N-hidroksicinamoilfenalkilamidi (36H) su pokazali i antioksidativne i antitirozinazne sposobnosti. Jedinjenje je proučavano zbog njegovih antioksidativnih svojstava, korištenjem testa uklanjanja 1,1-difenil-2-pikrilhidrazula- (DPPH-), testa antioksidativne snage koji reducira ione željeza (FRAP) i procjene metala test snage keliranja. Rezultati su pokazali da 36H ima antioksidativna svojstva u ispitivanjima snage uklanjanja DPPH i redukcije željeza, ali test snage heliranja nije pokazao antioksidativnu sposobnost. 36H je također mjerena za inhibitornu aktivnost tirozinaze primjenom različitih platformi vrsta, uključujući in vitro gljive, B16F10 mišji melanom i ljudske melanocitne ćelije. U smislu in vitro supresije tirozinaze gljiva, 36H je obuzdao procese melanogeneze. Pretpostavlja se da je 36H blokirao aktivno mjesto tirozinaze kao kompetitivni inhibitor za tirozinazu pečuraka, stoga ne umanjujući vitalnost ljudskih normalnih ćelija melanocita. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qRT-PCR) i western blot otkrili su da 36H smanjuje RNA povezane s melanogenezom i proteine, uključujući proizvodnju pigmenta (MITF, tirozinaza, TRP-1 i TRP-2) , sazrevanje melanozoma (Rab27a) i transport melanozoma (Myo5a, MLPH i Mreg). Sve u svemu, 36H je pokazao biološke funkcije antioksidacije i supresije melanina, tako da je postojala mogućnost njegove primjene kao dodatak hrani ili sredstvo za izbjeljivanje kože.

Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka koja je poznata kao "čudobiljkakoji produžava život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite efekte kao nprantioksidans, protuupalno, iunapređenje imunološke funkcije. Mehanizam između cistanche ikožeizbjeljivanjeleži u antioksidativnom dejstvucistanche glikozidi. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijomtirozinkatalizirano od stranetirozinaza, i theoksidacijareakcija zahtijeva učešće kisika, tako da radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utiče na proizvodnju melanina. Cistanche sadržicistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijeluinhibiranje proizvodnje melanina.

Kliknite na dodatak Cistanche Tubulosa

Pitajte za više:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Uvod

Ljudska koža je najveći organ u ljudskom tijelu; održava tjelesne funkcije i sprječava gubitak vode, elektrolita i biomolekula. Koža se sastoji od epiderme, dermisa i hipoderme. Epidermis je dalje podijeljen na pet odvojenih slojeva: stratum corneum, stratum lucidum, stratum granulosum, stratum spinosum i stratum basale [1]. Osnovni sloj epidermisa, koji je povezan sa dermisom, je bazalni sloj koji sadrži melanocite. Melanociti imaju dendrite koji prenose melanin do keratinocita, koji određuju površinu kože zbog sadržaja melanina unutar ovih keratinocita [2].

Slobodni radikali se sastoje od atoma ili grupe atoma koji imaju jedan ili više nesparenih elektrona. Oni su uključeni u fiziološke, metaboličke i imunološke reakcije i funkcije prijenosa signala. Iako su dio normalnih zdravih biohemijskih procesa u tijelu, oni su također odgovorni za štetu. Reaktivne kisikove vrste (ROS) i razni slobodni radikali stimuliraju se stvaranjem superoksidnih aniona ili vodikovih peroksida. Ovo može uzrokovati zbrkanu razmjenu poruka, oštećenje staničnih membrana i oštećenje komunikacija ionskih stanica zbog peroksidacije lipida. Ovo utiče na intracelularne molekule koje sadrže SH grupe i delujuće proteine ​​i DNK [3]. Količina ROS-a je kontrolirana od strane sistema samoodbrane koji su u svom normalnom stanju posredovani antioksidansima, kao što su antioksidansi. To uključuje vitamin C, vitamin E ili glutation [4], koji uklanjaju slobodne radikale kako bi spriječili oštećenje stanica. Međutim, oni narušavaju ravnotežu stanja stanične oksidacije što rezultira previše ROS-a. Prethodne studije su pokazale da su mnoge degenerativne bolesti, poput starenja i raka, uzrokovane aktivnim vrstama kisika ili slobodnim radikalima. Antioksidativna svojstva upućuju na to da peroksidacija lipida unutar membrane melanocita povećava sadržaj intracelularnog glutationa, što može biti uzrok depigmentacije [5, 6].

Zatamnjenje kože, očiju i kose uzrokovano je sintezom melanina, pigmentiranog biopolimera koji se sintetizira u melanosomu melanocita. Melanin je zaštitni mehanizam od oštećenja UV zracima [7]. Kongenitalni geni mogu utjecati na boju kože, ali indukcija UV zračenja, upala i hormonske promjene uzrokuju da melanociti sintetiziraju više melanina. Ipak, prekomjerna proizvodnja melanina može izazvati poremećaje pigmenta, kao što su melazma, senilni lentigo, pjege i hiperpigmentacija [8]. Obično se liječe kozmetičkim ili farmaceutskim sastojcima koji sadrže komponente za izbjeljivanje kože. Iako su ovi elementi iz prirodnih izvora, samo se neki agensi koriste u kozmetici ili lijekovima zbog sigurnosnih razloga ili zabrinutosti za efikasnost izbjeljivanja. Melanogeneza uključuje vezivanje -melanocit-stimulirajućeg hormona za melanokortin-1, koji povećava ciklički adenozin monofosfat (cAMP) i aktivira faktore transkripcije povezane s mikroftalmijom (MITF) [9]. MITF pojačava ekspresiju melanogenog enzima, tirozinaze, koji ima važnu funkciju u hidroksilaciji L-tirozina u dihidroksifenilalanin (L-DOPA) i oksidaciji L-DOPA u dopakinon [10]. Medicinski i kozmetički tretmani sve više koriste inhibitore aktivnosti tirozinaze. Proizvodnja melanogeneze i prijenos melanozoma iz melanocita u keratinocite neophodni su za obojenje kože [11]. Melanozomi su vezani za aktinski citoskelet na periferiji melanocita preko tripartitnog kompleksa formiranog od Ras-srodnog proteina Rab-27 (Rab27a), melanofilina (MLPH) i miozina Va (Myo5a). Rab27a je protein vezan za membranu uključen u transport proteina i malu transdukciju signala posredovanu GTPazom. Melanofilin formira ternarni kompleks s Rab27a na GTP-vezanom mjestu s Myo5a koji je motorni protein. Vidljiva pigmentacija sisara u kosi i koži je prema ovom kompleksu tri proteina za vezivanje organele koje proizvode pigment. Ako je kompleksni protein deficitaran, veza između F-aktina i melanosoma se razbija [12].

Unutar jedinjenja pozitivnog terapijskog potencijala, navodi se da N-hidroksicinamoilfenalkilamidi (36H) imaju inhibitorni efekat na ekspresiju matriksnih metaloproteinaza- (MMP-) 9 u THP-1, monocitnoj ćelijskoj liniji humane leukemije, koja je stimulirana faktorom tumorske nekroze- (TNF-) [7]. Prethodna studija je pokazala da je indukovana ekspresija TNF-a MMP-9 za nivoe proteina i mRNA bila potpuno inhibirana na način ovisan o koncentraciji (1-20 μM). Utvrđeno je da je 36H značajno potisnuo pojačivač gena za nuklearni faktor-κ svjetlosnog polipeptida u signalizaciji B stanica (NF-κB), što je otkriveno testom NF-κB reporter gena, ali nije imao utjecaja na degradaciju (nuklearni faktor κ svjetlosnog polipeptida pojačivač gena u inhibitoru B ćelija (IκB) ili translokacija NF-κB. Podaci o imunoprecipitaciji hromatina ilustriraju da je povezanost između MMP-9 i NF-κB p65 podjedinice (p65) promotor gena u potpunosti negirana 36H i fosfolacijom Općenito, prethodni izvještaj je pokazao da je 36H potisnuo lučenje MMP-9 nuklearno ciljanom regulacijom mehanizama puta NF-κB u THP-1. 36H je analog kofeinske kiseline fenetil ester (CAPE), koji je poznati supresor metastaza i invazije raka [14]. Proučavane su antioksidativne aktivnosti i uklanjanje slobodnih radikala nekih analoga CAPE, a rezultati tih studija potaknuli su ovu studiju da utvrdi da li se 36H smanjuje aktivnost tirozinaze i smanjena RNA i proteini povezani s melanogenezom. Ova studija otkriva da je 36H potencijalni i pozitivan antioksidans i sredstvo za izbjeljivanje kože.

2. Materijali i metode

2.1. Reagensi i materijali.Dimetil sulfoksid (DMSO) i L-tirozin su dobijeni od Sigma-Aldrich Chemical Inc. (St. Louis, MO, SAD). Dulbecco-ov modifikovani Eagleov medijum (DMEM) i fetalni goveđi serum (FBS) kupljeni su od Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, SAD). Svi reagensi i alternativni puferi su nabavljeni s najvećom komercijalnom čistoćom.

2.2. Hemijska sinteza 36H.36H je obezbijedio profesor Yueh-Hsiung Kuo, koji je koristio naknadne metode spajanja amida da bi dobio jedinjenja. Benzotriazol-1-iloksitris (dimetilamino)-fosfonijum heksafluorofosfat (BOP) je kombinovan sa mešavinom R2-NH2, R1-COOH i trietilamina (Et3N) u dimetilformamidu (DMF). Reakciona otopina je miješana 3{{1{{30}}} min na 0 stepeni C, a zatim miješana na 25 stepeni C 2 sata. Kada je hemijska tečnost isparila, ostatak je podeljen između H2O i etil acetata (AcOEt). Ostatak je zatim filtriran i prečišćen hromatografijom na koloni sa rastvorom za eluiranje (AcOEt–CH2Cl2, 1:1, v/v) na silika gelu (70–230 i 230–400 mesh, Merck 7734). Proizvodi su prekristalizirani iz AcOEt kako bi se dobili najbolji oksidativni lijek i ćelijska dugovječnost i najidealniji kristali. Finnigan TSQ-46C maseni spektrometar je korišten za masenu spektrometriju elektronskog udarca (EIMS). 1H i 13C NMR spektri su dobijeni pomoću Bruker Avance 500 spektrometra. Nicolet Magna-IR 550 spektrofotometar je snimio IR spektre. 36H je prvobitno rastvoren u DMSO rastvoru pre sledećih studija. Za svaki test je korišten DMSO sa konstantnom i konačnom koncentracijom od 0,2 posto (v/v). Ovaj spoj nije poznat kao antioksidans ili izbjeljivač kože [7, 13], a struktura je prikazana na slici 1. Uzorci su otopljeni u DMSO, a različite koncentracije su pripremljene sa konačnom koncentracijom DMSO manjom od 0,5 posto.

2.3. Analiza DPPH kapaciteta za uklanjanje radikala.DPPH je 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil, koji postaje tamnoljubičast kada ima slobodni radikal. Kada antioksidans ukloni radikal iz DPPH˙, on reducira DPPH˙ u stabilan DPPH, koji ima svijetložutu boju [14]. Različite doze 36H (2 μL ukupne zapremine) su kombinovane u 98 μL DPPH (60 μM) mešavine, a ploča je ispitana korišćenjem 517 nm enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA) spektroskopskog čitača. Kao pozitivna kontrola korištena je L-askorbinska kiselina. Omjeri rezidualnog DPPH su mapirani pored uzorka kako bi se odredila količina antioksidansa koja smanjuje prijašnju koncentraciju DPPH. Svojstvo čišćenja ( posto ) je određeno kao

2.4. Test smanjenja snage.Test antioksidativne snage koji smanjuje ione željeza (FRAP) se često primjenjuje za procjenu antioksidativne sposobnosti pića, hrane, voća i dodataka ishrani, uključujući flavonoide ili polifenole. Različite doze 36H su uvedene u mješavinu fosfatnog pufera od 67 mM (0.085 mL, pH 6,8) i 20 posto kalijum fericijanida [K3Fe(CN)6, 2,5 μL). Rastvor je reagovao 20 minuta na 50 stepeni C, a zatim je u rastvor dodana trihlorsirćetna kiselina (10 procenata, 0,16 mL) pre nego što je centrifugirana na 3000 g tokom 10 minuta [14]. Supernatant rastvora (75 μL) je kombinovan sa 2 procenta FeCl3 (25 μL), a zatim je ELISA spektroskopski čitač izmerio rezultujuću apsorbanciju na 700 nm, za ploču sa 96-jažicom. Kao pozitivna kontrola korišten je butilirani hidroksianizol (BHA). Što je veća redukciona kvalifikacija, to je jača apsorpcija.

2.5. Analiza aktivnosti keliranja metala.Potencijal željeza za heliranje klorofila izmjeren je tehnikom Chen et al. [14]. Ukratko, specifične doze uzoraka su rastvorene u DMSO i uvedene u mešavinu FeCl2·4H2O (2.0 mM, 0.05 mL). Dodatak ferozina (5 mM, 0,2 mL) je pokrenuo reakciju kada je rastvor snažno protresen, a zatim ostavljen 10 minuta na 25 stepeni C. Kada je reakcija dostigla ravnotežu, vrednosti apsorbancije za rastvor su određene na 560 nm korišćenjem prazno vozilo. EDTA je korištena kao pozitivna kontrola. Formula za izračunavanje aktivnosti keliranja bila je identična (1).

2.6. Analiza aktivnosti tirozinaze gljiva.I supresija aktivnosti tirozinaze u gljivama i inhibicija ćelijske tirozinaze su spektrofotometrijski određene prethodnom metodom, uz manje modifikacije [2]. Kojična kiselina je korištena kao pozitivna kontrola za analizu aktivnosti tirozinaze. Materijali su prvo rastvoreni u vodenom DMSO i kultivisani u L-tirozinu (2,5 mg/mL) sa fosfatnim puferom (50 mm, pH 6,8). Svi modeli su koristili DMSO, koji je irelevantan za aktivnost tirozinaze kada DMSO čini<0.5% of the total volume. Subsequently, 25 U/mL of mushroom tyrosinase with an identical buffer was then added, and the solution was incubated at 37° C for 30 min. An ELISA spectroscopic reader was used to conduct the absorbance measurements for the assays at 475 nm, using 96-well microplates (Molecular Devices, CA, USA).

2.7. Kulture ljudskih melanocitnih ćelija (HMC).Primarni humani epidermalni melanociti iz neonatalne kožice nabavljeni su od Cascade Biologics. Ovo su također primijenili Wang et al. [2]. Uzgajana je u medijumu 254 (M-254- 500; Cascade Biologics, Portland, OR, SAD) i poboljšana dodatkom za rast humanih melanocita (HMGS, kat. broj S-002-5). Medium 254 je bazalni medij sa nekim neesencijalnim i esencijalnim vitaminima, organskim jedinjenjima, aminokiselinama, neorganskim solima i mineralima u tragovima. Dodatak za rast ljudskih melanocita uključivao je fetalni goveđi serum, goveđi inzulin, ekstrakt goveđe hipofize, goveđi transferin, hidrokortizon, osnovni faktor rasta fibroblasta, forbol 12-miristat 13-acetat i heparin. Sve ćelije su inkubirane na 37 stepeni C u vlažnom inkubatoru sa atmosferom od 5 procenata CO2.

2.8. Određivanje vitalnosti ćelije HMC.Vijabilnost ćelija je određena pomoću MTT testa [3]. Kada se žuti tetrazol kombinuje sa mitohondrijalnom dehidrogenazom (ubikinon) u živim ćelijama, tetrazolijumski prstenovi MTT se cepaju i redukuju u ljubičasti formazan. Ćelije su zasijane u gustini od 9 × 103 ćelije/jažici u 96-ploče sa jažicom. Kada su ćelije kultivisane jedan dan, podloga je promenjena i različite koncentracije 36H su dodane u konačnu zapreminu medijuma od 100 μL. Nakon inkubacije 48 sati, medij je zamijenjen svježim medijumom (100 μL), uključujući MTT (0,5 mg/mL). Ploča je zatim kultivisana u inkubatoru na 37 stepeni C tokom 2 sata sa 5 procenata CO2. DMSO (100 μL) je zatim dodan u svaku jažicu da bi se rastvorili ljubičasti kristali formazana. Da bi se osiguralo da su posude postigle maksimalno otapanje, posude su lagano protresane i miješane u mraku 10 minuta i izmjerene na 595 nm. Rast ćelija je izračunat kao

2.9. Mjerenje aktivnosti tirozinaze iz HMC.Da bi se odredila aktivnost tirozinaze u ljudskim melanocitnim ćelijama (HMC) (5 × 104 ćelije po jažici), one su pozicionirane u 12- ploče u 1000 μL medijuma sa različitim dozama 36H i kultivisane 48 sati [2] . PBS pufer je korišten za pranje ćelija tretiranih uzorkom, a one su zatim lizirane sa 1 posto Triton X-100/PBS. Ekstrakt enzima je zatim sakupljen iz rezultirajućeg ćelijskog lizata i kombinovan sa 50 μL 2 mM L-tirozina. Ekstrakti su zatim inkubirani 3 sata na 37 stepeni C u mraku. Zatim je korišćen spektrofotometar za određivanje njihove apsorpcije na 490 nm.

2.10. Određivanje sadržaja melanina u HMC.Uz neke manje modifikacije, prethodna tehnika je također korištena za ovaj eksperiment [2]. Ćelijske pelete su otopljene u 2.0 N NaOH sa 10 posto DMSO i grijane na 90 stepeni C 1 sat. Suspenzije su odvojene centrifugiranjem 10 min na 10,000g. Koristeći spektrofotometar, sadržaj melanina je određen na osnovu podataka dobijenih na nivou apsorbancije od 475 nm.

2.11. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu.Za qRT-PCR, reakcija od 20 μL sadržavala je 0.4 mL mješavinu dvije reverzne transkriptaze: 10 μL 2 × QuantiTect SYBR Green Master Mix (QIAGEN, Valencia , CA, USA) sa Taq polimerazom vrućeg starta, 0.8 mL prajmera i 0.5 mL (10 ng/mL) šablona. Sekvence prajmera su navedene u tabeli 1. StepOnePlus™ sistem je koristio za sve PCR testove u realnom vremenu. Reakcija je završena izvođenjem RT reakcije na 42 stepena C tokom 20 min, a zatim aktiviranjem FastStart Taq DNK polimeraze na 95 stepeni C tokom 5 minuta. Ovo je zatim pojačano za 40 ili 50 ciklusa na 95 stepeni C tokom 5 sekundi za denaturaciju, žarenje i akviziciju na 60 stepeni C tokom 5 sekundi. Konačno je produžen na 72 stepena C tokom 15 sekundi. Fluorescencija se može mjeriti i nakon faze elongacije, ali za ovaj eksperiment je mjerena nakon faze žarenja. Sa 96-pločom za jažice, 9 μL lizata je dodato u 11 μL reakcione mješavine, koja se sastojala od 10,6 μL MasterMixa iz Eurogentec qPCR core kita za SYBR Green I (1,4 μL 50 mM MgCl2, 2 μL 10x pufera za reakciju, 0,8 μL 5 mM dNTP mješavine, 0,6 μL SYBR Green I, 5,7 μL vode bez nukleaze i 0,1 μL vruće GoldStar Taq polimeraze), 0,1 μL MS2 RNA, 0,10 μL inhibitora RNK, 0,10 μL 0,1 μL REV prajmera (100 μM), kao i MS2 FWD za SG-PERT testove na ABI 7300 qPCR sistemu. Reakcija qRTPCR, aktivacija vrućeg enzima GoldStar Taq, 40-amplifikacija ciklusa, žarenje i akvizicija, denaturacija na 95 stepeni C i elongacija na 72 stepena C koristili su ABI 7300 instrument. Za pripremu testa, svi reagensi su držani ili na rashladnom bloku ili na ledu. Duplicirane SGPERT reakcije su izvedene na svakom uzorku lizata. Koristeći qPCR softver i instrumente, ABI 7300 sa svojim pragom utvrđenim ručno, i LightCycler® 480 sa svojom maksimalnom metodom druge derivacije, generisali su ciklus kvantifikacionih (Cq) vrednosti. Koristeći isti softver za oba instrumenta, pikovi topljenja su takođe automatski izračunati.

2.12. Western blotting.Ukupno 1 × 105 ćelija je tretirano grupama uzoraka ili kontrolnim slijepim nosačem dva dana. Ćelije su sakupljene i lizirane puferom za lizu (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 137 mM natrijum hlorida, 50 mM natrijum L fluorida, 10 mM natrijum pirofosfata, 20 mM - gliceropilmetil fluora i fluora , 1 mM EDTA, 10 posto glicerola, 1 posto Nonidet P-40, 2 μM leupeptina, 0,1 mM natrijum ortovanadata i 2 ug/mL aprotinina) [14]. Lizati su centrifugirani na 20,000 × g tokom 30 minuta, a koncentracije proteina u rastvoru supernatanta su određene pomoću kompleta za analizu proteina bicinhoninske kiseline (BCA) (Pierce, Rockford, IL, USA). Jednake količine proteina su odvojene elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela (SDS-PAGE), a zatim su elektrotransferirane na nitroceluloznu membranu (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, SAD). Membrana je blokirana 1 sat sa 5 posto nemasnog mlijeka u PBS-T puferu (PBS koji sadrži 0,1 posto Tween 20). Transfer film je pažljivo uklonjen iz rezervoara za mokri transfer i polusuvog otvora za transfer i stavljen u kutiju koja je sadržavala 5 posto obranog mlijeka u 1x TBST na 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je nježno ispran sa 1x TBST kako bi se uklonili tragovi obranog mlijeka. Membrana je zatim inkubirana sa odgovarajućim primarnim antitelima. U svakom slučaju, membrane su inkubirane sa antitelom zeca ili miša konjugovanim s peroksidazom hrena, a zatim tretirane reagensima za detekciju ECL (PerkinElmer, ECL1: ECL2=1: 1). Za mjerenje za detekciju traka korišten je hemiluminiscentni sistem za snimanje male veličine iz Life Science [14].

2.13. Statistička analiza.Korišteno je po tri od svake koncentracije za standard i uzorke. Koristeći Studentov t-test, rezultati su statistički upoređeni i izraženi pomoću prosjeka srednjih vrijednosti ± standardna devijacija (SD).

3. Rezultati

3.1. DPPH aktivnost uklanjanja slobodnih radikala.ROS može stvoriti lipidne perokside, oštećenje DNK, ekspresiju proteina, starenje tkiva i nastanak raka kada je poremećena ravnoteža između slobodnih radikala i inherentnih antioksidansa. Lančane reakcije slobodnih radikala se blokiraju neutralizacijom donacija ili prihvatanja elektrona i keliranjem slobodnih usamljenih parova. Smanjenje oksidativnog stresa iz unutarnjih i vanjskih aspekata jedan je od načina za poboljšanje zdravlja. Ova studija je ispitala antioksidativna svojstva, određujući moć redukcije željeza, kapacitet uklanjanja slobodnih radikala DPPH i moć heliranja metala. Povećano stvaranje i akumulacija ROS-a dovodi do oksidacije lipida u hrani i kozmetici i prirodnog antioksidativnog djelovanja. Posebno su svojstva uklanjanja slobodnih radikala vitalna u funkcionalnim aditivima za ishranu i proizvodima za njegu kože.

Prvi test inhibitora oksidacije bio je DPPH test uklanjanja slobodnih radikala. Ovo je jednostavna i ekonomična eksperimentalna platforma u kojoj antioksidansi djeluju kako bi spriječili produkte oksidacije. Antioksidansi mijenjaju boju stabilnog radikalnog DPPH reagensa iz ljubičaste u svijetložutu difenil-pikrilhidrazina. Da bi se odredila antioksidativna svojstva 36H, primijenjena je doza od 100 μM za određivanje sposobnosti čišćenja. Tabela 2 pokazuje da je 36H pokazao odličnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala i uklanja 60 posto slobodnih radikala DPPH, a vitamin C u istoj koncentraciji (100 μM) uklanja 85,3 posto.

3.2. Moć antioksidansa za smanjenje željeza.Drugi test inhibitora oksidacije je test snage redukcije željeza, koji je uobičajen i pouzdan način mjerenja sinteze Fe(III)-fericijanidnog kompleksa. Funkcionalni agens reducira komplekse Fe3 plus/fericijanida u željezni oblik. Ova kombinacija je imala plavu boju na 7{{10}}0 nm jer je K4Fe(CN)6 reagovao sa Fe3 plus da bi se formirao Fe[Fe(CN)6]3. U eksperimentu se boja otopine mijenjala od svijetlo žute do različitih nijansi plave i zelene, ovisno o redukcijskoj moći ciljnog spoja. Tabela 2 prikazuje da je BHA na 100 μM imao vrijednost redukcijske snage od 0,95, a 36H na 100 μM imao je vrijednost redukcijske snage od 0,85 u poređenju sa BHA. Stoga se pokazalo da 36H ima dobru antioksidativnu moć koja smanjuje željezo.

3.3. Kapacitet heliranja željeznih jona.Kelatna aktivnost za željezne jone 36H prikazana je u Tabeli 2. EDTA (100 μM) je korištena kao pozitivna kontrola. Fe2 plus i ferozin kvantitativno formiraju komplekse. Formiranje kompleksa reagensa je često poremećeno, zbog helirajućih agenasa, što rezultira smanjenjem crvene boje kompleksa. 36H u dozi od 10 μM nije imao značajan uticaj na Fe2 plus kapacitet čišćenja, a pri koncentraciji od 100 μM predstavljao je 43,2 posto inhibicije. Pozitivna kontrola, EDTA, imala je otprilike 80 posto kapaciteta heliranja jona na 100 μM.

3.4. Učinak 36H na aktivnost tirozinaze gljiva.Inhibicija aktivnosti tirozinaze opisana je u brojnim izvještajima, od kojih je većina koristila tirozinazu gljiva kao model. Prednosti koje su naučnici dobro razvili, jednostavne procedure, niska cena, brz proces pigmentacije, slične strukturne i funkcionalne karakteristike kao kod sisara i pogodnost u posmatranju razvoja melanina. Proučavana je inhibicija aktivnosti tirozinaze gljiva od strane 36H, a inhibitorna sposobnost je imala pozitivnu korelaciju sa koncentracijom 36H (Slika 2(a)). U petnaestoj minuti se vidjelo da 36H u različitim koncentracijama (1, 5 i 10 mM) u odnosu na kontrolu smanjuje OD vrijednosti. Aktivnost enzima se smanjuje za oko 10 posto na 1 mM, 30 posto na 5 mM i 40 posto na 10 mM, u poređenju sa kontrolnom vehikulumom (slika 2(b)). Proučavana je veza između aktivnosti tirozinaze i njene koncentracije u 36H. Različite koncentracije inhibitora daju grupu linija koje sve prolaze kroz ishodište. Inhibicija aktivnosti tirozinaze od strane 36H nije uticala na količinu enzima, što je ilustrovalo da je 36H bio reverzibilni inhibitor (slika 2(c)). Tip inhibicije tirozinaze od strane 36H potvrđen je korištenjem Lineweaver-Burk dvostruke recipročne grafike. Grafike 1/v naspram 1/[s] dale su familiju pravih linija kroz ishodište, što je predstavljalo da je 36H kompetitivni kompleks. Kinetika enzima prikazana je na slici 2(d).

3.5. Efekat vitalnosti ćelije, ćelijske tirozinaze i sadržaja melanina na 36H u HMC.Kao snažno jedinjenje za posvjetljivanje kože, komponenta bi trebala biti bezopasna, bez neželjenih citotoksičnih nuspojava. Postoje neki dobro poznati inhibitori sinteze melanina, uključujući kojičnu kiselinu, arbutin, PTU ili hidrokinon, koji se trenutno koriste globalno kao kozmetički sastojci. Također smo otkrili da ovi melanogeni inhibitori mogu inducirati tumorigenost ljudske kože u dozama visoke koncentracije ili čestoj upotrebi [2]. HMC je kultivisan u 36H tokom 48 sati pri različitim koncentracijama od 1, 5, 10 i 25 μM, a utvrđeno je da vitalnost ćelije pokazuje nisku ćelijsku toksičnost na slici 3(a). Kada smo razmatrali sredstvo za terapeutsku ili kozmetičku upotrebu kod ljudi, otkrili smo da su citotoksične posljedice na vitalnost ljudskih dermalnih stanica bile beznačajne. Da bismo razumjeli inhibitorni učinak 36H na melanogenezu, procijenili smo aktivnost intracelularne tirozinaze u HMC. Rezultati za aktivnost tirozinaze u HMC su pokazali da postoji očigledna varijacija kako se koncentracija povećava, a aktivnost tirozinaze smanjuje zbog niske toksičnosti ćelija. Nakon tretmana, aktivnost tirozinaze je smanjena na 39 ± 2,2 posto pri 25 μM na način ovisan o dozi (slika 3(b)). Ovi rezultati su pokazali da 36H inhibira aktivnost intracelularne tirozinaze. Rezultati analize melanina jasno su pokazali da 36H smanjuje sadržaj melanina u HMC na način ovisan o dozi (slika 3(c)). Procenat kontrole predstavlja sadržaj melanina. Nakon tretmana, sadržaj melanina bio je 77 posto na 25 μM, 84 posto na 10 μM, 88 posto na 5 μM i 90 posto na 1 μM. Ovi rezultati su pokazali da 36H ima značajan inhibitorni efekat na sintezu melanina u HMC na 25 μM.

3.6. mRNA i proteini povezani s biosintezom melanina bili su pod utjecajem 36H u HMC.Biosinteza melanina se odvija u melanosomima, a početni supstrat aminokiselina je tirozin. Tirozin se prvo katalizira do L-DOPA preko tirozinaze, a korištenjem istog enzima, tirozinaze, DOPA se katalizira u dopakinon. Dopahinon je kataliziran dopahrom tautomerazom (protein povezan s tirozinazom- 2, TRP-2), TRP-1 i tirozinazom da nastane eumelanin. U HMC-u, 36H je smanjio RNA i proteine ​​povezane sa ćelijskom melanogenezom kao što je prikazano na slici 4.

3.7. Utjecaj 36H na sazrijevanje melanozoma.Melanosom je organela koja se oslanja na sintezu melanina unutar melanocita. Što melanosomi više sazrijevaju, to se više melanina stvara. Stoga je sazrijevanje melanozoma važno u mehanizmu izbjeljivanja kože. Premelanosomski protein 17 (Pmel17) je usmjeren na prekursore pigmentne organele, melanosoma, gdje se proteolitički obrađuje u nekoliko malih fragmenata. Neki od ovih fragmenata formiraju nepatološke amiloide koji se sastavljaju u listove i formiraju prugasti uzorak koji leži u osnovi ultrastrukture melanoma. Ova studija je pokazala da 36H smanjuje ekspresiju Pmel17 RNK i proteina u HMC (Slika 5).

3.8. Utjecaj 36H na transport melanozoma.Rab27a, MLPH i Myo5a formiraju tri-proteinski kompleks za vezanje melanozoma na periferiji melanocita. U procesu transporta melanosoma, ternarni kompleks je veza između aktinskog citoskeleta i melanosoma. Nedostatak ovih proteina utječe na transport, a melanoregulin (Mreg) pokreće prijenos melanosa iz melanocita u keratinocite putem reguliranog mehanizma izlučivanja. Ova studija je ilustrovala da 36H smanjuje transport melanosoma utječući na ovu srodnu RNK i proteine ​​(Slika 6).

Zatražite više: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501