Kako vodeni ekstrakt Cistanchea potiče peristaltiku crijeva i poboljšava zatvor?

Shuai Yan,1,2 Yin-zi Yue,1 Xiao-peng Wang,1 Hong-li Dong,1 Shu-guang Zhen,1 Ben-sheng Wu,1 i Hai-hua Qian3

Prijavljeno je da tradicionalna kineska medicina ima dobre efekte u liječenju funkcionalne opstipacije. Ovim radom pokušalo se dokazati djelovanje vodenih ekstrakata HerbeCistanche(AEHC) o liječenju STC-a i utvrđivanju mogućih mehanizama pomoću modela sporog tranzitnog zatvora (STC) izazvanog loperamidom. HPLC je urađen za identifikaciju i potvrdu bioaktivnih komponenti u AEHC. Utvrđeno je da je AEHC oslabio STC odgovore na osnovu povećane fekalne količine, sadržaja vlage i brzine intestinalnog tranzita, kao i serumskih nivoa GAS, MTL, SS i CGRP. Nivoi proteina i mRNA u c-kit-u, označavanje intersticijskih ćelija Cajal (ICC), također su se povećali. U međuvremenu se povećao samo nivo proteina SCF-a, liganda ckit-a. Analiza naših podataka sugerira da bi AEHC očigledno mogao poboljšati funkciju ICC putem signalnog puta koji uključuje PI3K, SCF i c-kit i poboljšati indekse motiliteta debelog crijeva kao što su GAS, MTL, SS i CGRP. Zanimljivo je primijetiti da je AEHC djelotvoran kod opstipacije, tako da su potrebni daljnji eksperimenti kako bi se razjasnili tačni mehanizmi koji su uključeni.

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

acteoside in cistanche imaju dobar učinak na antioksidans

1. Uvod

Konstipacija je uobičajena funkcionalna gastrointestinalna bolest i javnozdravstveni problem, koju karakterizira kontinuirano otežano, rijetko ili nepotpuno pražnjenje [1]. Prevalencija opstipacije varira od 0,7 posto do 81 posto širom svijeta, posebno kod starijih [2, 3]. Sporo tranzitna konstipacija (STC) je uobičajena gastrointestinalna tegoba među 13-37 posto pacijenata s kroničnom konstipacijom otpornom na liječenje [4, 5]. Epidemiološki podaci ukazuju na veću incidencu STC među mladim ženama nego muškarcima [6]. STC uzrokuje teško rješiv zatvor, pokazujući slab odgovor na konzervativno liječenje i sklonost neurodegenerativnom poremećaju. Nije tako jednostavno kao funkcionalna bolest, zahtijeva invazivno i agresivno liječenje [7].

Brojni aktualni kemijski lijekovi kao što su osmotski ili sekretorni laksativi i sredstva za povećanje volumena univerzalno se koriste za

liječe zatvor [8], iako je njihova primjena ograničena zbog velikih troškova i abdominalnih nuspojava kao što su bol, grčevi i nadimanje [9]. Trenutno je regulacija gastrointestinalnog trakta primarni fokus terapije opstipacije. Cisaprid je prvo generiran kao sredstvo za promociju za liječenje želučanih bolesti, ali je kasnije povučen zbog rizika od srčanih aritmija [10].

Tegaserod je selektivni 5-antagonist receptora hidroksitriptamina koji može stimulirati crijevnu peristaltiku i sekreciju [11, 12]. Prukaloprid je novi derivat dihidrobenzofuran karboksamida i agonist 5-HT receptora sa visokom selektivnošću i specifičnošću, koji može poboljšati motilitet želuca, tankog crijeva i debelog crijeva i djeluje brže u dinamici [13–15]. Kao derivat prostaglandina E1, lubiproston može selektivno aktivirati CIC kanal kako bi promovirao gastrointestinalnu sekreciju i povećao efekte intestinalnog prijenosa [16].

Pokretljivost kod zatvora je široko rasprostranjen problem, ali njegova etiologija još nije jasna. Ipak, uvjerljivi dokazi su pokazali doprinos Cajalovih intersticijskih ćelija (ICC) patogenezi opstipacije [17]. ICC se nalazi između nervnih završetaka i glatkih mišićnih ćelija u gastrointestinalnom traktu. ICC je općenito priznat kao stanice pejsmejkera za gastrointestinalnu aktivnost i kao medijator neuro-mišićnog prijenosa [18]. Studije su pokazale da je gustina ICC-a u debelom crijevu pacijenata sa sporim tranzitnim zatvorom značajno niža u poređenju s onima kod normalnih pacijenata [19]. Shodno tome, opadajući broj ICC-a može dovesti do manjka sporotalasne aktivnosti, što utiče na kontraktilni odgovor i izaziva odloženi tranzit kod pacijenata sa konstipacijom u sporom tranzitu. Za ovu tačku, poboljšanje ICC-a korištenjem lijekova može biti ključno za izlječenje spore tranzitne konstipacije.

Različiti biljni lijekovi i tradicionalna kineska formula nedavno su privukli pažnju kao novodobni terapeutici za liječenje kronične konstipacije kao rezultat poboljšane proizvodnje stolice [20, 21]. HerbaCistancheje tradicionalni biljni lijek koji se koristi u liječenju kronične bubrežne bolesti, ženske neplodnosti, obilne menoragije i impotencije [22, 23]. HerbaCistanchesprečava apoptozu neurona mozga ekspresijom faktora povezanih sa apoptozom i neurotrofnih faktora u ćelijama MES23.5 [24]. Herba Cistanche je također pokazala farmaceutski potencijal u liječenju Yang-Qi sindroma nedostatka bubrega-Yang. Nedavna studija je pokazala da HerbaCistanchepovećava mitohondrijalno disanje i antioksidativni status glutationa u H9c2 kardiomiocitima [25].

TCM vjeruje da zatvor ima blisku vezu s bubrezima. Otvarajući se na vanjskim genitalijama i anusu, bubreg upravlja mokrenjem i defekacijom. Transport otpada se oslanja na promociju qija bubrega i ishranu jina bubrega. Ako je jang bubrega manjkav ili se vatra životne kapije ugasi, hladno začepljenje debelog crijeva će rezultirati stagnacijom otpada. Zatvor je također uzrokovan suvim pražnjenjem crijeva jer nedostatak bubrežne esencije ne stvara dovoljno tekućine [26].

HerbaCistancheje uobičajena ujedinjujuća biljka, slatkastog i slanog okusa i tople prirode. Pripisuje se debelom crijevu i meridijanima bubrega, može tonizirati jang bubrega i vlažiti crijeva kako bi ublažio zatvor. Ova pojedinačna biljka i njeni kineski farmaceutski preparati su naširoko korišćeni za lečenje zatvora sa izuzetnom efikasnošću [27].

U Kini, efekti HerbeCistanchekorijeni opstipacije zabilježeni su [28, 29] i navedeni u Shen Nongovoj Kineskoj Materia Medica kao "osušene sočne stabljikeCistanchevrste" [30]; međutim, naučni dokaz o dejstvu HerbaCistanchekorijeni opstipacije do sada nisu postojali, klinički efikasna doza je 20 g dnevno u kineskoj farmakopeji, a klinički efekat se ne povećava dalje s dozom.

Od HerbaCistancheje toliko oskudan [31], standardiziranje njegove kliničke doze za liječenje STC eksperimentalnim istraživanjem ne samo da sprječava neuspjeh liječenja zbog neadekvatne doze, već i drži pacijente podalje od ekonomskog gubitka, pa čak i nesreće s lijekovima prekomjernom upotrebom. Nadamo se

rezultati bi mogli postaviti naučnu osnovu za nove lijekove protiv zatvora. Stoga je važno istražiti vodenu HerbuCistanche'sfunkcija crijevne promocije i njeno djelovanje na ICC u ovoj studiji.

2. Materijali i metode

2.1. Priprema vodenog ekstrakta Herba Cistanche.

All HerbaCistanchekupljeni su od Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co., Ltd. (Nanjing, Kina), koji su ubrani, sakupljeni i obrađeni prema standardnim etnobotaničkim praksama sa plantaža u oblasti Sinkiang u Kini. Identitet biljke morfološki je utvrdio profesor Tu Lin Lu sa Univerziteta kineske medicine u Nanjingu, Nanjing, Kina. Uzorak vaučera (NUCCHS-2015628) deponovan je na Koledžu zdravstvenih nauka Univerziteta kineske medicine u Nanjingu, Nanjing, Kina.

Kriške HerbeCistanche, težine 500 g, usitnjeni su električnim mikserom i ekstrahovani u 5000 ml destilovane vode, nakon čega je vodeni ekstrakt prečišćen 2 h na 100 C pomoću opreme za cirkulaciju.

membranske pore (Millipore, Billerica, MA, SAD), a ostatak dobijen iz ekstrakata rastvoren je u 4000 ml vode. Nakon refluks ekstrakcije, ekstrakti su sakupljeni i upareni da bi se dobio konačni proizvod uzorka. Vodeni ekstrakti su koncentrirani do suhih peleta (1 g/ml) korištenjem a

za kasniju upotrebu. Čvrsti uzorci su rekonstituisani u destilovanoj vodi da bi se dobile potrebne doze od 10, 20 i 40 mg/kg telesne težine za eksperiment.

2.2. Životinje.

Eksperimentalni protokol korišten u ovoj studiji pregledan je i odobren na osnovu etičkih procedura i naučne brige od strane Suzhou Hospital of Traditional Kine Medicine-Institucionalni odbor za negu i upotrebu životinja, Suzhou, Kina (SHTCM-IACUC; broj odobrenja: PNU{{2} }). Svi mužjaci pacova (soj Sprague Dawley) sa ag su kupljeni od Šangajskog laboratorijskog centra za istraživanje životinja u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje. Životinje su imale slobodan pristup standardnoj ishrani (AIN-93 M) i vodi iz slavine ad libitum i bile su smještene pojedinačno u postotnoj relativnoj vlažnosti od nehrđajućeg čelika i bile izložene 12 h prirodnom svjetlu i 12 h mraku dnevno.

2.3 Eksperimentalni dizajn.

Loperamid je korišten za izazivanje zatvora kod pacova u skladu s prethodnim studijama [32, 33]. Ukupno 60 pacova nasumično je podijeljeno u 5 grupa (po grupi): A: normalna grupa (NG), B: model grupa (grupa tretirana Lop plus vehikulumom), C: grupa pacova s ​​konstipacijom tretiranih niskim vodenim ekstraktom Herba Cistanche (Lop plus LAEHC-tretirana grupa), D: grupa pacova sa zatvorom tretiranih sa srednjim vodenim ekstraktom Herba Cistanche (Lop plus MAEHC-tretirana grupa), i E: grupa pacova sa opstipacijom tretiranih visokim vodenim ekstraktom Herbe Cistanche (Lop plus HAEHC-tretirana grupa). Grupa A je tretirana normalnim fiziološkim rastvorom (10 ml/kg); Grupa B je liječena loperamidom

(4 mg/kg); Grupa C je tretirana loperamidom (4 mg/kg) i niskim vodenim ekstraktom Herba Cistanche (1 g/kg); Grupa D je tretirana loperamidom (4 mg/kg) i srednjim vodenim ekstraktom Herba Cistanche (2 g/kg), a Grupa E tretirana je loperamidom (4 mg/kg) i visokim vodenim ekstraktom Herba Cistanche (4 g/ kg). Svim pacovima iz normalne grupe je ubrizgan 0,9 posto natrijum hlorida, dok je ostalima injiciran loperamid u količini 0,9 posto natrijum hlorida dva puta dnevno tokom 3 uzastopna dana da bi se izazvala zatvor. Vodeni ekstrakt Herba Cistanche je suspendiran u vodi i oralno davan jednom dnevno od 4. do 18. dana u Grupi C, Grupi D i Grupi E, dok su Grupe A i B primale konzistentan volumen vode putem sonde.

2.4. Kromatografsko stanje.

HPLC profilisanje je obavljeno u Shimadzu tečnom hromatografskom sistemu (Tokio, Japan), koji se sastoji od LC-20AT pumpe i

praćeni su na 330 nm na 30 C. Izokratska mobilna faza se sastojala od metanola 0,1 posto mravlje kiseline (80:20, v/v) i radila je pri brzini protoka od 1,0 ml/min . Kromatografsko odvajanje je bilo

veličina čestica 5 m, Beijing Dikma Science and Technology Co., Ltd., Peking, Kina).

2.5. Analiza vježbanja, unosa hrane, unosa vode, tijela

Gumi arable (vodena suspenzija od 20 posto drvenog uglja i 10 posto guma oranica) je davana oralno u količini od 25 ml/kg svake životinje. Nakon 30 minuta, životinje su humano žrtvovane cervikalnim iščašenjem i secirane. Pređena su tanka crijeva od pilorusa do cekuma i izmjerena je razdaljina koju je prešao ugljeni obrok i ukupna dužina tankog crijeva. Za pojedinačnog štakora, postotak crijevnog tranzita izračunat je kao postotak udaljenosti koju je prešao obrok s drvenim ugljenom u odnosu na ukupnu dužinu tankog crijeva. Sljedeća jednačina izračunava brzinu crijevnog tranzita (procenti): udaljenost koju je prešao drveni ugalj/razdaljina od pilorusa do cekuma 100 posto.

2.6. Uzimanje uzoraka krvi i tkiva. Na kraju eksperimentalnog perioda, pacovi su podvrgnuti 12-satnom gladovanju, ali im je omogućen slobodan pristup vodi. Svi pacovi su zatim anestezirani 30 minuta kasnije intraperitonealnom injekcijom natrijum pentobarbitala (50 mg/kg) i stavljeni na sto sa regulisanom temperaturom. Uzorci krvi su sakupljeni i centrifugirani na 3500 rpm tokom 15 minuta da bi se dobio serum. Debelo crijevo je odmah podijeljeno i isprano normalnim fiziološkim rastvorom na 4 C, a zatim podijeljeno na dva dijela. Jedan fragment je fiksiran u 10 posto formalina i obrađen u split parafinu za naknadnu imunohistohemijsku (IHC) analizu, dok je drugi bio Težina i kosa. Promjene u vježbanju, unosu hrane, vode

čuvani na 80 C dok nisu analizirani. unos, tjelesna težina i kosa su posmatrani i bilježeni svakodnevno tokom eksperimentalnog perioda. Uočili smo "promjene u vježbanju" slijedeći specifične korake: kutija koju je sama izradila (visoka 60 cm, duga 50 cm i široka 80 cm sa tamnim perifernim zidom) koristi se za testiranje na otvorenom terenu; bijelo tlo je bilo podijeljeno na dijamante (12 cm) crnom linijom u mračnoj i tihoj prostoriji; sijalica od 100 W visi 1 m iznad sredine kutije; pacovi su postavljeni u centar kutije 4., 6., 12. i 18. dana modeliranja. Broj kvadrata kroz koje su pacovi prošli u roku od 5 minuta korišten je kao rezultat horizontalnog kretanja, a vrijeme uspravnog položaja pacova u roku od 5 minuta korišteno je kao rezultat vertikalnog kretanja. Horizontalni rezultati i rezultati pokreta plus rezultati vertikalnih pokreta ukazuju na količinu vježbanja štakora. Svaki štakor je mjeren jednom [34, 35].

2.7. Merenje fekalnih parametara.

Posljednjeg dana oralne primjene, svježe pelete stolice od svakog SD štakora su sakupljene u epruvete sa zapušenim okruglim dnom tokom 6 h, a ukupna težina svake grupe je zabilježena. Da bismo odredili sadržaj fekalne vlage, koristili smo električnu vagu za sušenje peleta stolice dok se ne postigne konstantna težina i izmjerili suvu težinu. Sadržaj vlage

2.8. Procjena GAS-a, MTL-a, SS-a i CGRP-a.

Koncentracije gastrina (GAS), motilina (MTL), somatostatina (SS) i peptida povezanog sa genom kalcitonina (CGRP) u serumu procijenjene su ELISA-om korištenjem komercijalno dostupnih kompleta.

2.9. Histološka analiza.

Poprečne kolone sakupljene od SD štakora su fiksirane sa 10 posto formalina tokom 12 h, ugrađene

m debelih kriški koje su obojene hematoksilinom i eozinom (H&E, Sigma-Aldrich, MO, SAD). Morfološke karakteristike ovih preseka su uočene pod svetlosnom mikroskopijom, nakon čega su merene dužina resica, debljina kripte i debljina mišića korišćenjem Leica Application Suite (Leica Microsystems, Švajcarska).

2.10. Imunohistohemijska analiza.

Pratili smo metode Zhu et al. (2016) [36]; bili su nefarbani dijelovi od 5 m

obojen zečjim anti-c-kitom (1:100) na 4°C preko noći. Metoda sekundarnog antitijela i kompleksa avidin-biotin-peroksidaza korištena je prema uputama proizvođača. Imunoglobulin-negativna kontrola je korištena da se eliminira nespecifično vezivanje. Nivoi ekspresije c-kita

2.11. Analiza brzine intestinalnog tranzita.

Odnos crijevnog tranzita rađen je prema ranije prijavljenim protokolima [36]; ukratko, nakon 14 dana tretmana, svi SD pacovi su bili podvrgnuti 12-satnom gladovanju, ali im je bio dozvoljen slobodan pristup vodi.

Lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu. Nivoi ekspresije gena c-kit, SCF i PI3K mRNA u debelom crijevu određeni su korištenjem kompleta za ekstrakciju ukupne RNK (TIANGEN Biotech,

Peking, Kina) prema protokolima proizvođača. PCR u realnom vremenu je izveden sa ABI StepOnePlus Real-Time PCR sistemom (ABI). SYBR Green I PCR Master Mix u realnom vremenu (QPK201, Toyobo, Japan) korišten je za detekciju PCR proizvoda. Reakcije su izvedene u tri primjerka. Nakon toga, svježe tkivo debelog crijeva štakora težine 0,5 g je homologirano.

l) ekstrahiran prema uputama proizvođača pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen, SAD). Komplet za reverznu transkripciju-PCR (Takara Biotechnology Co., Inc.) je korišten za sintezu prvog lanca cDNK u skladu sa protokolom proizvođača. Svi ciljani parametri prikazani su u tabeli 1. Protokol ciklusa je bio pod sljedećim uslovima: 95 C u trajanju od 5 minuta (denaturacija DNK), nakon čega je slijedilo 40 ciklusa od 95 C u trajanju od 15 s, 60 C tokom 20 s i 72 C za 40 s. Analiza krive topljenja je izvršena na kraju ciklusa amplifikacije.

2.12. Western blot analiza.

Sadržaj proteina c-kit-a i SCF-a u homogenatima uzoraka debelog crijeva procijenjen je Western blot-om. Ukratko, ukupni proteini homogenata određivani su upotrebom bicinhoninske kiseline (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel (SDS-PAGE) korišćen je za odvajanje proteina u BioRad sistemu elektroforeze (BioRad Laboratories, Hercules, Kalifornija, SAD). Proteini su zatim prebačeni na membrane od poliviniliden difluorida (PVDF). Nakon 2 sata tretmana puferom za blokiranje u TBS-u koji sadrži 5 posto nemasnog mlijeka na sobnoj temperaturi, PVDF membrane su inkubirane preko noći sa 1 : 1000 razrijeđenim anti-c-kitom (Santa Cruz, Kalifornija, SAD), 1 : 500 razrijeđenim anti-c-kitom. SCF (Sigma, MO,

SAD) i 1:8000 razblaženih anti-aktinskih (Kangchen, Šangaj, Kina) antitela, respektivno. Vezivanje primarnog antitela je detektovano korišćenjem odgovarajućeg HRP-konjugovanog sekundarnog antitela (Beyotime, Jiangsu, Kina). Za detekciju hemiluminiscencije korišteni su poboljšani komplet za hemiluminiscenciju (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, SAD) i Odyssey Infrared Imaging System (Gene Company Ltd., Hong Kong). Prolaktin za održavanje je korišten kao kontrola opterećenja. Količina ekspresije proteina prikazana je u odnosu na nivoe aktina.

2.13. Statistička analiza.

Podaci mjerenja su prikazani kao srednja standardna greška srednje vrijednosti (SEM) i analizirani SPSS

16.0 softver (SPSS, Chicago, IL, USA). Jednosmjerna analiza varijanse (ANOVA) praćena Duncanovim testovima višestrukih opsega korištena je za utvrđivanje značajnih razlika u svim parametrima. Vrijednosti su se smatrale statistički značajnim na

3. Rezultati

3.1. Sastav i funkcionalne komponente Herba Cistanche.

Kao što je prikazano na slici 1, korijen Herba Cistanche sadrži visoke koncentracije nekoliko bioaktivnih komponenti povezanih s laksativnim djelovanjem. Koncentracije ukupnih ehinakozida i ukupnih verbakozida bile su 0,64 mg/g i 0,16 mg/g, respektivno. Dva pika koji ukazuju na visoke nivoe ehinakozida i verbaskozida su detektovani u LP u odgovarajućem vremenu zadržavanja tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC).

3.2. Opća zapažanja.

SP pacovi nisu uginuli tokom eksperimenta, što ukazuje na bolju sigurnost i operativnost životinjskog modela. U poređenju sa grupom A, pacovi u grupi modela pokazali su pahuljasto krzno, malaksalost, suvu stolicu i

pogoršala produljenjem vremena modeliranja.

3.3. Utjecaj AEHC na broj stolice i sadržaj vlage kod pacova izazvanih opstipacijom loperamidom.

U poređenju sa normalnim izmetom, izmet u grupama B, C, D i E bio je suv, malen i tvrd i nije bio pečen pre tretmana.

na kraju krajeva, pacovima je ubrizgan loperamid (liječeni lijekovima su ublažili simptome kao tijelo i 3(b)).

težina se nije značajno razlikovala među svim eksperimentalnim grupama, iako je grupa E pokazala nešto manju tjelesnu težinu od ostalih grupa (slika 2(a)). Osim toga, SD pacovi sa konstipacijom jeli su značajno manje hrane od grupe A ( ), dok razlike između grupa B, C, D i E (Slika 2(b)) nisu bile značajne. Potrošnja vode se također nije promijenila između Grupe A i Grupe B. Osim toga, nije zabilježen značajan porast potrošnje vode

da tretman sa AEHC nije izazvao nikakve promjene. Iako je stopa crijevnog tranzita u grupama C, D, a također je bila značajno viša, grupe C, D i E imale su značajno niže omjere od grupe A.

3.4. Utjecaj AEHC na brzinu prolaska tankog crijeva kod pacova izazvanih opstipacijom loperamidom.

Kao što se vidi sa slike 4, nisu otkrivene razlike u osnovnom vremenu prolaska kroz tanko crijevo između pet grupa. Grupa B ima značajno niži omjer pokretanja praha drvenog uglja u poređenju sa Grupom A (𝑃 < 0.01).="" iako="" je="" stopa="" crijevnog="" tranzita="" u="" grupama="" c,="" d="" i="" e="" također="" bila="" značajno="" viša="" od="" one="" u="" grupi="" b="" (𝑃="">< 0,05),="" grupe="" c,="" d="" i="" e="" imale="" su="" značajno="" niže="" omjere="" od="" grupe="">

3.5. Intervencija s AEHC djelomično poboljšava funkciju indeksa motiliteta debelog crijeva.

Nivoi GAS-a i MTL-a u serumu dobijeni od pacova Grupe B značajno su smanjeni u poređenju sa onima iz Grupe A (𝑃 < {{0}}.01,="" odnosno).="" s="" druge="" strane,="" grupe="" c,="" d="" i="" e="" (𝑃="">< 0.05,="" odnosno)="" imaju="" efektivno="" više="" nivoe="" gas-a="" i="" mtl-a="" od="" primjene="" ekstrakata="" herba="" cistanche="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" b="" ss="" vrijednosti="" u="" pacovima="" grupe="" b="" bile="" su="" veće="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" a="" (𝑃="">< 0.01);="" grupe="" c,="" d="" i="" e="" imaju="" oslabljene="" nivoe="" ss="" (𝑃="">< 0,05)="" (slika="" 5).="" u="" poređenju="" sa="" pacovima="" sa="" konstipacijom,="" nivoi="" cgrp="" u="" normalnim="" štakorima="" grupe="" a="" (𝑃="">< 0,01)="" i="" u="" grupama="" c,="" d="" i="" e="" kojima="" je="" davana="" herba="" cistanche="" bili="" su="" konstantni="" (𝑃=""> 0,05).

3.6. Histološka promjena debelog crijeva.

Da bi se istražilo može li liječenje AEHC-om izazvati strukturnu promjenu tkiva debelog crijeva, izmjerena je dužina resica, debljina sloja kripte i debljina mišića u poprečnim kolonima štakora u pet grupa nakon H&E bojenja. Poređenjem patologije debelog crijeva štakora u svakoj grupi, sluznica debelog crijeva je glatka i sadrži male arterije i male vene u submukozi i veliki broj masnih stanica. Osim toga, mišićni sloj se sastojao od glatkih mišićnih ćelija, a subseroza je bila kompletna. Prosječna dužina resica bila je značajno kraća u grupi B nego u grupi A (𝑃 < {{0}}.01).="" međutim,="" prosječna="" dužina="" resica="" u="" grupi="" c="" se="" značajno="" povećala="" za="" više="" od="" 30="" posto="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" b="" (slike="" 6="" i="" 7)="" (𝑃="">< 0,05).="" u="" međuvremenu,="" prosječna="" dužina="" resica="" se="" značajno="" povećava="" u="" grupama="" d="" i="" e="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" b="" (slike="" 6(a)="" i="" 6(b))="" (𝑃="">< 0,01).="" nadalje,="" promjena="" debljine="" mišića="" bila="" je="" vrlo="" slična="" dužini="" resica.="" u="" grupi="" b,="" debljina="">

bio je dramatično tanji u poređenju sa Grupom A. Međutim, nivoi debljine mišića u Grupama C, D i E povećali su se za 30-35 procenata u odnosu na grupu B (Slike 6 i 7). Sve u svemu, ovi nalazi ukazuju da AEHC može povećati dužinu resica i debljinu mišića u debelom crijevu pacova s ​​konstipacijom.

3.7. Primjena AHEC tretmana povećala je ekspresiju proteina c-Kit-a i SCF-a.

Imunoreaktivnost je otkrivena u debelom crijevu jer su ćelije u svim grupama bile pozitivne na c-kit. Kao što je prikazano na slici 8, nivo ekspresije c-kita u grupi B bio je niži od onog u grupi A (𝑃 < 0.05).="" nivo="" ekspresije="" c-kit-a="" u="" grupi="" c="" bio="" je="" viši="" od="" onog="" u="" grupi="" b="" (𝑃="">< 0.{{20}}}5),="" dok="" je="" više="" c-kita="" bilo="" prisutno="" u="" grupama="" d="" i="" e="" nego="" u="" grupi="" b="" (𝑃="">< 0.05).="" nakon="" tretmana="" različitim="" koncentracijama="" vodenog="" ekstrakta="" herba="" cistanche="" tokom="" 2="" sedmice,="" nivoi="" ekspresije="" proteina="" c-kit="" i="" scf="" detektovani="" su="" western="" blot="" analizom.="" western="" blot="" analiza="" je="" pokazala="" da="" su="" nivoi="" ekspresije="" c-kit-a="" i="" scf-a="" bili="" značajno="" niži="" nakon="" tretmana="" loperamidom="" u="" debelom="" crijevu="" pacova="" (slika="" 9).="" slika="" 8(e)="" pokazuje="" da="" se="" smanjeni="" c-kit="" kod="" pacova="" s="" ​​konstipacijom="" značajno="" povećao="" za="" 31,2="" posto="" nakon="" tretiranja="" štakora="" sa="" 500="" 𝜇g/ml="" aehc="" (𝑃="">< 0,05).="" pored="" toga,="" tretman="" sa="" 100="" i="" 200="" g/ml="" aehc="" je="" povećao="" nivoe="" ekspresije="" proteina="" c-kit.="" ekspresija="" scf="" proteina="" značajno="" se="" povećala="" za="" 20,1,="" 24,7="" i="" 8,4="" posto="" pri="" tretmanu="" sa="" 100,="" 200="" i="" 500="" 𝜇g/ml="" aehc,="" respektivno="" (slika="" 9).="" 3.8.="" učinak="" aehc="" na="" ekspresiju="" mrna="" c-kit,="" scf="" i="" pi3k.="" da="" bi="" se="" istražilo="" može="" li="" liječenje="" aehc-om="" utjecati="" na="" regulaciju="" mrna="" u="" vezi="" sa="" mišićnom="" kontrakcijom,="" uočene="" su="" promjene="" u="" nivoima="" ekspresije="" c-kit,="" scf="" i="" pi3k="" u="" debelom="" crijevu="" pacova="" s="" ​​konstipacijom="" koristeći="" specifične="" prajmere.="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" su="" nivoi="" mrna="" c-kit="" u="" grupi="" b="" bili="" značajno="" niži="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" a="" (𝑃="">< 0,05),="" dok="" su="" nivoi="" mrna="" u="" grupama="" c,="" d="" i="" e="" viši="" nego="" u="" grupi="" b="" (𝑃="">< 0,05)="" (slika="" 10).="" takođe="" smo="" ispitali="">

ekspresija SCF, liganda kita. Ekspresija mRNA SCF kod pacova Grupe B bila je značajno niža nego u Grupi A, dok je tretman sa AEHC u Grupama C, D i E povećao ekspresiju SCF mRNA (Slika 10). Pored toga, ispitali smo efekat AEHC na ekspresiju PI3K gena. 14. dana, nivo ekspresije PI3K gena bio je značajno viši u grupama C, D i E nego u grupi B (𝑃 <>

4. Diskusija

Konstipacija je vrlo čest poremećaj koji karakterizira slabo pražnjenje crijeva. To uvelike umanjuje kvalitetu života i donosi velika ekonomska opterećenja kako pacijentima tako i nacionalnom zdravstvenom osiguranju [32]. Prirodni proizvodi i medicinska hrana sada privlače sve veću pažnju zbog svog potencijala da postanu novi lijekovi koji se koriste za liječenje zatvora [37, 38]. Stoga smo proučavali terapijske efekte AEHC-a na pacove sa zatvorom izazvanim loperamidom. Loperamid, atropin-difenoksilat i morfin se široko koriste za izazivanje zatvora kod laboratorijskih životinja. Među tri lijeka, loperamid izaziva produženo trajanje evakuacije stolice i kašnjenje intestinalnog luminalnog tranzita, budući da inhibira i lučenje vode i glatko kretanje u crijevnom zidu [39]. Analiza tjelesne težine u ovoj studiji nije pronašla nikakvu razliku unutar svake grupe. Ni nakon eksperimenta nije pronađena nikakva razlika. Grupa sa niskim dozama AEHC-a i dalje je imala najnižu tjelesnu težinu, ali grupa modela i normalna grupa su bilježile najveću tjelesnu težinu. Opstipacija je općenito funkcionalna bolest. Sporo tranzitna konstipacija izazvana u ovoj studiji nije utjecala na unos nutrijenata pacova i njihovu tjelesnu težinu tokom eksperimenta. Razlike u količini fecesa pacova i njihovom sadržaju vlage nisu postojale između grupa prije modeliranja; međutim, oba su se značajno smanjila nakon modeliranja, a sadržaj vlage u fecesu se povećao nakon upotrebe AEHC-a u različitim dozama. Nakon proučavanja brzine potisnog gasa ugljičnog praha debelog crijeva.

pacova, model grupa je zabilježila očigledan pad stope, dok je ona ostala normalna u grupama sa niskim, srednjim i visokim dozama AEHC-a. Rezultati su pokazali da hronična tranzitna konstipacija izazvana loperamidom, liječena različitim dozama Herba Cistanche, može u različitim stupnjevima povratiti pogonsku funkciju debelog crijeva. Gastrointestinalni hormoni su visokoučinkovite bioaktivne tvari koje luče endokrine stanice gastrointestinalne sluznice i pankreasa, a imaju efekte ekscitacije i inhibicije za regulaciju gastrointestinalne motoričke funkcije [40, 41], od kojih GAS, MTL i SS imaju glavne efekte. Prva dva hormona stimulišu lučenje probavnog soka, sužavaju glatke mišiće gastrointestinalnog trakta, podstiču kretanje gastrointestinalnog sadržaja i pobuđuju motoriku gasa. SS, naprotiv, inhibira lučenje probavnog soka, kontrakciju glatkih mišića gastrointestinalnog trakta i gastrointestinalno pražnjenje [42]. Utvrđeno je da su nivoi GAS i MTL u tkivu debelog crijeva modelne grupe najniži, što ukazuje da je metoda modeliranja sigurno snizila koncentraciju GAS i MTL u tkivu debelog crijeva. Kao glavni gastrointestinalni hormoni motiliteta debelog crijeva, koncentracija GAS-a i MTL-a se povećava s različitim dozama AEHC-a i time pojačava motilitet debelog crijeva. Nasuprot tome, nivo SS u tkivu debelog creva u grupi modela bio je najviši, što ukazuje da metoda modeliranja može povećati koncentraciju SS u tkivu debelog creva. CGRP je jedan od najmoćnijih vazodilatatora i njegov efekat opuštanja je 10-puto jači od efekta kontrakcije. Kao važan neurotransmiter ili neuromodulator koji regulira probavne funkcije, CGRP može inhibirati većinu gastrointestinalnog motiliteta i lučenje različitih probavnih sokova [43]. Koncentracija CGRP u grupi modela bila je viša od grupe A, što ukazuje da metoda modeliranja može povećati koncentraciju CGRP u tkivu debelog crijeva, što također može biti jedan od faktora smanjene peristaltike debelog crijeva koja će rezultirati zatvorom. Koncentracija CGRP u tkivu debelog crijeva AEHC grupa bila je niža od one u modelnoj grupi, što sugerira da je AEHC imao relativno slab inhibitorni učinak na kretanje debelog crijeva. c-Kit je transmembranski protein. Faktor matičnih ćelija (SCF) njegovog liganda proizvode neuronske ćelije i ćelije glatkih mišića. Promoviše razvoj i diferencijaciju ICC-a i održava njegovu normalnu fiziološku funkciju. C-Kit označavanje indirektno odražava količinu i gustinu ICC-a [44, 45]. Osim toga, ICC stanica igra ključnu ulogu u regulaciji gastrointestinalnog motiliteta i djeluje kao pejsmejker gastrointestinalnog pokreta. Dakle, kod nekih poremećaja motiliteta gasnog trointestinalnog sistema može doći do smanjenja količine i funkcije ICC ćelija. Prema prethodnim studijama, smanjen je broj ćelija u debelom crijevu pacijenata s kroničnom tranzitnom konstipacijom. Stoga je ova studija promatrala ćelije debelog crijeva pacova korištenjem specifične ekspresije i imunohistohemijskih tehnika. U poređenju sa normalnom grupom, broj ćelija u modelnoj grupi se značajno smanjio, ali se povećao nakon tretmana. Studija je pokazala da su ICC ćelije i faktori matičnih ćelija (SCF) usko povezani sa c-kit/SCF signalnim putem. SCF je prirodni ligand c-kita eksprimiran u različitim tkivima tijela, ali uglavnom

koju proizvode stromalne stanice u koštanoj srži. Svaki c-kit monomer se kombinuje sa SCF kroz ekstracelularne domene 1-3. Nakon SCF dimerizacije, struktura c-kit monomera se mijenja i proizvodi homodimerizaciju, što zatim rezultira autofosforilacijom aminokiselinskih ostataka u ćelijskoj membrani i stimulira različite druge signalne molekule da regulišu ćelijske funkcije ICC. Drugi signalni molekul je fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K), apolipoprotein koji pretvara 4,5- difosfoinozitid u 3,4,5-trifosfoinozitid kroz kombinaciju sa tirozinom 721 iz c-kita. Prethodna istraživanja su pokazala da su PI3K inhibitori Wortmannin i LY294002 doveli do abnormalnog razvoja ICC blokiranjem signala [46]. Naš eksperiment je otkrio da su se ekspresije c-kit i SCF proteina i mRNA u grupi modela u početku smanjile, ali su se zatim povećale u AEHC grupama različitih doza, iako na nivoima ispod normalnih. Ekspresija mRNA PI3K značajno se povećala. Stoga, SCF/c-kit može stupiti na snagu preko PI3K. Rezultati su pokazali da AEHC može regulisati glatke mišiće gastrointestinalnog trakta povećanjem količine ICC ćelija. Niska doza AEHC-a nije imala značajan uticaj na konstipaciju, dok je njegova srednja i visoka doza skratila vreme prve defekacije pacova, povećala sadržaj vlage u fecesu, poboljšala brzinu propelenta debelog creva, poboljšala količinu izmeta, povećala GAS , MTL i CCK nivoe, te ojačao kontraktilnost debelog crijeva. Efektivna doza AEHC je u početku 20 g/d nakon konverzije, što je ekvivalentno srednjoj i visokoj dozi u ovoj studiji.

5. Zaključci

AEHC promovira crijevnu pokretljivost poboljšavajući funkciju ICC i regulacijom neurotransmitera u ovoj studiji, što je dokazalo da AEHC ima potencijal za liječenje i prevenciju zatvora. Ekstrakti su poboljšali proizvodnju sporog talasa debelog creva i regulisali ritam kontraktivne aktivnosti SCF mRNA količina PI3K mRNA količina c-Kit mRNA količina12 Komplementarna i alternativna medicina glatkih mišića zasnovana na dokazima povećanjem količine ICC/SCFPI3K/SCFPI3K signalni put c-kita. Međutim, detaljnije eksperimentalne studije mogu poboljšati razumijevanje drugih molekularnih puteva AEHC u liječenju STC i pomoći u vođenju prospektivnih kliničkih studija koje procjenjuju njegove efekte i sigurnost.

Sukobi interesa

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Prilozi autora

Shuai Yan i Yin-Zi Yue podjednako su doprinijeli ovom radu. Svi autori su odobrili završni rad.

Priznanja

Ovaj rad je podržan grantom Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (NSFC) i finansiran od strane kineske vlade (81573979). Studija je takođe podržana od strane tehnološkog projekta Uprave za tradicionalnu kinesku medicinu provincije Jiangsu, Kina (br. YB2017061), Program naučnog i tehnološkog razvoja Suzhou, Kina (br. SYSD2015172), Projekat inovacija industrijske tehnologije Suzhou, Kina ( broj SYSD2016136, broj SYS201775 i broj SYS201776) i projekat College of Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kina (YQN2015007). Autori sa zahvalnošću zahvaljuju na finansijskoj podršci projekta koji finansira Kineska postdoktorska naučna fondacija (2017M620220).

Reference

[1] JY Chang, GR Locke, MA McNally, et al., "Uticaj funkcionalnih gastrointestinalnih poremećaja na preživljavanje u zajednici", American Journal of Gastroenterology, vol. 105, br. 4, str. 822–832, 2010. [2] SM Mugie, M. A Bennington i C. Di Lorenzo, "Epidemiologija opstipacije kod djece i odraslih: sistematski pregled," Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, vol. 25, br. 1, str. 18, 2011. [3] NC Suares i AC Ford, "Prevalencija i faktori rizika za hroničnu idiopatsku konstipaciju u zajednici: sistematski pregled i meta-analiza," American Journal of Gastroenterology, vol. 106, br. 9, str. 1582–1591, 2011. [4] A. Lembo i M. Camilleri, "Hronični zatvor," The New England Journal of Medicine, vol. 349, br. 14, str. 1360–1368, 2003. [5] S. Singh, S. Heady, E. Coss-Adame i SSC Rao, "Klinička korisnost kolonske manometrije kod konstipacije sporog prolaza", Neurogastroenterology & Motility, vol. 25, br. 6, str. 487–495, 2013. [6] DM Preston i JE Lennard-Jones, "Teška hronična konstipacija kod mladih žena: 'idiopatska spora tranzitna konstipacija," Gut, vol. 27, br. 1, str. 41–48, 1986. [7] P. Kashyap, PJ Gomez-Pinilla, MJ Pozo, et al., "Imunoreaktivnost za Ano1 otkriva iscrpljivanje Kit-pozitivnih intersticijskih ćelija Cajal-a kod pacijenata sa sporim tranzitnim zatvorom ," Neurogastroenterology & Motility, vol. 23, br. 8, str. 760–765, 2011. [8] JD Belsey, M. Geraint i TA Dixon, "Sistematski pregled i meta-analiza: Polietilen glikol kod odraslih s neorganskim zatvorom," International Journal of Clinical Practice, vol. . 64, br. 7, str. 944–955, 2010. [9] AC Ford i NC Suares, "Efekat laksativa i farmakoloških terapija u hroničnoj idiopatskoj konstipaciji: sistematski pregled i meta-analiza," Gut, vol. 60, br. 2, str. 209–218, 2011. [10] OM Aboumarzouk, T. Agarwal, R. Antakia, U. Shariff i RL Nelson, "Cisapride for intestinal constipation," Cochrane Database of Systematic Reviews, vol. 19, br. 1, str. CD007780, 2011. [11] MA Kamm, S. Muller-Lissner, NJ Talley, et al., "Tegaserod za ¨ liječenje hroničnog zatvora: randomizirana, dvostruko slijepa, placebom kontrolirana multinacionalna studija," American Journal of Gastroenterologija, vol. 100, br. 2, str. 362–372, 2005. [12] A. Shin, M. Camilleri, G. Kolar, P. Erwin, CP West, i MH Murad, "Sistematski pregled sa meta-analizom: visoko selektivna {{80} }HT4 agonisti (prukaloprid, velusetrag ili naronaprid) u hroničnoj konstipaciji," Alimentary Pharmacology & Therapeutics, vol. 39, br. 3, str. 239–253, 2014. [13] J.-H. Chen, Q. Zhang, Y. Yu et al., "Neurogena i miogena svojstva pan-kolonskih motornih obrazaca i njihova prostorno-vremenska organizacija kod pacova", PLoS ONE, vol. 8, br. 4, ID članka e60474, 2013. [14] VL Serebruany, ME Mouelhi, H.-J. Pfannkuche, K. Rose, M. Marro i DJ Angiolillo, "Istraživanja o ekspresiji 5-HT4 receptora i efektima tegaseroda na agregaciju trombocita kod ljudi in vitro," American Journal of Therapeutics, vol. 17, br. 6, str. 543–552, 2010. [15] HS Winter, C. Di Lorenzo, MA Benninga, et al., "Oralni prukaloprid kod djece sa funkcionalnom konstipacijom," Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, vol. 57, br. 2, str. 197–203, 2013. [16] A. Bove, F. Puccini, M. Bellini, et al., „Izjava o konsenzusu AIGO/SICCR: Dijagnoza i liječenje hroničnog zatvora i opstrukcije defekacije (I dio: Dijagnoza )," World Journal of Gastroenterology, vol. 18, br. 14, str. 1555–1564, 2012. [17] GL Lyford, C.-L. He, E. Soffer, et al., "Pan-colonic smanjenje intersticijskih ćelija Cajal kod pacijenata sa sporim prolazom opstipacije," Gut, vol. 51, br. 4, str. 496–501, 2002. [18] J.-P. Wang, G.-F. Ding i Q.-Z. Wang, "Kajalove intersticijske ćelije posreduju ekscitatornom simpatičkom neurotransmisijom u prostati zamorca", Istraživanje ćelija i tkiva, vol. 352, br. 3, str. 479–486, 2013. [19] W.-D. Tong, B.-H. Liu, L.-Y. Zhang, S.-B. Zhang, i Y. Lie, "Smanjenje intersticijalnih ćelija Cajal u sigmoidnom kolonu pacijenata sa sporim prolazom opstipacije," International Journal of Colorectal Disease, vol. 19, br. 5, str. 467–473, 2004. [20] D. Wu, X. Wang, J. Zhou, et al., "Tradicionalna kineska formula, pilula za podmazivanje crijeva, poboljšava konstipaciju kod pacova izazvanu loperamidom koja je uključena u povećanje Cl- sekrecija preko distalnog epitela debelog crijeva", Journal of Ethnopharmacology, vol. 130, br. 2, str. 347–353, 2010. [21] D.-Y. On i S.-M. Dai, "Anti-inflamatorni i imunomodulatorni efekti Paeonia lactiflora Pall., tradicionalnog kineskog biljnog lijeka," Frontiers in Pharmacology, vol. 2, član 10, 2011. [22] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao i C.-M. Tzeng, "Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Jedan od najboljih farmaceutskih darova tradicionalne kineske medicine," Frontiers in Pharmacology, vol. 7, član 41, 2016.