoj biologiji, 8, 131. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00131
33. Sun, J., Ding, X., Liu, S., Duan, X., Liang, H., & Sun, T. (2020). Mezenhimske matične ćelije izvedene iz masnoće ublažavaju akutnu ozljedu pluća i poboljšavaju mikrobiotu crijeva kod septičkih pacova. Istraživanje i terapija matičnih ćelija, 11(1), 384. https://doi.org/10.1186/ s13287-020-01902-5
34. Soontararak, S., Chow, L., Johnson, V., Coy, J., Wheat, W., Regan, D., & Dow, S. (2018). Mezenhimalne matične ćelije (MSC) izvedene iz induciranih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC) ekvivalentnih MSC-u izvedenim iz masnoće u promicanju zacjeljivanja crijeva i normalizacije mikrobioma u modelu upalne bolesti crijeva kod miša. Translaciona medicina matičnih ćelija, 7(6), 456–467. https://doi.org/ 10.1002/sctm.17-0305
35. Li, J., Zou, C., & Liu, Y. (2022). Poboljšanje alergije na hranu izazvanu ovalbuminom kod miševa ciljanom rektalnim i koloničnim unosom cijanidin-3-O-glukozida. Foods (Basel, Switzerland), 11(11), 1542. https://doi.org/10.3390/foods11111542
36. Maruyama, S., Matsuoka, T., Hosomi, K., Park, J., Nishimura, M., Murakami, H., Konishi, K., Miyachi, M., Kawashima, H., Mizuguchi, K ., Kobayashi, T., Ooka, T., Yamagata, Z., & Kunisawa, J. (2022). Klasifikacija pojave dislipidemije na osnovu crijevnih bakterija povezanih s unosom ječma. Frontiers in Nutrition, 9, 812469. https://doi.org/10.3389/fnut.2022.812469
37. Lee, SH, Park, H., Kang, CD, Choi, DH, Park, SC, Park, JM, Nam, S., Chae, GB, Lee, KY, Cho, H., & Lee, SJ ( 2022). Intramuskularni dodatak vitamina D3 u visokim dozama utječe na crijevnu mikrobiotu pacijenata s infekcijom clostridioides difcile. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 12, 904987. https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.904987
38. Meyer, RK, Lane, AI, Weninger, SN, Martinez, TM, Kangath, A., Laubitz, D., & Duca, FA (2022). Oligofruktoza obnavlja postprandijalni nivo kratkolančanih masnih kiselina tokom hranjenja sa visokim sadržajem masti. Gojaznost (Silver Spring, Md.), 30(7), 1442–1452. https://doi.org/ 10.1002/oby.23456
39. Sang, J, Zhuang, D, Zhang, T, Wu, Q, Yu, J, Zhang, Z (2022) Konvergentni i divergentni uzorci starosti raznolikosti mikrobiote crijeva kod ljudi i neljudskih primata. M-Systems: e151221. https:// doi.org/10.1128/msystems.01512-21
40. Ge, X., He, X., Liu, J., Zeng, F., Chen, L., Xu, W., Shao, R., Huang, Y., Farag, MA, Capanoglu, E. , El-Seedi, HR, Zhao, C., & Liu, B. (2022). Poboljšanje dijabetesa tipa 2 zahvaljujući novoj koordinaciji 6, 8-guanidil luteolin kinon-hroma putem biohemijskih mehanizama i interakcije crijevne mikrobiote. Journal of Advanced Research, S2090–1232(22), 121–129. https://doi.org/ 10.1016/j.jare.2022.06.003
41. Ding, Q., Cao, F., Lai, S., Zhuge, H., Chang, K., Valencak, TG, Liu, J., Li, S., & Ren, D. (2022). Lactobacillus plantarum ZY08 ublažava hroničnu alkoholom izazvanu steatozu jetre i ozljedu jetre kod miševa obnavljanjem homeostaze crijevnih fora. Food Research International (Ottawa, Ont.), 157, 111259. https://doi.org/10. 1016/j.foodres.2022.111259
42. Rees, NP, Shaheen, W., Quince, C., Tselepis, C., Horniblow, RD, Sharma, N., Beggs, AD, Iqbal, TH, i Quraishi, MN (2022). Sistematski pregled prediktivnih biomarkera donora i primaoca odgovora na transplantaciju fekalne mikrobiote kod pacijenata sa ulceroznim kolitisom. EBioMedicine, 81, 104088. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104088
43. Li, A., Abraham, C., Wang, Y., & Zhang, Y. (2020). Novi uvidi u osnovnu biologiju akutne bolesti presatka protiv domaćina. Haematologica, 105(11), 2540–2549. https://doi.org/10.3324/haematol. 2019.{12}}. Kayama, H., Okumura, R., & Takeda, K. (2020). Interakcija između mikrobiote, epitela i imunoloških stanica u crijevima. Godišnji pregled imunologije, 38, 23–48. https://doi.org/ 10.1146/Annu rev-immunol-070119-115104
45. Schluter, J., Peled, JU, Taylor, BP, Markey, KA, Smith, M., Taur, Y., Niehus, R., Stafas, A., Dai, A., Fontana, E., Amoretti , LA, Wright, RJ, Morjaria, S., Fenelus, M., Pessin, MS, Chao, NJ, Lew, M., Bohannon, L., Bush, A., … Xavier, JB (2020). Mikrobiota crijeva povezana je s dinamikom imunoloških stanica kod ljudi. Nature, 588(7837), 303–307. https://doi.org/10.1038/ s41586-020-2971-8
46. Yang, J, Yang, H, Li, Y (2022) Trostruke interakcije između crijevne mikrobiote, mikobiote i imuniteta domaćina. Kritički osvrti u nauci o hrani i nutricionizmu: 1–21. https://doi.org/10.1080/10408 398.2022.2094888
47. An, J., Liu, Y., Wang, Y., Fan, R., Hu, X., Zhang, F., Yang, J., & Chen, J. (2022). Uloga mukozne barijere crijeva u autoimunim bolestima: potencijalna meta. Frontiers in Immunology, 13, 871713. https://doi.org/10.3389/fmmu.2022.871713