Abstract

Interes potrošača za proizvode kozmetičke industrije sa efektom posvjetljivanja kože povećao je potražnju za preparatima koji smanjuju melanogenezu. Brojni antimelanogeni lijekovi poznati su po svojim nuspojavama, kao što su kontaktni dermatitis i visoka toksičnost, te loša penetracija u kožu. Značajna nedavna istraživanja fokusirala su se na proizvode biljnog porijekla kao alternativu kemoterapijskim lijekovima s manje nuspojava.

U trenutnoj studiji ispitali smo antimelanogeno djelovanje ekstracelularnih vezikula (EV) ekstrahiranih iz lišća i stabljika patogena Dendropanaxa. Radeći sa spektrofotometrijskim i biokemijskim metodama, otkrili smo da ekstracelularne vezikule (LEV) iz lišća i ekstracelularne vezikule (SEV) izvedene iz stabljike smanjuju sadržaj melanina i aktivnost tirozinaze (TYR) na način ovisan o koncentraciji u ćelijskoj liniji melanoma B16BL6 miša. Elektronsko mikroskopska analiza je dalje pokazala da LEV i SEV izazivaju smanjenje sadržaja melanina u stanicama melanoma ovisno o koncentraciji. U poređenju sa arbutinom kao pozitivnom kontrolom, LEV i SEV su pokazali jači efekat izbeljivanja na ćelije melanoma, a efekat izbeljivanja LEV-a bio je jači. Značajno je da ni LEV ni SEV nisu izazvali značajnu citotoksičnost. Također smo ispitali efekte EV-a biljnog porijekla na ekspresiju proteina povezanih s tirozinazom (TRP) u stanicama melanoma. LEV su inhibirali ekspresiju gena i proteina povezanih s melanogenezom, uključujući transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF), TYR, TRP-1 i TRP-2. U ljudskom epidermalnom modelu, LEV-ovi su inhibirali melanogenezu jače od arbutina. Uzeti zajedno, naši podaci sugeriraju da bi lev iz patogena D. mogao biti nova prirodna supstanca kandidat za upotrebu kao antimelanogeno sredstvo u farmaceutskim preparatima.

ključne riječi:EV-ovi biljnog porijekla; LEVs andSEV; antimelanogen; TYRaktivnost; sadržaj melanina iPrednosti ekstrakta cistanchea

Kliknite ovdje da dobijeteprednosti Cistanchea za izbjeljivanje kožeiefekte ekstrakta Cistanchea

Uvod

Melanin, kritični dio pigmentacijskog sistema ljudske kose, očiju i kože, proizvode melanociti kroz proceduru koja se zove melanogeneza. Aberantno nakupljanje melanina može dovesti do poremećaja kože kao što su pjege, pjege od sunca i melazme, a također može uzrokovati rak i vitiligo. Regulacija melanogeneze je stoga vitalna strategija u liječenju hiperpigmentiranih poremećaja. Na primjer, hidrokinon, hidroksifenilni spoj koji ometa aktivnost TYR-a, koristi se kao sredstvo za izbjeljivanje kože u kozmetičkoj industriji. Ipak, hidrokinon može uzrokovati nuspojave kao što su kontaktni dermatitis i egzogena bolest posmeđivanja. Va-kiselina je još jedan sintetički agens koji inhibira aktivnost TYR-a, ali je njegova upotreba povezana s visokom učestalošću edema ili iritacije.

Postoji sve veći interes za identifikaciju alternativnih lijekova iz prirodnih izvora protiv melanogeneze, s obzirom na ograničenja postojećih kemijskih spojeva, što odražava činjenicu da su kozmetički proizvodi napravljeni od biljaka i bilja obično blaži, biorazgradiviji i pokazuju nižu toksičnost od sintetičkih. spojeva. Pokazalo se da ekstrakti listova dendrobium bolesti inhibiraju proizvodnju melanina direktnom interakcijom s intracelularnom aktivacijom TYR-a i ekspresijom enzima uključenih u biosintezu melanina. Na sličan način, ekstrakt lista Croton officinalis potisnuo je sadržaj melanina i ćelijsku aktivnost TYR inhibirajući transkripcijski faktor povezan s melanogenezom (MITF) i melanogene enzime. Osim toga, listovi duda su imali inhibitorni učinak na TYR aktivnost i stvaranje melanina u melan-A stanicama. P-kumarinska kiselina iz listova ginsenga identificirana je kao glavni inhibitor TYR.

Herba Cistanche

Unatoč činjenici da je širok spektar biljnih spojeva korišten u medicinskim kozmetičkim formulacijama, njihova niska topljivost, nizak ciljni afinitet i umjereno djelovanje posvjetljivanja kože ometaju napredak u poboljšanju terapijskih učinaka botaničke kozmetike. Ovo je motivisalo potragu za novim i progresivnim tehnikama za poboljšanje efikasnosti medicinskih i bioaktivnih jedinjenja i poboljšanje njihove efikasnosti u donošenju na kožu. Na primjer, uspješno su razvijene brojne nano-tehnologije, uključujući nano-lovely za efikasnu njegu kože, nano-quercetin za odlaganje oštećenja stanica uzrokovanih ultraljubičastim (UV) zračenjem, nano-fulerene za regeneraciju kolagena i prevenciju starenja kože , nano-luteolin za održavanje antioksidativne aktivnosti i nano-resveratrol za zaštitu kože od UV zračenja.

U ovoj studiji, mi se koncentrišemo na ulogu ekstracelularnih vezikula (EV) biljnog porekla. Nedavne studije su pokazale da EV-ovi biljnog porijekla imaju strukturu sličnu strukturi izolovanih egzosoma sisara i djeluju kao ekstracelularni glasnici koji posreduju međućelijsku komunikaciju. Pored toga, ove vezikule su sposobne da translociraju mRNA, mikro-RNA (miRNA), bioaktivne lipide i proteine ​​u životinjske ćelije.

U međuvremenu, proučavali smo inhibitorni efekat EV dobijenih iz listova i stabljika obolelih mahunarki na melanogenezu. Karakterizirali smo veličinu i svojstva ekstracelularnih vezikula (LEV) iz listova i ekstracelularnih vezikula iz stabljike (SEV) ekstrahiranih iz listova i stabljika oboljelih mahunarki i pokazali da ove EV lako preuzimaju stanice melanoma i da nisu citotoksične. Da bismo demonstrirali antimelanogene efekte LEV-a i SUV-a, ispitali smo sadržaj melanina i aktivnost TYR-a u stanicama melanoma. Dalje smo procijenili učinak EV na složeni proces sinteze melanina praćenjem promjena u razinama različitih proteina i enzima.

Hormon za stabilizaciju alfa-melanocita (-MSH) se vezuje za receptor melanokortina 1 (MC1R) na površini ćelije i aktivira adenilat ciklazu, što dovodi do povećanja intracelularnog nivoa cikličkog adenozin monofosfata (cAMP). cAMP je posredovan putem cAMP zavisne protein kinaze A, što dovodi do fosforilacije cAMP odgovornog elementa koji vezuje protein (CREB). Aktivirani CREB inducira MITF, koji se izražava u melanocitima i igra ključnu ulogu u diferencijaciji i razvoju melanocita. -TRP1 je neophodan za ispravnu translokaciju TYR u sintezu melanina, a TRP2 igra važnu ulogu u katalitičkoj aktivnosti TRP u ranim fazama sinteze melanina. Ova tri interaguju u ćelijama melanoma (dopunska slika 1).

Pronašli smo smanjenu ekspresiju MITF-a u ćelijama melanoma tretiranim LEV-om, praćeno smanjenom ekspresijom TYR, TRP-1 i TRP-2, a elektronskim mikroskopom je potvrđeno da je sinteza melanina smanjena u ovim ćelijama na ultrastrukturni nivo. Dalje smo potvrdili anti-melanogeni učinak LEV-a korištenjem rekonstruiranog humanog epidermalnog modela. Da bismo kvantitativno procijenili inhibitorni učinak LEV-a na sintezu ćelijskog melanina, pripremili smo standardne otopine iz tkiva i izmjerili sadržaj melanina pomoću kolorimetra. melaninske mrlje su smanjene u Fontana-Masson-ovom obojenom tkivu. LEV-ovi su inhibirali proizvodnju melanina efikasnije od TYR inhibitora arbutina, koji je korišten kao pozitivna kontrola.

Ukratko, ovi nalazi ukazuju na to da je upotreba električnih vozila iz prirodnih supstanci za upravljanje hiperpigmentacijom izvodljiv budući pristup za farmaceutsku industriju. Nadalje, s prednostima male veličine, niske toksičnosti, visokog unosa i sigurnosti okoliša, očekuje se da će električni pogoni biljnog porijekla biti sljedeća generacija terapijskih sistema za isporuku za liječenje drugih bolesti. Značajno je da EV-ovi biljnog porijekla imaju dobre antimelanogene efekte na rekonstruirano ljudsko tkivo kože (slično ljudskom epidermu), postavljajući teren za buduća klinička ispitivanja.

Cistanche dodatak

materijali i metode

1. Izolacija D. morbifera LEV i SUV vozila

Svježe lišće i stabljike sakupljeni su sa otoka Poge, Guandao-guna i Jeollanam-doa. EV su izolovane iz 50 g listova i stabljike, respektivno, mljevenjem pomoću ekstraktora i propuštanjem dobivenog soka kroz filter papir, te centrifugiranjem na 10,000 × g 10 min. Veliki ostaci su uklonjeni filtriranjem supernatanta kroz membranu od 0,22 μm, nakon čega je uslijedilo centrifugiranje pomoću Amicon Ultra-4 PL 100 K filtera za centrifugu (Merck Millipore. Darmstadt, Njemačka) da se koncentriraju EV centrifugiranjem uzoraka na 5000 × g 10 minuta na 4 stepena. Nakon centrifugiranja, koncentracija proteina EV je određena korištenjem kompleta za analizu proteina bis kinolinske kiseline (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD).

2. Karakterizacija veličine izolovanih električnih vozila

Hidrodinamička veličina izolovanih EV-a izmjerena je dinamičkim raspršivanjem svjetlosti (DLS), tehnikom koja se koristi za određivanje raspodjele veličine malih čestica u suspenziji, koristeći Zetasizer Nano ZS90 sistem (Malvern Instruments, Malvern, UK). Prikupljena vozila stavljena su u ćeliju sa konstantnom temperaturom na 20 stepeni. Raspodjela veličine čestica i z-prosjek korišteni za određivanje hidrodinamičke distribucije veličine čestica određeni su mjerenjem autokorelacijske funkcije intenziteta raspršenja. Izolovani EV razrijeđeni su vodom bez mjehurića i zatim podvrgnuti analizi praćenja nanočestica (NTA) (Nanosight; korištenjem lasera od 488 nm na 25 stepeni).

3. Transmisiona elektronska mikroskopska analiza EV

5 μL rastvora uzorka je stavljeno na karbonski film obložen bakrenom mrežom za analizu transmisijskom elektronskom mikroskopom (TEM). Nakon adsorpcije uzorka u trajanju od 1 min, rešetke su isprane s kapljicom čiste vode i zatim negativno obojene 1 postotnim uranil acetatom 1 min. Višak mrlja je uklonjen filter papirom, a rešetke su osušene na zraku. Uzorci su snimljeni u fokusu između 0.8 - 1.5 μm pomoću JEM- 1400 Plus transmisionog elektronskog mikroskopa (JEOL Ltd., Tokio, Japan) opremljenog Lab6 pištoljem koji radi na 120 kV . Slike su snimljene pomoću UltraScan OneView CMOS kamere (Gatan, Pleasanton, Kalifornija, SAD).

Cistanche tubulosa

4. Priprema liposoma

Mješavine liposoma su pripremljene korištenjem omjera 95:5 (mol/mol) DMPC (1,2-stearoil-sn-glicerol-3-fosfoholin) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) sa DSPE-mPEG (1,2-stearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamin-[metoksi(polietilen glikol)- 2000] (Avantipolarni lipidi) za pripremu mješavine liposoma kao lipidnih membrana. hidrofobna fluorescentna boja 1,1-dioktadecil-3,3,3ʹ,3ʹ-tetrametilindokarbocijanin perklorat (DiI, Invitrogen, Waltham, MA, USA) pomiješana je sa EV, 725,49 ug DMPC, ugDSPE4 151. i 15 ug DiI. Nakon isparavanja organskog rastvarača, membrana koja je sadržavala smjesu lipida i DiI je hidratizirana s 1 mL fosfatnog pufera (PBS). Zatim su liposomi veličine 100 nm pripremljeni pomoću ekstrudera (Avanti Polar Lipidi).

5. Ćelijska kultura i testovi održivosti

B16BL6 ćelije melanoma uzgajane su u alfa-minimalnom esencijalnom mediju (alfa-MEM) koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma (Rocky Mountain Biologicals, Missoula, MT, SAD) i 1 posto penicilina/streptomicina (Lonza, Basel, Švicarska) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) u kulturi. Ćelije su inkubirane na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2. 100 μL B16BL6 ćelija melanoma je inokulirano u 96-ploče (5 × 104 ćelije/jažici) za testove vitalnosti ćelija. Nakon inkubacije od 24 h, ćelije su tretirane sa LEV i SEV u koncentracijama od 1, 5 i 10 µg/mL, respektivno, tokom 24 h. Koncentracije liposoma i arbutina bile su 10 µ g/mL i 70 µ g/mL, respektivno, za sve eksperimente. 10 µL EZ-Cytox reagensa (Daeil Lab Service, Seul, Koreja) je naknadno dodato u svaku jažicu. Ploče su inkubirane 1 h. Ploče su zatim lagano protresene i apsorbancija je zatim izmjerena na 450 nm pomoću enzimskog markera (BioTek, Winooski, VT, USA).

REFERENCE

[1] Meredith P, Sarna T. Fizička i hemijska svojstva eumelanina. Pigment Cell Res. 2006;19(6):572–594.

[2] Grimes PE. Melazma: etiološka i terapijska razmatranja. Arch Dermatol. 1995;131(12):1453–1457.

[3] Todd MM, Rallis TM, Gerwels JW, et al. Poređenje 3 lasera i tekućeg dušika u liječenju solarnih lentigine: randomizirano, kontrolirano, uporedno ispitivanje. Arch Dermatol. 2000;136(7):841–846.

[4] Kawalek AZ, Spencer JM, Phelps RG. Kombinirani ekscimer laser i lokalni takrolimus za liječenje vitiliga: pilot studija. Dermatol Surg. 2004;30(2):130–135.

[5] Bastiaens M, Ter Huurne J, Gruis N, et al. Gen receptora za melanokortin{1}} je glavni gen za pjege. Hum Mol Genet. 2001;10(16):1701–1708.

[6] Pillaiyar T, Manickam M, Jung SH. Smanjenje regulacije melanogeneze: otkrivanje lijekova i terapijske opcije. Drug Discov Today. 2017;22(2):282–298.

[7] Hu ZM, Zhou Q, Lei TC, et al. Učinci hidrokinona i njegovih glukozidnih derivata na melanogenezu i antioksidaciju: biološka sigurnost kao sredstva za izbjeljivanje kože. J Dermatol Sci. 2009;55(3):179–184.

[8] Westerhof W, Kooyers T. Hidrokinon i njegovi analozi u dermatologiji – potencijalni zdravstveni rizik. J Cosmet Dermatol. 2005;4(2):55–59.

[9] Picardo M, Carrera M. Novi i eksperimentalni tretmani hloazme i druge hipomelanoze. Dermatol Clin. 2007;25(3):353–362.

[10] Shin JW, Park KC. Trenutna klinička upotreba sredstava za depigmentaciju. Dermatol Sin. 2014;32(4):205–210.

[11] Chaita E, Lambrinidis G, Cheimonidi C, et al. Antimelanogena svojstva grčkih biljaka. Novo sredstvo za depigmentaciju od drveta Morus alba. Molekule. 2017;22(4):1–14.

[12] Park SA, Park J, Park CI, et al. Ćelijsko antioksidativno djelovanje i efekti izbjeljivanja ekstrakta listova Dendropanax morbifera. Microbiol Biotechnol Lett. 2013;41(4):407–415.

[13] Chatatikun M, Yamauchi T, Yamasaki K, et al. Antimelanogeno dejstvo listova Croton roxburghii i Croton sublyratus u -MSH stimulisanim B16F10 ćelijama. J Tradit Complement Med. 2019;9(1):66–72.

[14] Lee SH, Choi SY, Kim H, et al. Mulberoside F izoliran iz listova Morus alba inhibira biosintezu melanina. Biol Pharm Bull. 2002;25(8):1045–1048.

[15] Lim JY, Ishiguro K, Kubo I. P-kumarinska kiselina koja inhibira tirozinazu iz listova ginsenga. Phytother Res. 1999;13(5):371–375.

[16] Chanchal D, Swarnlata S. Nove pristupi u biljnoj kozmetici. J Cosmet Dermatol. 2008;7(2):89–95.

[17] Ganesan P, Choi DK. Trenutna primjena nano kozmetičkih preparata na bazi fito spojeva za terapiju ljepote i kože. Int J Nanomedicine. 2016;11 (11):1987–2007.

[18] Takahashi M, Kitamoto D, Asikin Y, et al. Lipozomi koji sadrže ekstrakt gela listova Aloe vere značajno povećavaju proliferaciju i sintezu kolagena u ćelijskim linijama ljudske kože. J Oleo Sci. 2009;58(12):643–650.

[19] Bose S, Du Y, Takhistov P, et al. Optimizacija formulacije i lokalna dostava kvercetina iz nanosistema na bazi čvrstih lipida. Int J Pharm. 2013;441(30):56–66.

[20] Ngan CL, Basri M, Tripathy M, et al. Intervencija nanoemulzije integrirane fulerena u strukturnoj i regeneraciji kolagena protiv starenja kože. Eur J Pharm Sci. 2015;70(5):22–28.

[21] Mitri K, Shegokar R, Gohla S, et al. Lipidni nanonosači za dermalnu dostavu luteina: priprema, karakterizacija, stabilnost i performanse. Int J Pharm. 2011;414 (1–2):267–275.

[22] Juškaitė V, Ramanauskienė K, Briedis V. Dizajn i formulacija optimiziranih mikroemulzija za dermalnu dostavu resveratrola. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:1–10.

[23] Zhang M, Viennois E, Xu C, et al. Jestive nanočestice biljnog porijekla kao novi terapijski pristup protiv bolesti. Tissue Barriers. 2016;4(2):1–9.

[24] Criton M, Le Mellay-Hamon V. Analogi N-hidroksi-N'-feniltiouree i N-hidroksi-N'-fenil uree kao inhibitori formiranja tirozinaze i melanina. Bioorg Med Chem Lett. 2008;18 (12):3607–3610.

[25] Kobayashi T, Hearing VJ. Direktna interakcija tirozinaze sa Tyrp1 za formiranje heterodimernih kompleksa in vivo. J Cell Sci. 2007;120(24):4261–4268.

[26] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. Signalni putevi u melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.

[27] Fang D, Tsuji Y, Setaluri V. Selektivna down-regulacija gena TYRP1 porodice tirozinaze inhibicijom aktivnosti melanocitnog transkripcionog faktora, MITF. Nukleinske kiseline Res. 2002;30(14):3096–3106.

[28] Oh MJ, Hamid MA, Ngadiran S, et al. Ekstrakt Ficus deltoidea (Mas cotek) pokazao je antimelanogenu aktivnost sprečavanjem aktivnosti tirozinaze in vitro i supresijom ekspresije gena tirozinaze u B16F1 ćelijama melanoma. Arch Dermatol Res. 2011;303(3):161–170.

[29] Jang EJ, Shin Y, Park HJ, et al. Anti-melanogena aktivnost fitosfingozina putem modulacije signalnog puta transkripcionog faktora povezanog sa mikroftalmijom. J Dermatol Sci. 2017;87(1):19–28.

[30] Toyofuku K, Wada I, Valencia JC, et al. Okulokutani albinizam tipa 1 i 3 su bolesti retencije ER: mutacija tirozinaze ili Tyrp1 može uticati na procesiranje mutantnih i divljih proteina. Faseb J. 2001;15:2149–2161.

[31] Xue L, Li Y, Zhao B, et al. TRP-2 posreduje u pigmentaciji boje dlake kod ovčje kože. Mol Med Rep. 2018;17:5869–5877.

[32] Mu J, Zhuang X, Wang Q, et al. Komunikacija među vrstama između stanica domaćina biljnog i mišjeg crijeva putem jestivih nanočestica sličnih egzosomima iz biljaka. Mol Nutr Food Res. 2014;58(7):1561–1573.