Utjecaj prehrambenih huminskih supstanci na ćelijski imunitet i karakteristike krvi u prasadi

Abstract: Cilj ove studije bio je utvrditi utjecaj prehrambenih huminskih supstanci na imunološki odgovor i krvne profile prasadi. Ukupno 24 ukrštena prasad (Slovački bijeli × Landrace; stara 35 dana; prosječna tjelesna težina 11,67 kg) raspoređena su u dvije grupe ishrane sa (eksperimentalno; 5 g·kg−1 ) ili bez (kontrola; 0 g·kg−1 ) suplementacija prirodnih huminskih supstanci. U ovoj studiji uočili smo značajno povećanje udjela CD4+CD8- limfocita (p < {{0}}.001) u eksperimentalnoj grupi. Rezultati su također pokazali tendenciju povećanja fagocitne aktivnosti i kapaciteta zahvatanja fagocita i broja ostalih praćenih subpopulacija limfocita (CD3+, CD21+, CD4-D 8+, CD4+CD8+, CD4+CD25+) kod prasadi u eksperimentalnoj grupi u poređenju sa kontrolnom grupom. Suplementacija huminskih supstanci povećala je serumsku alkalnu fosfatazu u odnosu na kontrolnu grupu (p < 0,05). Dijeta nije značajno uticala na druge praćene parametre krvi. Zaključeno je da bi uključivanje humusnih tvari u ishranu prasadi moglo stimulativno djelovati na ćelijski imunitet, bez negativnog utjecaja na hematološke i biokemijske parametre.

Ključne riječi: humusne tvari; fagocitoza; limfocit; biohemija krvi; hematologija; prasadi

Prednosti suplemenata cistanche-kako ojačati imuni sistem

1. Uvod

Huminske tvari (HS) su klasa nenutritivnih prirodnih organskih bioaktivnih spojeva formiranih u tlu [1]. Važne su komponente humusa čija je primarna funkcija prijenos hranjivih tvari iz tla u žive organizme. HS posebno uključuje huminsku kiselinu, fulvičnu kiselinu i humin kao njihove glavne sastojke [2]. Ove komponente su neophodne za rast biljaka [3] i mogu promovirati efikasno korištenje hranjivih tvari od strane biljke [4]. Zbog zabrane upotrebe antibiotika kao promotora rasta u Europskoj uniji, povećan je interes za alternativne aditive stočnoj hrani za proizvodnju životinja [5]. U posljednje dvije decenije povećan je interes za korištenje HS u ishrani životinja [2,6]. Mnogi autori su tokom svojih istraživanja uočili poboljšanje proizvodnih parametara nakon dodavanja HS u hranu za životinje. Poslednjih godina pokazalo se da HS koji se dodaje hrani za monogastrične životinje kao što su svinje, živina i zečevi podstiče rast [7–10]. Nadalje, HS se koristi kao imunostimulirajuće, antidijarealno, analgetičko i antimikrobno sredstvo u veterinarskoj praksi [11-13]. Dodavanje biološki aktivnih dodataka humusne prirode ishrani životinja stimuliralo je metaboličke procese i svarljivost nutrijenata te aktiviralo apsorpciju nekih mineralnih elemenata [14]. Druge studije su otkrile da HS pomaže u smanjenju izlučivanja amonijaka iz stajnjaka i poboljšava relativni broj limfocita u krvi. Gore navedene modifikacije pomažu imunitetu životinja [2,8,15]. Međutim, zbog različitih izvora i tipova HS preparata, kao i činjenice da ne postoji jedinstven standard za merenje stvarnih HS efekata, njihov bio-efekat zavisi od specifikacije. Na osnovu naših prethodnih rezultata i iskustava iz studija peradi (brojleri i kokoši nesilice) o uticaju humusnih supstanci (u koncentracijama od 0,8% i 0,5%, respektivno) na imunološki status i imunološkog odgovora, odlučili smo provjeriti ovaj efekat kod prasadi. Uočili smo značajno povećanje aktivnosti fagocita i odgovora B ćelija, kao i značajno povećanje omjera CD4+:CD8+ limfocita [16,17]. Generalno, suplementacija kao dodatak hrani za svinje nije dobro prijavljena u poređenju sa živinom, a naučne studije o uticaju dodatka HS u ishrani svinja na imunitet i metabolizam su još uvek relativno ograničene. Stoga je ova studija, kao pilot ispitivanje, provedena kako bi se procijenio učinak dodatka 0,5% HS na imunološke indikatore, kao i biohemijske i hematološke varijable u krvi prasadi.

Prednosti suplemenata cistanche-kako ojačati imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Materijali i metode

2.1. Eksperimentalni dizajn

Eksperiment je izveden u skladu sa "Evropskom direktivom o zaštiti životinja koje se koriste u naučne svrhe" [18]. Životinje su bile smeštene u akreditovanim štalama Katedre za ishranu i stočarstvo na Univerzitetu veterinarske medicine u Košicama, Slovačka, pod potrebnim zoohigijenskim uslovima. Tokom eksperimenta prosječna temperatura u štali iznosila je 20,2 ± 1,5 ◦C, a relativna vlažnost 68,5 ± 4,8%. Ispitivanje je odobrila Etička komisija Univerziteta veterinarske medicine i farmacije u Košicama (protokol br. EKV/2022-11). Ukupno 24 ukrštana prasad (Slovački bijeli x Landrace) 35-dnevna prasad je podijeljena u dvije grupe (n=12; 50% mužjaka i 50% ženke u obje grupe). Prije početka eksperimenta zabilježena je početna prosječna tjelesna težina životinje (TW) od 11,68 ± 1,35 kg u kontrolnoj grupi i 11,65 ± 1,34 kg u eksperimentalnoj grupi. U istraživanje su bile uključene sljedeće eksperimentalne grupe: kontrolna grupa i eksperimentalna grupa, gdje je ishrana eksperimentalne grupe dopunjena dodatkom HS od 0,5%. Eksperiment je trajao 4 sedmice. U eksperimentu su korištene iste dijete za obje grupe (tabela 1). Uvođenje dodatka HS u ishranu realizovano je na račun ječma u eksperimentalnoj grupi. Svinje su hranjene dva puta dnevno potpunom krmnom smjesom. Voda za piće je životinjama bila dostupna ad libitum tokom eksperimentalnog perioda. Kompletne krmne smjese u eksperimentu formulirane su prema nutritivnim zahtjevima Šimeˇceka i sur. [19]. Prirodni HS dodatak prehrani (HUMAC® Natur AFM; Humac, doo, Košice, Slovačka) samljeven je i fizički pročišćen Leonarditom bez kemijske obrade. Kompletne krmne smjese analizirane su na suhu tvar, sirove proteine, sirova vlakna, ukupan pepeo, škrob i ukupni fosfor prema Uredbi EC Komisije 152/2009 [20]. Nivo kalcijuma i natrijuma u ishrani analiziran je plamenom metodom atomskog apsorpcionog spektrometra (Unicam Solar 939, Camberley, Surrey, UK). Metabolične energetske vrijednosti potpune krmne smjese izračunate su formulom prema Šimeček i sur. [19].

2.2. Uzorkovanje i mjerenja

U sedmici 4, ujutro posljednjeg dana eksperimenta, punkcijom orbitalnog sinusa uzeti su uzorci krvi od svih svinja pojedinačno u obje grupe za naknadnu analizu. Serum je dobijen centrifugiranjem (3000 rpm tokom 30 min) i čuvan na -20 ◦C do analize. Heparinizirana krv je korištena za određivanje hematoloških parametara, testiranje aktivnosti fagocita i identifikaciju subpopulacija limfocita.

Tabela 1. Formula i hemijski sastav krmnih smjesa za svinje (na bazi hrane).

2.2.1. Hematološki i serumski biohemijski parametri

Kompletna krvna slika je urađena automatskim hematološkim analizatorom (scil Vet ABC™ Hematology Analyzer, Njemačka). Varijable procijenjene u našoj studiji bile su hematokritna vrijednost (HCT), koncentracija hemoglobina (Hb), broj crvenih krvnih zrnaca (RBC), srednji korpuskularni volumen (MCV) i ukupni broj bijelih krvnih zrnaca (WBC). Biohemijski parametri seruma—ukupni protein, albumin, glukoza, urea, trigliceridi, holesterol, kreatinin, aspartat aminotransferaza (AST), alkalna fosfataza (ALP) i fosfor mereni su korišćenjem potpuno automatskog stolnog analizatora sa slučajnim pristupom (Ellipse, Italija). Koncentracija kalcijuma u serumu određena je pomoću plamenog atomskog apsorpcionog spektrometra (Unicam Solar 939, Camberley, Surrey, UK).

2.2.2. Biomarker lipidne peroksidacije

Koncentracije produkata peroksidacije lipida (nivoi malondialdehida, MDA) u serumu mjerene su kao tvari reaktivne s tiobarbiturnom kiselinom (TBAR) prema metodi spektrofotometrijske modifikacije koju su opisali Costa et al. [21]. Ukratko, uzorci seruma su pomešani sa rastvorom trihloroctene kiseline (15%; Merck, Darmstadt, Nemačka), tiobarbiturne kiseline (0.38%; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i hlorovodonične kiseline (0.25 N; Mikrochem, Pezinok, Slovačka) i zagreva se 30 min u ključalu vodenom kupatilu. Nakon hlađenja u ledenoj vodi i centrifugiranja, mjerena je apsorpcija supernatanta na 535 nm. Koncentracija TBAR je određena iz standardne krive pripremljene upotrebom 1,1,3,3-tetrametoksi propana (malondialdehid-bis (dimetil acetal); Acros Organics, Geel, Belgija). Rezultati su izraženi kao nmol MDA/mL seruma.

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

2.2.3. Testiranje aktivnosti fagocita i identifikacija subpopulacija limfocita

Komercijalni Phagotest® test (Celonic, Minhen, Njemačka) korišten je za određivanje fagocitne aktivnosti i kapaciteta fagocita za gutanje. Prilikom izvođenja testa poštivana su uputstva proizvođača. Direktan test imunološkog bojenja primijenjen je za identifikaciju odabranih subpopulacija limfocita. Dvije kombinacije konjugiranih mišjih anti-svinjskih monoklonskih antitijela: CD3e/CD21 i CD4/CD8a/CD25 korištene su prema specifikacijama datim u Tabeli 2. Heparinizirana krv u količini od 50 µL inkubirana je s monoklonskim antitijelima 15 minuta u mraku. na laboratorijskoj temperaturi. Nakon inkubacije, u epruvete je dodan 1 mL rastvora za lizu BD FACS. Epruvete su inkubirane dodatnih 20 min u mraku na laboratorijskoj temperaturi, a zatim centrifugirane (300 × g 5 min). Ćelijske pelete su zatim isprane i centrifugirane dva puta sa 1 mL fosfatnog pufera fiziološkog rastvora (PBS; MP Biomedicals, Illkirch-Graffenstaden, Francuska) na 300 × g tokom 5 minuta. Na kraju, ćelije su resuspendirane u 200 µL PBS-a za naknadnu citometrijsku analizu.

Tabela 2. Specifikacija i količine korištenih mišjih anti-svinjskih monoklonskih antitijela.

Analiza fagocitne aktivnosti kao i identifikacija subpopulacija limfocita obavljena je na protočnom citometru BD FACSCantoTM u šest boja (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA) korištenjem softvera BD FACS DivaTM. Položaj analiziranih ćelija je određen u FSC vs. SSC tačkicama. Granulociti, monociti i obje ćelijske populacije zajedno su zatvorene za analizu fagocitne aktivnosti. Na osnovu niskog sadržaja DNK u histogramu crvene fluorescencije (FL-2), bakterijski agregati su isključeni iz dalje analize. Procenat aktivnih fagocita i srednji intenzitet fluorescencije određeni su na histogramu zelene fluorescencije (FL-1). Za identifikaciju subpopulacija limfocita korišćeni su limfociti sa ulazom (Slika 1a,b). CD3+ limfociti predstavljaju T limfocite i CD21+ B limfocite (slika 1c). CD4+CD8- subpopulacija je ocijenjena kao T pomoćni limfociti, CD4-CD8+ kao citotoksični limfociti, CD4+CD8+ kao dvostruko pozitivni T limfociti (Slika 1d) i CD4+CD25+ kao regulatorni T limfociti (Slika 1e). Proporcije limfocita izražene su u procentima.

2.3. Statistička analiza

Rezultati su statistički procijenjeni neuparenim t-testom sa statističkim softverom GraphPad Prism 8.0. Vrijednost p < 0.05 smatrana je statistički značajnom. Rezultati dobijeni u ovom eksperimentu izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna greška srednje vrijednosti (SEM).

Slika 1. Strategija gajtinga: (a) određivanje položaja limfocita (crveno) na osnovnoj tačkicama (FSC-A naspram SSC-A); (b) uklanjanje dubleta i aglomerata iz analize; (c) analiza zastupljenosti CD3+ i CD21+ limfocita; (d) analiza zastupljenosti CD4+ i CD8+ limfocita; (e) određivanje zastupljenosti CD4+CD25+ limfocita na histogramu iz CD4+ pozitivnih ćelija (zatvoreno zelenom bojom).

3. Rezultati

3.1. Hematološki i serumski biohemijski parametri

Učinci HS na hematološke i biohemijske profile krvi prikazani su u tabeli 3. Utvrđeni parametri krvi uključujući sadržaj crvenih krvnih zrnaca, bijelih krvnih zrnaca, hemoglobina, hematokrita, srednjeg korpuskularnog volumena, ukupnog proteina, albumina, glukoze, uree, triglicerida , holesterol, kreatinin, AST, Ca i P nisu bili pod uticajem dijetetskog tretmana HS. Međutim, dodatak ishrani sa HS povećao je aktivnost ALP (p < 0.05).

Tabela 3. Utjecaj humusnih supstanci na neke hematološke i serumske biohemijske parametre prasadi

Nivo TBAR u serumu, sekundarnih produkata peroksidacije lipida (koji su važan parametar koji se koristi u određivanju peroksidacije lipida), nije bio pod utjecajem dodatka HS.

3.2. Cellular Immune Response

Dodavanje HS hrani za prasad nije imalo značajan uticaj na procenat aktivnih fagocita (Tabela 4) i kapacitet fagocita za gutanje (Tabela 5). Više vrijednosti ovih parametara urođenog imunološkog odgovora nađene su u eksperimentalnoj grupi u odnosu na kontrolnu grupu.

Tabela 4. Utjecaj humusnih tvari na aktivnost fagocita u krvi prasadi procijenjen kao postotak aktivnih fagocita-fagocitna aktivnost

Tabela 5. Utjecaj humusnih tvari na kapacitet zahvatanja fagocita izražen kao srednji intenzitet fluorescencije (MFI).

Slika 2. Nastavak.

Slika 2. Uticaj humusnih supstanci na procenat limfocita: (a) CD3+; (b) CD21+; (c) CD4+CD8-; (d) CD4-CD8+; (e) CD4+CD8+; (f) CD4+CD{{10}}; i (g) odnos CD4:CD8 limfocita u krvi prasadi. Kolona označena zvjezdicom značajno se razlikuje od kontrolne (*** p < 0,001).

4. Diskusija

4.1. Cellular Immune Response

Glavni cilj naše studije bio je pratiti kako huminske supstance (HS) utiču na nekoliko različitih indikatora ćelijskog imuniteta. Procenat aktivnih fagocita i njihov kapacitet gutanja odabrani su kao indikatori za praćenje uticaja na urođeni ćelijski imunitet. U našoj prethodnoj studiji je utvrđeno da dodavanje HS u ishranu ({{0}}}.8%) brojlera značajno povećava fagocitnu aktivnost kao i srednji intenzitet fluorescencije [16]. Dodatno, ELnaggar i El-Kelawy [22] su primijetili povećanje fagocitne aktivnosti i fagocitnog indeksa nakon dodavanja huminske kiseline ishrani (0.1, 0.2 i 0. 4%) Sacco pilića. Slični nalazi dobiveni su i kod kokošaka nosilja [17]. U trenutnoj studiji, suplementacija HS ishrani prasadi nije imala značajan uticaj na fagocitozu. Međutim, postotak aktivnih fagocita kao i njihov kapacitet gutanja bili su brojčano veći kod prasadi dodatog HS nego kod prasadi u kontrolnoj grupi. Prema Sanmiguelu i Rondónu [23], učinak HS na fagocite ovisi o vremenu. Otkrili su da suplementacija HS ishrani (0.1 i 0}.2%) kokoši nesilica povećava fagocitni indeks 8. i 3. dana 0 primjene, ali su uporedili na one od Wang et al. [2], koji je otkrio da svinje čija je hrana sadržavala 10% HS dodanog u to, imaju veći relativni broj limfocita. Slični rezultati dobijeni su i za perad, koja je hranjena hranom sa dodatkom 0,15% humata [24], ili je dodata 20 mg huminske kiseline/kg tjelesne težine u vodi za piće [25]. Prema Cetinu i dr. [24], suplementacija ishrane kokoši nesilica sa huminskim jedinjenjima dovodi do značajnog povećanja broja limfocita, što se može pripisati povećanom stvaranju IL-2, kao i ekspresiji IL{{29} } receptor na limfocitima. Čini se da huminske supstance povećavaju aktivnost ćelija koje proizvode IL{30}. Međutim, drugi autori nisu uočili značajan uticaj na broj limfocita kod svinja koje su hranjene hranom obogaćenom huminskom kiselinom [26], kao ni kod pilića kojima su davane huminske kiseline u vodi za piće [27] ili u ishrani [22]. . Naši rezultati su slični opažanjima Mudro ˇnová et al. [16], koji su otkrili da je procenat CD4 limfocita značajno povećan kod brojlera hranjenih dodatkom HS (0,8%) u poređenju sa kontrolnom grupom. Također su primijetili značajno smanjenje CD8+ limfocita (T citotoksični limfociti), što je rezultiralo statistički višim omjerom CD4:CD8, koji se koristi kao marker imunološke stimulacije. S druge strane, hranjenje kokošaka nosilja sa ishranom od 0,5% HS značajno je povećalo udio IgM+ limfocita koji predstavljaju subpopulaciju B limfocita i značajno smanjilo udio CD{45}} limfocita koji predstavljaju ukupne T limfocite. Udio T pomagača i T citotoksičnih limfocita nije bio pogođen [17]. Na osnovu naših rezultata, kao i različitih istraživanja, proizilazi da HS može imati imunostimulativno djelovanje na koje može utjecati sastav i količina upotrijebljenih humata, način njihove primjene, životinjska vrsta i, prema ELnaggar i El. -Kelawy [22], uzgojem životinja u različitim dijelovima svijeta, koji se razlikuju po klimi. Imunomodulacija HS se teoretski može sastojati od stvaranja kompleksa humata sa saharidima. Ovi kompleksi se vezuju za površinu T limfocita i NK ćelija i utiču na njihovu funkciju, uključujući proizvodnju citokina, koji dalje utiču na druge ćelije imunog sistema [28].

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

4.2. Hematološki i serumski biohemijski parametar

Drugi cilj ovog istraživanja bio je evaluacija odabranih hematoloških i biohemijskih parametara krvi u ishrani prasadi sa suplementom HS. Nije nađena značajna razlika u odabranim varijablama metabolizma proteina, energije i minerala, kao ni u hematološkim indeksima između eksperimentalne grupe životinja sa dodacima HS ishrani i kontrolne grupe, osim aktivnosti ALP u trenutnoj studiji. Biohemijski pokazatelji u našoj studiji bili su u referentnom rasponu kod svih prasadi, prema Doubek i sar. [29] i Kraft i Dürr [30]. Naši nalazi su u skladu s prethodnim radom Wang et al. [2], koji nisu otkrili značajne promjene u crvenim i bijelim krvnim zrncima tokom ispitivanja u svojoj studiji kako bi otkrili efekte HS na krvne varijable kod završnih svinja. Nakon tretmana ishranom koja sadrži HS, Herzig et al. [31], kao i Šamudovska i Demeterova [32], uočili su neznatno povećanu aktivnost ALP kod pilića. U našem istraživanju smo utvrdili da je eksperimentalna grupa imala značajno veću aktivnost ALP od kontrolne grupe. Njihove vrijednosti su u međuvremenu ostale unutar referentnog raspona za nivoe ALP svinja (2–17 kat·L −1 ) [29,30]. S druge strane, Jad'uttová et al. [33] i Rath et al. [34] primijetili su značajno smanjenje aktivnosti ALP kod pilića nakon hranjenja HS. Prema ovim autorima, nivoi ALP-a u krvi kod brojlera koji su dobili 1.00% HS dodatka hrani su se smanjili. Iako su smanjene vrijednosti aktivnosti ALP u Rath et al. [34] studije su bile statistički različite od kontrolne, nisu odražavale nikakav toksični efekat HS na selektivne organe (mišiće, bubrege, srce ili jetru). Količina HS koju daje ishrana može uticati na koncentraciju minerala u krvi. Nivo kalcijuma i fosfora u krvnom serumu prasadi nije bio pod utjecajem primjene HS u koncentraciji od 0,5%. Sposobnost HS da helatira metale, na koju utiče značajna količina bočnih lanaca karboksilne kiseline, mogla bi biti razlog za smanjenje koncentracije minerala u serumu [34]. U našem istraživanju koncentracije kalcijuma i fosfora u krvi prasadi nisu smanjene ispod referentnih vrijednosti dodavanjem HS u krmnu smjesu ogledne grupe. MDA je proizvod peroksidacije lipida uzrokovane slobodnim radikalima kisika, koji se može koristiti kao marker za procjenu antioksidativnog statusa i peroksidacije lipida [35]. MDA je određen kao biomarker oksidativnog stresa mjerenjem nivoa tiobarbiturne kiseline reaktivnih supstanci (TBAR) u krvi. Smanjenje oksidativnog stresa karakterizira smanjenje nivoa MDA. Prethodna istraživanja su pokazala da HS može imati antioksidativna svojstva, štiteći od raznih poremećaja povezanih s oksidativnim stresom koji slobodni radikali obično uzrokuju. Na primjer, Wang et al. [15] su otkrili da dodatak ishrani natrijum humata (2000 mg·kg-1) može poboljšati antioksidativni status odbijenih prasadi. Uočili su značajno smanjenje sadržaja MDA u serumu, kao i značajno povećanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta. Međutim, HS su prirodni materijali sa promjenjivim sastavom, koji mogu uzrokovati različitu djelotvornost, što također može ovisiti o njihovoj primijenjenoj količini. U trenutnom eksperimentu, nisu uočene varijacije u serumskim nivoima MDA (TBAR) prasadi hranjenih HS u poređenju sa kontrolnom grupom. Naši rezultati su u skladu sa Zhang et al. [36], koji su otkrili da dodatak natrijum humata u ishranu (0,1, 0,3 i 0,5%) kokošaka nosilja nema uticaja na ukupni antioksidativni kapacitet seruma i vrednosti MDA.

Prednosti suplemenata cistanche-kako ojačati imuni sistem

5. Zaključci

Na osnovu rezultata dobijenih u ovoj studiji, može se zaključiti da bi suplementacija sa 0.5% humusnih supstanci mogla imati stimulativni učinak na neke imunološke ćelije prasadi. Došlo je do značajnog povećanja udjela CD4+CD8- limfocita u krvi. Suplementacija huminskim supstancama povećava serumsku ALP. Međutim, ove vrijednosti su i dalje bile unutar referentnog raspona. Rezultati su pokazali da čak i tako niska koncentracija HS može pozitivno utjecati na ćelijski imunitet prasadi. S obzirom na to da je odabrana koncentracija humusnih supstanci značajno utjecala samo na neke pokazatelje ćelijskog imuniteta, bit će potrebna daljnja istraživanja kako bi se odabrala odgovarajuća koncentracija i potvrdio stimulativni učinak na imunitet kod ove kategorije životinja.

Reference

1. Peña-Méndez, EM; Havel, J.; Patoˇcka, J. Huminske supstance-jedinjenja jos nepoznate strukture: Primena u poljoprivredi, industriji, zivotnoj sredini i biomedicini. J. Appl. Biomed. 2005, 3, 13–24. [CrossRef]

2. Wang, Q.; Chen, YJ; Yoo, JS; Kim, HJ; Cho, JH; Kim, IH Efekti dopunskih huminskih supstanci na performanse rasta, karakteristike krvi i kvalitet mesa kod svinja za doradu. Livest. Sci. 2008, 117, 270–274. [CrossRef]

3. Visser, SA Utjecaj humusnih supstanci na više životinje i čovjeka, moguća upotreba huminskih jedinjenja u medicinskim tretmanima. U Proceedings of the International Humic Acid Society Meeting, Sevilla, Spain, 1988; str. 27.

4. Stevenson, FJ Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions; Wiley-Inter-Science: New York, NY, SAD, 1994; str. 34–41.

5. Hassan, HMA; Mohamed, MA; Youssef, AW; Hassan, ER Učinak upotrebe organskih kiselina za zamjenu antibiotskih promotora rasta na performanse i crijevnu mikrofloru brojlera. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 2010, 23, 1348–1353. [CrossRef]

6. Gálik, B.; Hrnˇcár, C.; Gašparović, M.; Rolinec, M.; Hanušovský, O.; Juráˇcek, M.; Šimko, M.; Zábranský, L.; Kovačik, A. Utjecaj huminskih supstanci na kvalitet mesa u tovu fazana sa farme (Phasianus colchicus). Poljoprivreda 2023, 13, 295. [CrossRef]

7. Karaoglu, M.; Macit, M.; Esenbuga, N.; Durdag, H.; Turgut, L.; Bilgin, OC Učinak suplementacije humata na različitim nivoima na performanse rasta, klanje i osobine trupa brojlera. Int. J. Poult. Sci. 2004, 3, 406–410.

8. Ji, F.; McGlone, JJ; Kim, SW Efekti prehrambenih huminskih supstanci na performanse rasta svinja, karakteristike trupa i emisiju amonijaka. J. Anim. Sci. 2006, 84, 2482–2490. [CrossRef]

9. Lacková, Z.; Zigo, F.; Farkašová, Z.; Ondrašoviˇcová, S. Utjecaj huminskih supstanci kao organskog suplementa na učinak tova, kvalitet mesa i odabrane biohemijske parametre kunića. Život 2022, 12, 1016. [CrossRef]

10. Kaevska, M.; Lorencova, A.; Videnska, P.; Sedlar, K.; Provaznik, I.; Trckova, M. Utjecaj natrijum-humata i cink oksida koji se koriste u profilaksi dijareje nakon odbića na sastav fekalne mikrobiote kod odbijenih prasadi. Vet. Med. 2016, 61, 328–336. [CrossRef]

11. Trčkova, M.; Matlova, L.; Hudcova, H.; Martin, F.; Zraly, Z.; Dvorska, L.; Beran, V.; Pavlik, I. Treset kao dodatak hrani za životinje: pregled. Vet. Med. -Češki. 2005, 50, 361–377. [CrossRef]

12. Weber, TE; van Sambeek, DM; Gabler, NK; Kerr, BJ; Moreland, S.; Johal, S.; Edmonds, MS Učinci prehrambene huminske i butirne kiseline na učinak rasta i odgovor na lipopolisaharide kod mladih svinja. J. Anim. Sci. 2014, 92, 4172–4179. [CrossRef]

13. Mao, Y. Modulacija performansi rasta, sastava mesa, oksidativnog statusa i imuniteta brojlera dijetalnim fulv kiselinama. Poult. Sci. 2019, 98, 4509–4513. [CrossRef] [PubMed]

14. Stepchenko, LM Uloga huminskih preparata u upravljanju metaboličkim procesima u formiranju bioloških proizvoda poljoprivrednih životinja. U Dostignuća i izgledi za upotrebu huminskih supstanci u poljoprivredi; Izdavačka kuća Poljoprivrednog instituta: Dnjepropetrovsk, Ukrajina, 2008; str. 70–74. (Na ruskom)

15. Wang, Q.; Ying, J.; Zou, P.; Zhou, Y.; Wang, B.; Yu, D.; Li, W.; Zhan, X. Učinci dijetetskih suplemenata natrijum-oksida huminske kiseline i cink oksida na učinak rasta, imunološki status i antioksidativni kapacitet odbijenih prasadi. Životinje 2020, 10, 2104. [CrossRef] [PubMed]

16. Mudro ˇnová, D.; Karaffová, V.; Pešulová, T.; Košˇcová, J.; Marušˇcáková, IC; Bartkovský, M.; Marcinˇcáková, D.; Ševˇcíková, Z.; Marcinˇcák, S. Utjecaj humusnih tvari na crijevnu mikrobiotu i imuni odgovor brojlera. Food Agric. Immunol. 2020, 31, 137–149. [CrossRef]

17. Mudro ˇnová, D.; Karaffová, V.; Semjon, B.; Nad', P.; Košˇcová, J.; Bartkovský, M.; Makiš, A.; Buj ˇnák, L.; Nagy, J.; Mojžišová, J.; et al. Utjecaj dodataka ishrani huminskih tvari na proizvodne parametre, imunološki status i crijevnu mikrobiotu kokoši nesilica. Poljoprivreda 2021, 11, 744. [CrossRef]

18. Evropska komisija. Direktiva 2010/63/EU Evropskog parlamenta i Vijeća od 22. septembra 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u naučne svrhe. Isključeno. J. Eur. Union 2010, 276, 33–79.

19. Šimeˇcek, K.; Zeman, L.; Heger, J. Potrebe za nutrijentima i tabele nutritivnih vrednosti hrane za svinje, 3. izd.; Češka akademija poljoprivrednih nauka: Brno, Češka Republika, 2000; 125p. (na češkom)

20. Evropska komisija. Uredba Komisije (EZ) br. 152/2009 od 27. januara 2009. o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje. Isključeno. J. Eur. Union. 2009, 54, 2–54.

21. Costa, CM; Santos, RCC; Lima, ES Jednostavna automatizirana procedura za mjerenje tiola u uzorcima ljudskog seruma. J. Bras. Patol. Med. Lab. 2006, 42, 345–350. [CrossRef]

22. ELnaggar, AS; El-Kelawy, MI Utjecaj dodatka huminske kiseline na produktivne performanse, sastojke krvi, imunološki odgovor i karakteristike trupa Sasso piletine. Egipat. J. Anim. Prod. 2018, 55, 75–84.

23. Sanmiguel, PR; Rondón, BI Suplementacija huminskim supstancama utiče na urođeni imunitet kod kokoši nesulja u fazi post posta. Rev. MVZ Córdoba 2016, 21, 5198–5210. [CrossRef]

24. Cetin, E.; Guclu, BK; Cetin, N. Utjecaj dijetetskih suplemenata humata i organske kiseline na socijalni stres izazvan visokom gustinom stočnog fonda kod nesilica. J. Anim. Vet. Adv. 2011, 10, 2402–2407.

25. Salah, H.; Mansour, E.; Reham, RR; Abd El Hamid, ES Studija o utjecaju huminske kiseline na performanse rasta, imunološke, neke krvne parametre i kontrolu crijevnog klostridija kod pilića brojlera. Zag. Vet. J. 2015, 43, 102–109. [CrossRef]

26. Kim, K.; Bae, I.; Cho, J.; Choi, Y.; Ha, J.; Choi, J. Efekti dodatka huminske kiseline i praha listova borovnice u stočnoj hrani na produktivnost, kvalitet krvi i mesa doradnih svinja. Food Sci. Anim. Resour. 2019, 39, 276–285. [CrossRef] [PubMed]

28. Lala, AO; Okwelum, N.; Irekhore, OT; Ogunlade, BA; Adigun, AA; Elegbede, LA; Oyedeji, MM Hematološki i biohemijski parametri pilića brojlera obogaćenog huminskom kiselinom u vodi za piće. Appl. Trop. Agric. 2016, 21, 74–78.

28. Terratol, LLC Efekti huminske kiseline na životinje i ljude. Dostupno na mreži: https://fulvic.info/wp-content/uploads/2019 /01/M-Terratrol_Article-1.pdf (pristupljeno 10. avgusta 2022).

29. Doubek, J.; Šlosárková, S.; ˇReháková, K.; Bouda, J.; Scheer, P.; Piperisová, I.; Tomenendálová, J.; Matalová, E. Interpretacija osnovnih biohemijskih i hematoloških nalaza kod životinja, 2. izd.; Noviko: Brno, Češka, 2010; str. 102. (na češkom)

30. Kraft, W.; Dürr, UM Klinická Laboratórna Diagnostika vo Veterinárnej Medicíne, 1. izd.; Hajko & Hajková: Bratislava, Slovačka, 2001; str. 1–380. (na slovačkom)

31. Herzig, I.; Navrátilová, M.; Totušek, J.; Suchý, P.; Većčerek, V.; Blahová, J.; Zralý, Z. Utjecaj huminske kiseline na akumulaciju cinka u tkivima brojlera pilića. češki J. Anim. Sci. 2009, 54, 121–127. [CrossRef]

33. Šamudovská, A.; Demeterová, M. Utjecaj ishrane obogaćene prirodnim huminskim spojevima i natrijum humatom na performanse i odabrane metaboličke varijable kod brojlerskih pilića. Acta Vet. Brno 2010, 79, 385–393. [CrossRef]

33. Jad'uttová, I.; Marcinˇcáková, D.; Bartkovský, M.; Semjon, B.; Harˇcárová, M.; Nagyová, A.; Váczi, P.; Marcinˇcák, S. Utjecaj prehrambenih huminskih supstanci na učinak tova, prinos trupa, biohemijske parametre krvi i mineralni profil kostiju brojlerskih pilića. Acta Vet. Brno 2019, 88, 307–313. [CrossRef]

34. Rath, NC; Huff, WE; Huff, GR Efekti huminske kiseline na brojlerske piliće. Poult. Sci. 2006, 85, 410–414. [CrossRef]

35. Sumida, S.; Tanaka, K.; Kitao, H.; Nakadomo, F. Peroksidacija lipida izazvana vježbanjem i curenje enzima prije i nakon dodatka vitamina E. Int. J. Biochem. 1989, 21, 835–838. [CrossRef]

36. Zhang, AR; Pirzado, SA; Liu, GH; Chen, ZM; Chang, WH; Cai, HY; Bryden, WL; Zheng, AJ Dodatak ishrani sa natrijum humatom poboljšava kvalitet jaja i imunološku funkciju kokošaka nosilja. J. Appl. Anim. Nutr. 2020, 8, 93–99. [CrossRef]