Priprema kompleksa ferulinske kiseline i fosfolipida za poboljšanje rastvorljivosti, rastvaranja i aktivnosti inhibicije ćelijske melanogeneze B16F10

Abstract

Pozadina

Ferulična kiselina(FA; 4-hidroksi-3-metoksi cimetna kiselina) prisutna je u mnogim namirnicama, uključujući pšenicu, pirinač, ječam, zob, citrusno voće i paradajz [1]. Pokazalo se da FA pruža značajnu zaštitu kože od oksidativnog stresa izazvanog UV zrakama [2]. Vraća hronična UVB-indukovana oksidativna oštećenja kod tumora kože miševa modulacijom ekspresije vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), inducibilne sintaze dušikovog oksida (iNOS), faktora tumorske nekroze (TNF)- i interleukina (IL){{7} } [3]. Također modulira ekspresiju mutiranog p53, Bcl-2 i Bax kod tumora kože miševa izazvanih UVB zrakama [4]. Nekoliko studija je utvrdilo da FA inhibira ekspresiju citotoksičnih enzima i enzima povezanih s upalom [5] i matriksnih metaloproteinaza (MMP), te ublažava degradaciju kolagenih vlakana [6].

Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka poznata kao "čudotvorna biljka koja produžava život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite učinke kao što su antioksidans, protuupalni i promocija imunološke funkcije. Mehanizam izmeđucistancheiizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom dejstvu cistanche glikozida. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju katalizira tirozinaza. Reakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, tako da radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utiče na proizvodnju melanina.Cistanchesadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, čime inhibira proizvodnju melanina.

Osim toga, cistanche također ima funkciju promicanja proizvodnje kolagena, koji može povećati elastičnost i sjaj kože i pomoći u obnavljanju oštećenih stanica kože. Cistanche feniletanol glikozidi imaju značajan efekat smanjenja aktivnosti tirozinaze, a pokazalo se da je efekat na tirozinazu kompetitivna i reverzibilna inhibicija, što može pružiti naučnu osnovu za razvoj i korištenje sastojaka za izbjeljivanje u Cistancheu. Stoga cistanche ima ključnu ulogu u izbjeljivanju kože. Može inhibirati proizvodnju melanina kako bi se smanjila promjena boje i tupost; i podstiču proizvodnju kolagena za poboljšanje elastičnosti i sjaja kože. Zbog široko rasprostranjenog prepoznavanja ovih učinaka cistanchea, mnogi proizvodi za izbjeljivanje kože počeli su da sadrže biljne sastojke kao što je Cistanche kako bi zadovoljili potražnju potrošača, čime se povećava komercijalna vrijednost Cistanchea uproizvodi za izbjeljivanje kože. Ukratko, uloga cistanche uizbjeljivanje kožeje presudno. Njegov antioksidativni učinak i učinak proizvodnje kolagena mogu smanjiti promjenu boje i tupost, poboljšati elastičnost i sjaj kože, te tako postići učinak izbjeljivanja. Također, široka primjena Cistanchea u proizvodima za izbjeljivanje kože pokazuje da se njegova uloga u komercijalnoj vrijednosti ne može potcijeniti.

Kliknite na Cistanche za izbjeljivanje

Pitajte za više:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Fosfolipidni kompleksi se široko koriste u farmaceutskoj industriji. Imaju dobru propusnost i sigurnost te im se posvećuje sve veća pažnja za primjenu u kozmetici. Budući da su fosfolipidi biofunkcionalni surfaktanti sa dobrim svojstvima solubilizacije, mogu se koristiti kao sistemi nosača za manje rastvorljive lekove [7], poboljšavajući transdermalnu permeaciju i kumulativnu stopu penetracije lokalnih lekova [8]. Transdermalna permeacija lijekova uključuje otapanje, distribuciju i difuziju u kožu. Fizička i hemijska svojstva, posebno koeficijent raspodjele ulje-voda lijeka koji se primjenjuje, utiču na ovaj proces [9].

Metode

Materijali

Ćelijska kultura

Priprema FA–PC isparavanjem rastvarača

Skrining za optimalni udio ferulne kiseline i fosfolipida

FA i fosfolipidi u molarnim omjerima od 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 i 1:4 dodani su u tikvice s okruglim dnom od 100 mL i otopljeni u bezvodnom etanolu (FA, 2,0 mg/mL). Smeše su stalno mešane na 40 stepeni tokom 1 h, a zatim je bezvodni etanol uklonjen rotacionim isparavanjem. Osušeni kompleksi FA–PC stavljeni su u eksikator na 24 h.

Skrining za optimalnu temperaturu reakcije za pripremu FA–PC

Skrining za optimalno vrijeme reakcije za pripremu FA–PC

Skrining za optimalnu koncentraciju FA

Karakterizacija FA–PC

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC)

Rastvorljivost i koeficijent raspodjele ulje-voda

Rastvorljivost

Rastvorljivost praškastih FA i FA-PC je određena dodavanjem viška uzoraka u 10.0 mL [10] vode ili n-oktanola, a zatim mućkanjem na ljuljačkom krevetu 3 h. na 37 stepeni. Smjese su centrifugirane na 15,{7}} o/min 10 min da bi se uklonila nerastvorljiva FA. Zatim su supernatanti filtrirani kroz 0,45 µm membrane. Nakon toga, filtrati su deseterostruko razrijeđeni metanolom, a sadržaj FA je određen UV spektrofotometrom (UV-3150; Shimadzu; Japan).

Uzorci (10 mL) FA i FA–PC u n-oktanolu zasićenom vodom su pripremljeni i promućkani. U svaki uzorak dodana je voda zasićena n-oktanolom (10 mL), a tekućina koja se miješala je miješana 24 h. Nakon toga, uzorci su ostavljeni da odstoje radi nanošenja slojeva. Koncentracija FA u svakoj fazi određena je UV spektrofotometrijom (UV-3150; Shimadzu; Japan). Analize su obavljene u tri primjerka.

In vitro difuzija

In vitro studije difuzije su izvedene korištenjem Franz difuzijskih ćelija (TK-20A; Shanghai Xie Kai Financial Information Service Co., Ltd.; Kina). Osim toga, koristili smo Strat-M® membrane, koje su sintetičke membrane s difuzijskim karakteristikama koje su bliže ljudskoj koži nego modeli životinjske kože [11]. Membrane su pričvršćene između donorskih i prijemnih komora vertikalnih difuzionih ćelija, a prijemne komore su napunjene fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS; pH 7,4) da bi se rastvorili FA ili FA-PC i osigurali uslovi ponora.

Kromatografsko odvajanje je provedeno korištenjem sistema Agilent 1260LC serije (Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornija, SAD) opremljenog vakuumskim degazerom na mreži, kvaternarnom pumpom, autosamplerom, termostatiranim odjeljkom za kolonu i detekcijom niza dioda (DAD ). Korišten je softver Agilent Technologies ChemStation za tečnu hromatografiju (LC; B.02.01), a HPLC separacija je izvršena pomoću Eclipse plus-C18 kolone (4,6 × 250 mm, 5 μm). Talasna dužina detekcije bila je 0,05 posto sirćetne kiseline (A) i metanola (B) (40:60, v/v). Brzina protoka je bila 1,0 mL/min. Temperatura kolone je postavljena na 30 stepeni. Napravljene su kumulativne korekcije da bi se utvrdila količina oslobođene FA u svakom vremenskom intervalu. Sva mjerenja su izvedena u tri primjerka, a postotak kumulativnog FA koji je prožimao kroz membranu (% Q) je prikazan kao funkcija vremena.

Inhibicija melanogeneze

B16F10 test vitalnosti ćelija

Vijabilnost i ćelijska proliferacija procijenjeni su pomoću {{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromida (MTT) test [2]. B16F10 ćelije su prethodno tretirane sa 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 i 4.0 mg/mL koncentracijama FA i FA–PC. Nakon inkubacije od 48 h, dodat je MTT rastvor (konačna koncentracija: 5 mg/mL) i ćelije su inkubirane 3 h na 37 stepeni. Konačno, apsorbancija svakog uzorka je izmjerena na čitaču mikroploče na 570 nm da bi se dobio postotak živih ćelija.

Mjerenje sadržaja melanina

Sadržaj melanina je mjeren kao što je prethodno opisano [6] uz određene modifikacije. Ćelije melanoma B16F10 su zasijane (2 × 105 ćelija/jažici u 3 mL medijuma) u ploče za kulturu sa šest jažica i inkubirane preko noći da bi se omogućilo ćelijama da prianjaju. Na kraju tretmana, ćelije su isprane sa PBS i lizirane sa 1 M NaOH koji sadrži 10 procenata dimetil sulfoksida (DMSO) tokom 30 minuta na 80 stepeni. Apsorbancija (optička gustina; OD) je izmjerena na 475 nm pomoću čitača mikroploče. Sadržaj melanina izračunat je pomoću sljedeće formule:

Analiza podataka

Statistička značajnost razlika između srednjih mjerenja svake tretirane grupe i kontrolne grupe određena je korištenjem Dunnett-ovog t-testa. P vrijednosti<0.05 were considered statistically significant.

Rezultati i diskusija

Optimalna priprema FA–PC

Rastvorljivost i koeficijent raspodjele ulje-voda FA–PC

Tabela 1 prikazuje rastvorljivost FA, PM i FA–PC u vodi i n-oktanolu. FA-PC je pokazao dobru rastvorljivost u vodi i n-oktanolu (1,68 i 7,77 mg/mL, respektivno), a utvrđeno je da je rastvorljivost FA-PC u n-oktanolu značajno veća od rastvorljivosti FA (1,34 mg/mL) .

Lipofilnost se obično mjeri kao koeficijent raspodjele (P) između dvije faze koje se ne miješaju. Tipično se izražava kao log P. Određeni su prividni koeficijenti podjele FA i FA–PC u sistemu n-oktanol/voda. Rezultati su pokazali da je log P veći za FA–PC (1,21) nego za FA (0,99) kada je izmjeren na pH 5.0. Blago povećan log P je povezan sa značajno poboljšanom rastvorljivošću n-oktanola FA–PC u poređenju sa FA. Povećana rastvorljivost FA–PC u n-oktanolu može se objasniti amorfnim karakteristikama FA–PC. Kako su lipofilnost i permeabilnost u dobroj korelaciji, ovi rezultati sugeriraju da bi se transdermalna permeabilnost FA mogla poboljšati primjenom u obliku fosfolipidnog kompleksa.

DSC 

DSC je pouzdana metoda za skrining kompatibilnosti lijek-ekscipijent i pruža maksimalne informacije o mogućim interakcijama između lijekova i ekscipijenata [10]. Prisustvo interakcije može se zaključiti iz eliminacije endotermnih pikova, pojave novih pikova, promjena oblika i početka pika, vršne temperature/tačke topljenja i relativne površine ili entalpije. Slika 1 prikazuje DSC termograme FA (slika 1a), PC (slika 1b), PM (slika 1c) i FA–PC (slika 1d). Termička kriva za čistu FA ima tipično oštro endotermno topljenje na oko 172,7 stepeni, što ukazuje na njegovo bezvodno i kristalno stanje, dok fosfolipidi pokazuju manji endotermni vrh na 231,7–248,6 stepeni. DSC kriva za PM, koja se sastoji od superponiranih termičkih profila za FA i fosfolipide, ne pokazuje značajnepromjene osim malog pomaka na višu temperaturu (175,9 stepeni), što ukazuje da nema interakcije između komponenti. FA–PC ima jedan glavni vrh na 158,2 stepena, kojirazlikuje se od FA pika, što ukazuje na interakciju između FA i PC-a. Naši rezultati sugeriraju da su različiti stupnjevi interakcije i/ili amorfizacije u različitimmješavine ili kompleksi mogu se dobiti ovisno o načinu njihove pripreme i to je povezano s razlikama u rastvorljivosti.

FER

FTIR spektroskopija može potvrditi formiranje FA–PC upoređivanjem FA–PC spektra sa spektrom čiste FA. Slika 2 prikazuje FTIR spektre FA, PC, PM i FA–PC. FA spektar (slika 2a) pokazuje karakterističnu hidroksilnu traku rastezanja na 3436 cm−1. Sve to postaje širok singlet u spektrima FA–PC, PM i fosfolipida (slika 2b–d). FA spektar (slika 2a) pokazuje karakteristične pikove na 1620 cm−1 (C=C rastezanje) i 1450 cm−1 (C=C rastezanje aromatičnog prstena). U FA-PC spektru (slika 2b), ova dva pika nisu vidljiva, vjerovatno zbog slabljenja ili uklanjanja, ili zaštite od strane molekula fosfolipida.

FA spektar (slika 2a) pokazuje karakteristične nezasićene karboksilne pikove na 1691 cm−1 (C=O rastezanje) i 1664 cm−1 (C=C rastezanje). U FA-PC spektru (slika 2b), ova dva pika nisu vidljiva, vjerovatno zbog privlačnih sila između negativnog karboksilnog naboja u FA i pozitivnog naboja dušika u fosfolipidima. Fosfolipidni spektar (slika 2d) dostigao je maksimum na 1733 cm−1 (C=O rastezanje), 1238 cm−1 (P=O istezanje) i 1087 cm−1 (P–O –C istezanje). Thepikovi na 1733 i 1087 cm−1 se zadržavaju u PM i FA–PC spektrima, što ukazuje na neuključivanje u formiranje kompleksa. Fosfolipidni pik na 1283 cm-1 nije vidljiv u FA-PC spektru vjerovatno zbog karakterističnog hidroksila iz FA koji je povezan sa P=O na 1283 cm-1 preko van der Waalsovih sila. Rezultati pokazuju da je FA ugrađen u prstenastu strukturu sastavljenu od negativne fosforne kisikove veze i pozitivnog naboja dušika u fosfolipidima, koji je postao kompleks FA-PC.

SEM

Morfologije površine FA, PC, PM i FA–PC ispitane su pomoću SEM (slika 3). Na slici 3c, FA izgleda kristalno, gotovo pravougaono, dok čestice FA-PC (slika 3a) izgledaju nepravilnog oblika sa glatkom površinom. FA–PC ima značajno drugačiji oblik i topografiju površine u odnosu na FA i PC (slika 3b). Ovo je vjerovatno posljedica potpunog miješanja FA u PC-u. U PM skeniranju (slika 3d), i FA i fosfolipidi se lako razlikuju.

In vitro studije difuzije

Nedavno je uvedena sintetička Strat-M® membrana kao zamjena za ljudsku kožu in vitro difuzijske studije [11]. Strat-M® membrana se sastoji od dva sloja polietersulfona koji su otporni na difuziju. Slojevi polietersulfona leže na jednom sloju poliolefina, koji je otvoreniji i difuzniji. Ovu sintetičku membranu karakterizira niska varijabilnost od serije do serije, čime se pružaju konzistentniji podaci. Štaviše, pokazalo se da podaci o difuziji za Strat-M® membrane dobro koreliraju sa podacima ljudske kože [11].

Da bi se procenio uticaj PC-a na in vitro difuziona svojstva FA, procenat Q FA i FA–PC je prikazan u odnosu na vreme. Rezultati u ovom radu pokazali su trend da fosfolipidi značajno povećavaju permeaciju FA u Strat-M® membranu. Osim toga, FA–PC je duže boravio na Strat-M® membrani nego FA (slika 4). Stoga, ugradnja fosfolipida u FA možda produžava vrijeme njegovog zadržavanja u stratum corneumu i čini ga pogodnijim za prožimanje kože. Što se tiče vremena permeacije, iako je prijavljeno da Strat-M® membrana ima dobru korelaciju s onima na ljudskoj koži [11], ona također ima teksturalne razlike u odnosu na ljudsku kožu. Faktori uticaja vremena permeacije mogu biti uključeni otapalo, koncentracija jedinjenja, pH vrednost itd. U budućoj analizi trebalo bi uraditi više eksperimenata.

Inhibicija melanogeneze

Utjecaj FA–PC na sintezu melanina

Prema literaturi, FA može inhibirati ćelijsku aktivnost tirozinaze i melanogenezu u B16F10 ćelijama melanoma kroz smanjenje regulacije ćelijskih proteina c-kit i ERK1/2 [12]. U ovoj studiji, FA–PC je očiglednije smanjio sadržaj melanina u B16F1{{10}} ćelijama nego FA pri testiranim koncentracijama od 0,25, 0,5 i 1,0 mg/mL (Tabela 2). Stoga smo utvrdili da je FA–PC efikasniji od FA u inhibiciji sinteze melanina u B16F10 ćelijama.

Zaključak

Doprinosi autora

LL i LY su dali značajan doprinos koncepciji i dizajnu, ili sticanju podataka, ili analizi i interpretaciji podataka; XY i WX su bili uključeni u izradu rukopisa ili ga kritički revidirali za važan intelektualni sadržaj; a ZJ i DY su dali konačno odobrenje verzije koja će biti objavljena. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

Priznanja

Ovaj rad je podržan od strane Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (31501402).

Konkurentni interesi

Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljene interese.

Primljeno: 27. decembra 2016. Prihvaćeno: 14. marta 2017

Objavljeno na mreži: 22. marta 2017

Reference