Ranije smo otkrili da T ćelije (KIT) koje infiltriraju bubrege kod mišjeg lupus nefritisa (LN) ličedisfunkcionalne T ćelije koje infiltriraju tumore. Ovaj neočekivani nalaz pokrenuo je pitanje kakoda pomiri "iscrpljeni" fenotip KIT-a sa tekućim uništavanjem tkiva u LN. Na adresuovim smo izveli jednoćelijski RNA-Seq i TCR-Seq KIT-ova u modelima lupusa miša. Smo našlitaj CD8plusKIT-ovi su prvo postojali u tranzicijskom stanju, prije nego što su se klonalno proširili i evoluirali premaiscrpljenost. S druge strane, CD4plusKIT-ovi se nisu uklapali u trenutne paradigme diferencijacijeali su uključivale i hipoksične i citotoksične podskupine sa pervazivnim potpisom iscrpljenosti. dakle,autoimuni nefritis je za razliku od imuniteta na akutni patogen; radije, mikrookruženje bubregapotiskuje T ćelije progresivno izazivajući iscrpljena stanja. Naši nalazi sugeriraju da LN, akronično stanje, rezultat je spore evolucije oštećenja uzrokovanih disfunkcionalnim T stanicama i njihovimprekursori na putu do iscrpljenosti. Ovi nalazi imaju implikacije i na autoimunost itumorska imunologija.

Prema relevantnim studijama, cistanche je tradicionalna kineska biljka koja se vekovima koristi za lečenje raznih bolesti. Naučno je dokazano da ima antiinflamatorna, anti-aging i antioksidativna svojstva. Istraživanja su pokazala da je cistanche koristan za pacijente koji pate od bolesti bubrega. Poznato je da aktivni sastojci cistanchea smanjuju upalu, poboljšavaju funkciju bubrega i obnavljaju oštećene bubrežne stanice. Stoga, integracija cistanchea u plan liječenja bolesti bubrega može ponuditi velike prednosti pacijentima u upravljanju njihovim stanjem. Cistanche pomaže u smanjenju proteinurije, snižava nivoe BUN-a i kreatinina i smanjuje rizik od daljnjeg oštećenja bubrega. Osim toga, cistanche također pomaže u smanjenju razine kolesterola i triglicerida koji mogu biti opasni za pacijente koji pate od bolesti bubrega.

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche za bolesti bubrega

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Uvod

Infiltracija čvrstih organa vjerovatno patogenim T ćelijama je uobičajena karakteristika mnogih autoimunih bolesti i odbacivanja transplantata organa. Ovi patogeni događaji histološki i konceptualno su paralelni T-ćelijskoj infiltraciji tumora, što može dovesti do destrukcije tumorskih stanica. Međutim, za razliku od dobro proučenih limfocita koji infiltriraju tumor (TIL), T ćelije koje infiltriraju tkivo koje posreduju bolesti u autoimunosti su dobile daleko manje pažnje. Sada je dobro prihvaćeno da tumorsko mikrookruženje funkcionira tako da inhibira imunološki odgovor i inducira iscrpljenost T ćelija (1-3), dok se kod autoimunosti općenito smatra da patogene T stanice aktivno uništavaju normalna tkiva nesmetano, jer nemaligna tkiva ne mogu razviti otpor. Kako bismo istražili prirodu autoimunih infiltrata, odabrali smo proučavanje lupus nefritisa (LN), budući da je bubreg ključna meta u ovoj autoimunoj bolesti. Intersticijski nefritis ovisan o T ćelijama je glavni prognostički pokazatelj zatajenja organa kod lupusa (4, 5).

Naš nedavni rad koji pokazuje da su T ćelije koje infiltriraju bubrege (KIT) funkcionalno i transkripcijski iscrpljene (6) – slično kao TIL ili CD8 plus T ćelije nakon kronične virusne infekcije – dovodi u pitanje 2 paradigme. Prvo, to je protiv ideje da je autoimuno uništavanje parenhimskog tkiva direktan efektorski proces, sličan odgovoru na virusno inficirane ćelije. Umjesto toga, neka tkiva mogu biti obdarena prirodnim mehanizmima samoodržanja koji smanjuju ili potiskuju infiltrirajuće T ćelije, što može spriječiti ili umanjiti autoimunost. Drugo, sugerira da tumori ne razvijaju de novo skup puteva za negativno regulaciju T stanica. Umjesto toga, takvi putevi mogu biti izvorni za određena parenhimska tkiva, a tumori ih mogu pojačati ili jednostavno prirodno eksprimirati.

Otkriće da bubrezi i možda druga tkiva mogu potisnuti infiltrirajuće T ćelije postavilo je važno pitanje: ako su KIT-ovi funkcionalno i transkripcijski inertni ili iscrpljeni, kojim se onda mehanizmima odvija oštećenje tkiva? Jedna hipoteza koja se bavi ovim pitanjem je da se iscrpljene ćelije pravilnije smatraju nefunkcionalnim – a ne nefunkcionalnim – i da mogu polako nanijeti oštećenje tkiva zbog rezidualne efektorske funkcije, baš kao što iscrpljene T stanice u kroničnoj infekciji služe za zaštitu od agresivnijih infekcija (7, 8). Drugo, neekskluzivno objašnjenje je da samoreaktivne T ćelije zadržavaju efekat da funkcionišu po dolasku u bubreg, ali postaju sve manje funkcionalne zbog uticaja mikrookruženja tkiva. Prema ovom gledištu, oštećenje datog klonotipa T ćelija je u početku naneseno u većem stepenu, a zatim se ublažava programom iscrpljenosti. Hronična bolest bi se mogla održavati stalnim zapošljavanjem novih klonova koji su u početku funkcionalniji.

Da bi se ovi mehanizmi istražili, potrebno je dublje razjasniti prirodu intraparenhimskih autoimunih odgovora. Rezultat takvog rada - razumijevanje prirode T ćelija koje uzrokuju štetu - mogao bi otkriti načine njihovog specifičnog ciljanja, na primjer, na osnovu njihovog metaboličkog statusa ili površinskog fenotipa. Osim toga, takve informacije mogu otkriti pokretače bolesti i pružiti alate za stratifikaciju pacijenata - 2 važna problema u lupusu, koji je notorno heterogen u manifestaciji (9, 10). Nadalje, takvi uvidi će se vjerovatno primijeniti na druge ciljne organe i okruženja bolesti.

Međutim, izuzetno je izazovno odgovoriti na ova pitanja u ljudskom LN, zbog oskudice dostupnog tkiva, koje se može dobiti samo uz dodatni "istraživački prolaz" biopsije iglom. Zaista, nedavna studija konzorcijuma, iako herojska, uspjela je procijeniti samo oko 1000 pojedinačnih ćelija pomoću RNA-Seq kod svih pacijenata (11). Štaviše, skoro svi ovi pacijenti su bili pod tretmanima koji su posebno osmišljeni da utiču na te iste ćelije, što uveliko otežava tumačenje.

Iz tog razloga, ovdje smo koristili modele mišjeg lupusa, koji nam omogućavaju pristup tkivu bez komplikacija različitih tretmana. Koristili smo jednoćelijski RNA-Seq (scRNA-Seq) da identifikujemo iznenađujući stepen heterogenosti između CD4 plus i CD8 plus KIT-ova, što ukazuje na dinamičniji proces oštećenja ciljnih organa nego što se pretpostavljalo. Unutar CD8 odjeljka posebno je identificiran veliki klaster "prijelaznih" ćelija, koje su zadržale djelomičnu aktivaciju i efektorsku funkciju i predviđeno je da će evoluirati i u iscrpljene ćelije, kao i u rezidentne memorijske ćelije, koje su sve također identificirane među KIT-ovima. Dok CD4 plus ćelije, intrigantno, nisu se uklapale u postojeće Th paradigme, već su uključivale citotoksični klaster, kao i demonstrirajući prodoran iscrpljeni fenotip. Osim toga, korištenjem TCR-Seq-a, uspjeli smo povezati različite klastere KIT-ova, ocrtavajući uvjerljivu progresivnu evoluciju klonotipova unutar bubrega. Ovaj rad otkriva krajolik interakcije između infiltrirajućih T ćelija i parenhima u ciljnom organu lupusa i sugerira dinamički model kako nefritis evoluira kao kronično stanje. Ovi uvidi bi mogli dati informaciju za nove strategije za prekid procesa.

Rezultati

Eksperimentalni dizajn. Generirali smo 3 eksperimentalne kohorte za rješavanje reprogramiranja T ćelija nakon infiltracije tkiva u mišji LN koristeći 10x Genomics scRNA-Seq platformu i hashtag oligonukleotid (HTO) dekonvolucionu tehnologiju (slika 1A). U početnoj kohorti (Main-Seq), uporedili smo T ćelije slezene i KIT-ove starijih nefritičnih MRL/lpr miševa sklonih lupusu, kao i "naivne" T ćelije B6 miševa koji nisu skloni lupusu. U drugoj kohorti, fokusirali smo se na KIT-ove MRL/lpr miševa i dodatno procijenili KIT TCR repertoar (MRL-TCR-Seq). Konačno, u trećoj kohorti, završili smo sličnu KIT analizu kao u kohorti 2 koristeći Fc R2B–/–.Yaa model LN (Yaa-TCR–Seq).

Grupiranje T ćelija na osnovu porekla, autoreaktivnog statusa i CD4/8 fenotipa. Grupisanje svih T ćelija u Main-Seq kohorti zasnovano na transkriptomima niske rezolucije, koristeći Seurat (12), identifikovalo je 14 klastera (Slika 1B). HTO dekonvolucija razgraničila je ćelije na osnovu tipa T ćelija (tj. CD4 i CD8), organa porekla (bubreg naspram slezine) i potencijalnog autoreaktivnog statusa (B6 naspram miševa sklonih lupusu, Slika 1C). Sva 3 MRL/lpr miša doprinijela su svakoj definiranoj populaciji, pri čemu nijednu populaciju vodi određeni donator (dopunska slika 1; dodatni materijal dostupan na internetu uz ovaj članak; https://doi.org/10.1172/jci. insight.156048DS1) . Dok su CD4 plus i CD8 plus T ćelije neautoimunih miševa bile relativno ujednačene, CD4 plus i CD8 plus T ćelije obolelih miševa pokazale su izuzetnu heterogenost (Slike 1, B i C).

Heterogenost i potencijalne funkcije CD4 plus T ćelija u mišjem lupusu. Grupisanje visoke rezolucije dalo je 13 CD4 plus T ćelija (slika 2A). HTO-usmjerena dekonvolucija istakla je razdvajanje između T ćelija izvedenih iz bubrega i slezene od MRL/lpr miševa, dok su CD4 plus T ćelije iz B6 miševa padale pretežno u 2 klastera (5 i 11) (Slika 2A, desni panel). Identificiranjem najdiferencijalnije eksprimiranih gena (DEG) u svakom klasteru (dopunska slika 2), pokušali smo dodijeliti specifične fenotipske podtipove svakom CD4 plus klasteru. Koristeći ovaj pristup, samo 2 od klastera CD4 plus T ćelija lako su se uparili sa konvencionalnim fenotipovima T ćelija: klaster 6 je predstavljao Tregs, dok je klaster 12 pokazivao IFN potpis tipa I (IFNhi).

Zatim smo ispitali ekspresiju TF i kanonsku ekspresiju gena T ćelija obogaćivanja potpisa za dobro opisane fenotipove CD4 plus T ćelija, uključujući Treg, Th1, Th2, T folikularni pomoćnik (Tfh) i Th17 (vidi Dodatnu tabelu 1 za liste gena) ( 13–23). Kao što se očekivalo, pretpostavljeni Treg klaster je pokazao jake potpise gena povezanih s Treg i eksprimirao Foxp3 (slika 2B). Th1 potpis je bio povezan sa klasterima 1, 4 i 8, a Tbet je izražen u sličnoj distribuciji (Slika 2C). Jači potpis gena Th2 i ekspresija Gata3 su također primijećeni u bubrezima koji dominiraju klasterima 1, 4, 8 i 10, što ukazuje na određenu koekspresiju Th1 i Th2 fenotipa bez jasne razgraničenja između 2 loze (Slika 2, C i D ). Nekoliko izvještaja sugerira ulogu Th17 u LN; međutim, slično nalazima u uzorcima humanog nefritisa koje je ispitala Accelerating Medicines Partnership in SLE mreža (AMP konzorcij) (11), nije uočen značajniji Th17 profil prema genskom potpisu ili Rorc ekspresiji u bilo kojem odjeljku (dodatna slika 3, A i B ). Nekoliko ćelija je pokazalo ili potpis gena povezan sa Tfh ili ekspresiju Bcl6, što je u skladu sa izveštajima o nekoliko germinalnih centara u MRL/lpr slezeni (24) (dodatna slika 3C). Konačno, klaster 7 je vjerovatno predstavljao odjeljak T ćelija centralne memorije (TCM), a klaster 5 je predstavljao naivne T ćelije (dodatne slike 3, D i E).

Identificirali smo nekoliko TF-ova čiji su motivi obogaćeni među DEG-ovima datih klastera korištenjem SCENIC algoritma. Iako klaster IFN tipa I (klaster 12) pokazuje dokaze IRF1, IRF7, IRF9 i STAT2 regulacije (25) (Slika 3A), općenito, nismo pronašli jedinstvene TF asocijacije unutar specifičnih klastera. Međutim, hijerarhijska klaster analiza TF sugerira transkripcijsku organizaciju prema organu porijekla ili prisutnost autoimunosti. Postojao je uticaj specifičan za bubrege, u tome što su brojni motivi vezivanja TF (uključujući HIF1, TGIF2, CREM, JUN i FOS) obogaćeni u većini KIT-ova, bez obzira na klaster; nekoliko od ovih TF-ova je takođe bilo transkripciono povećano, uključujući Crem i Hif1, koji su ranije bili povezani sa zadržavanjem tkiva i hipoksijom, respektivno (18, 26, 27) (Slika 3B). Ekspresijom Hif1 i transkripcionom aktivnošću, nedavni rad je opisao profil ekspresije gena hipoksije u masovnoj RNA-Seq KIT-ova izolovanih od MRL/lpr miševa (18). Slično, primijetili smo da dio KIT-ova izražava profil hipoksije, posebno u klasterima 1, 4, 8 i 10 i KIT Treg populaciji (Slika 4A).

S obzirom na nalaze iz našeg prethodnog rada koji sugeriraju iscrpljenost KIT-a, procijenili smo potpis iscrpljenosti (6), koji se činio obogaćenim među CD4 plus KIT-ovima ukupno (Slika 4, A i B). Potpisi iscrpljenosti u višestrukim klasterima bili su viši od početne linije definisane CD4 plus B6 T ćelijama slezene, pri čemu su klasteri 0, 4, 8, 10 i 9 pokazali najviši rezultat (Slika 4B). Ovi klasteri su bili sastavljeni uglavnom od KIT-ova, osim klastera 9, koji se sastojao od KIT-ova i T ćelija slezene iz MRL/lpr miševa; međutim, čak iu klasteru 9, iscrpljenije ćelije su izvedene iz bubrega (slika 4B). Stoga, uprkos heterogenosti CD4 plus KIT-ova, ekspresija gena povezana sa iscrpljenošću pojavljuje se u transkriptomima višestrukih klastera T ćelija.

Kako su citotoksične CD4 plus T ćelije prijavljene u starenju, (13) tumorskim infiltratima (28) i sistemskoj sklerozi (29), procijenili smo da li je citotoksični genski potpis uočen u KIT-ovima. Zaista, dio T ćelija slezene i bubrega iz MRL/lpr miševa, koji obuhvataju klastere 0, 2 i 9, eksprimirao je potpis citotoksičnog gena (Slika 4A). Zanimljivo je da KIT klasteri općenito izražavaju ili hipoksični profil ili citotoksični genski potpis, ali ne oboje.

Analiza putanje identifikuje razvojnu progresiju CD4 plus T ćelija. Na temelju analize potpisa gena klastera, pretpostavili smo da postoji progresija od naivnih do perifernih efektorskih/citotoksičnih T stanica, koje potom invaziju na bubreg gdje prvo eksprimiraju citotoksični program, nakon čega slijedi odgovor hipoksije praćen iscrpljenošću/disfunkcijom. Da bismo procijenili ovaj model, napravili smo analizu progresije loze koristeći Monocle3, koji integrira ekspresiju temporalnog gena (slika 4C). HTO preklapanja na pseudo vremenskoj putanji Monocle3 (slika 4C) ukazuju na to da se poreklo loze javlja sa naivnim klasterom B6; program je tada pretpostavio rano grananje Treg klastera, zajedno sa progresijom kroz aktivirane ćelije slezene sklone lupusu, i konačno do ćelija koje infiltriraju bubrege. U ovom modelu se čini da naivne T stanice ulaze u "autoimunu/citotoksičnu fazu" neposredno prije ili paralelno s infiltracijom bubrega, kao što se pretpostavlja, i konačno napreduju u hipoksično/disfunkcionalno stanje (slika 4D).

KIT Tregs izražavaju markere koji su rezidentni u tkivu. Da bismo procijenili neovisni učinak reprogramiranja tkiva na fenotip T ćelija, detaljnije smo procijenili Treg populaciju (klaster 6), budući da se ovaj klaster sastojao od ćelija iz sva 3 porijekla. Nakon reklasteriranja, KIT Tregovi su mapirani odvojeno od Tregova slezene bilo B6 ili autoimunog porijekla (Slika 5, A i B). Grafikon vulkana (Slika 5C) otkrio je nekoliko DEG-ova između perifernih i bubrežnih Tregova, uglavnom povišenih u bubrezima, što sugerira da je zadržavanje tkiva izazvalo dodatni transkripcijski program. Ovi DEG-ovi su uključivali Crem i Klf6, TF-ove koji su prethodno bili povezani sa CD4 plus KIT fenotipovima u našem TF mapiranju (slika 3B). Zanimljivo je da su geni prethodno identificirani u Tregovima koji žive u tkivu u poređenju sa limfoidnim Tregovima, na sličan način transkripcijski povećani u KIT Tregovima, uključujući Crem, Rgs1, Rgs2, Id2, Ctla4 i Areg (Slika 5C, označena ružičastom bojom) (30).

CD8 plus KIT-ovi pokazuju heterogenost nakon infiltracije tkiva. CD8 plus T ćelije (iz Main-Seq) su analizirane kao što je urađeno za CD4 plus populaciju, dajući 9 klastera koji su se razdvojili na osnovu HTO (Slika 6, A i B). Mogli bismo identificirati većinu ovih klastera prema DEG-ovima u svakom (slika 6C). Većina T ćelija slezene bila je grupisana na desnoj strani UMAP-a, pri čemu je klaster 4 pretežno sastavljen od T ćelija B6 slezene i klaster 0 koji predstavlja većinu MRL/lpr T ćelija slezene i ukazuje na TCM fenotip.

Autoimune T ćelije slezene su takođe bile zastupljene u klasterima 6 i 5, koji se sastoje od T efektorske memorije (TEM) i periferno iscrpljenih ćelija, respektivno. CD8 plus KIT-ovi MRL/lpr miševa pronađeni su u nekoliko jedinstvenih klastera. Klaster 2 sadržavao je iscrpljenu populaciju T ćelija (TEX). Klaster 3 se sastojao od rezidentne populacije T ćelija memorije (TRM). Klaster 6 je bio TEM klaster, sastavljen od otprilike 50 posto KIT-a i 50 posto T ćelija slezene. Klaster 1 je bio najveći KIT klaster. Činilo se da predstavlja prelazno stanje, jer ćelije u ovom klasteru izražavaju mješavinu gena koji ukazuju na TEX, TRM i TEM. 2 najmanja klastera su bile ćelije koje se dele (klaster 7) i IFNhi T ćelije (klaster 8), sa ćelijama iz više izvora.

Da bi se potvrdili navodni identiteti klastera, signature referentnih gena (dopunska tabela 1) su prekrivene na UMAP dijagramima (slika 6, D–I). Signatura rezidentne memorije najjače je mapirana na TRM i KIT TEX klastere (slika 6D). Recipročno, periferni genski potpis je bio povezan sa T ćelijama izvedenim iz slezene - posebno sa naivnim, TCM i delom slezene TEM klastera (Slika 6E); međutim, periferni TEX klaster nije pokazao ni TRM ni periferni potpis. Kao što se i očekivalo, CD8 plus KIT populacija u cjelini pokazala je snažan „iscrpljen“ potpis (6). Među KIT-ovima, signatura iscrpljenosti je najviše povezana s klasterima 2 i 3 i u manjoj mjeri 1, koji predstavljaju KIT TEX, TRM i prijelazne populacije, respektivno (Slika 6F). Prekrivači referentnog gena UMAP za TEM i TCM transkripcijske potpise potvrdili su naše početne klasifikacije ovih klastera (Slika 6, G i H).

Jedinstveni TF profil povezan sa infiltracijom i iscrpljenošću T ćelija. Dalje smo izvršili obogaćivanje TF motiva za CD8 plus T ćelije koristeći SCENIC (Slika 7A). Kao što se očekivalo, IRF1, IRF7, IRF9 i STAT1 identifikovani su kao transkripcioni pokretači klastera IFNhi. Slično CD4 plus odjeljku, nekoliko motiva je obogaćeno u svim CD8 plus KITovima (UQCRB, CREM i KLF6), dok su ostali TF specifični za klastere; na primjer, u TEX klasterima (2 i 5) obogaćeni su motivi za NR3C1, HTATIP2 i ELF1.

SCENIC ne može mapirati sve TF-ove. Da bismo pružili alternativni pristup, preklopili smo izraz višestrukih TF-ova na UMAP dijagrame (Slika 7B). Ekspresija Crem i u manjoj meri Klf6, bila je povezana sa KIT-ovima, dok Uqcrb nije, što je otkrilo izvesnu nesklad između ekspresije TF i predviđene regulacije TF gena. Ekspresija i Toxa i Eomesa, koji su regulatori iscrpljenosti T ćelija (31-33), je u korelaciji sa TEX klasterima 2 i 5, dodatno potvrđujući njihov identitet. Značajno je da je Tcf7, koji je snažno eksprimiran u T ćelijama slezene, također uočen u prijelaznim ćelijama, s ekspresijom općenito ugašenom u TEX i TRM populacijama. Obrazac sličan Tcf7 viđen je kod Klf2, dok su Klf6 i Id2 imali recipročne obrasce.

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】