Flavonoidi kao obećavajući antivirusni agensi protiv SARS-CoV-2 infekcije: Mehanistički pregled

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Novodijagnostikovani koronavirus 2019.COVID-19) je utjecao na sve ljudske aktivnosti od svog otkrića.Flavonoidikoji se obično nalaze u ljudskoj ishrani privukli su veliku pažnju zbog svojih izuzetnih bioloških aktivnosti. Ovaj rad daje sveobuhvatan pregled prednosti flavonoida kod bolesti COVID{0}}. Ranije prijavljeni učinci flavonoida na pet RNA virusa sa sličnim kliničkim manifestacijama i/ili farmakološkim tretmanima, uključujući gripu, virus humane imunodeficijencije (HIV), teški akutni respiratorni sindrom (SARS), bliskoistočni respiratorni sindrom (MERS) i ebolu, bili su razmatrano. Flavonoidi djeluju direktnoantivirusnosvojstva, gdje inhibiraju različite faze virusnog infektivnog ciklusa i indirektne efekte kada moduliraju odgovore domaćina na virusnu infekciju i naknadne komplikacije. Flavonoidi su pokazali antivirusno djelovanje putem inhibicije virusne proteaze, RNA polimeraze, mRNA, replikacije virusa i infektivnosti. Ova jedinjenja su takođe bila efikasna za regulaciju interferona, proinflamatornih citokina i subćelijskih inflamatornih puteva kao što su nuklearni faktor-kB i Jun N-terminalne kinaze. Baicalin,kvercetin, i njegovi derivati, hesperidin i katehini su najviše proučavani flavonoidi u tom pogledu. Zaključno, dijetalni flavonoidi su obećavajuće opcije liječenja protiv infekcije COVID-19; međutim, preporučuju se buduća istraživanja kako bi se procijenila antivirusna svojstva ovih jedinjenja na ovu bolest.

Ključne riječi: upala; pluća; oksidativno oštećenje; antivirusno; polifenol

Kliknite ovdje da saznate više o proizvodima

1. Uvod

Do kraja 2019. iz Kine je prijavljena neobična upala pluća koja je dalje dijagnosticirana kao novi koronavirus (CoV) koji uzrokuje teški akutni respiratorni sindrom (SARS) i nazvana je COVID-19[1,2]. Kasnije se virus (SARS-CoV-2) proširio na druge zemlje i SZO ga je 11. marta 2020. proglasila pandemijom [3]. Thevirusprenosi se uglavnom respiratornim putem, a težina se kreće od blagih do teških smrtonosnih simptoma. Smatra se da su asimptomatski slučajevi u periodu inkubacije važan izvor zaraze [4]. U većini slučajeva, blagim simptomima je potrebno 1-2 sedmica da se riješe, dok teški slučajevi mogu dovesti do smrti [5].

SARS-CoV-2 utiče na respiratorni sistem, izazivajući groznicu i suvi kašalj [4]; međutim, virus može uzrokovati zatajenje organa, uglavnom u srcu i bubrezima, kao i uzrokovati citokinske oluje, koje dodatno povećavaju smrtnost. Virusni životni ciklus SARS-CoV-2 uključuje

vezivanje, penetracija, biosinteza, sazrijevanje i oslobađanje. Nakon vezivanja, virusna RNK ulazi u ćelijsko jezgro radi replikacije, a virusna mRNA počinje generirati virusne strukturne proteine, uključujući proteine ​​šiljaka (S), membrane (M), ovojnice (E) i nukleokapside (N) [6]. Pokazalo se da i angiotenzin-konvertujući enzim 2(ACE2) receptor, koji je visoko eksprimiran u plućima, djeluje kao ko-receptor za SARS-CoV [7].

SARS, MERS i SARS-CoV-2 su svi RNA CoV. SARS-CoV-2 genom je 88 posto identičan teškim akutnim respiratornim sindromima (SARS) sličnim CoV-ovima koji potiču od slepih miševa, 79 posto sličan SARS-CoV i 50 posto sličan MERS-CoV [8,9]. SARS-CoV-2 proteini su 90 posto -100 posto homologni SARS-CoV; međutim, orf10 i orf8 se razlikuju između SARS-CoV-2 i SARS-CoV.Orf8 je pomoćni protein za CoV. Formira šestolančani protein alfa heliksa koji povećava sposobnost širenja virusa. SARS-CoV-2 orfla/b, šiljak, ovojnica, membrana i nukleoprotein su također blisko povezani sa onima kod SARS-CoV [10] .

Budući da ne postoji specifično antivirusno sredstvo protiv SARS-CoV-2, trenutno dostupni antivirusni lijekovi se razmatraju za liječenje COVID-19. Remdesivir je novi antivirusni lijek koji je posebno uveden za virus ebole 2015. Ima inhibitorni učinak na virusnu RNA polimerazu i nedavno je korišten u nekim ispitivanjima za liječenje COVID-19 [11]. Favipiravir ima inhibitorni efekat na gripu i virus ebole sa istim mehanizmom, a procjenjuje se i kod SARS-CoV-2 [12-14]. Lopinavir je inhibitor virusne proteaze i prvo je razvijen za liječenje HV-a. In vitro studije su pokazale inhibitorni efekat lopinavira u ćelijama inficiranim CoV [15,16]; međutim, sistematski pregledi nisu pokazali nikakav povoljan efekat protiv SARS-CoV-2 [17].

Ljekovite biljke su od davnina pouzdan izvor prirodnih lijekova, uključujući i antivirusna sredstva. Tradicionalna medicina i etnofarmakološke studije različitih zemalja širom svijeta uvijek su otvarale nove puteve za otkrivanje lijekova [18-22]. Oseltamivir, koji je konvencionalno antivirusno sredstvo, derivat je šikiminske kiseline, sekundarnog metabolita zvjezdanog anisa (Illicium verum Hook.f.). U slučaju SARS-CoV-2, in silico studije su otkrile moguća antivirusna svojstva biljnih sastojaka [23-25]. Flavonoidi su velika klasa fitokemikalija koje se obično nalaze u nekoliko namirnica i povrća u ljudskoj prehrani s brojnim vrijednim farmakološkim aktivnostima, uključujući antivirusna svojstva. Pokazano je da ovi spojevi mogu inhibirati virusnu patogenezu ciljanjem na bitne faze životnog ciklusa virusa [26]. Kvercetin, katehini, kempferol i baicalein su primjeri najvažnijih flavonoida koji pokazuju antivirusna svojstva [18,27,28]. Ova studija ima za cilj raspraviti dostupne antivirusne dokaze o flavonoidima kao mogućem liječenju protiv SARS-CoV-2 s obzirom na ranije prijavljene efekte ovih jedinjenja na pet RNA virusa sa sličnim kliničkim manifestacijama i/ili farmakološkim tretmanima, uključujući gripu, virus humane imunodeficijencije (HIV), teški akutni respiratorni sindrom (SARS), bliskoistočni respiratorni sindrom (MERS) i ebola.

2. Rezultati

Antivirusna aktivnostflavonoida se mogu kategorizirati na direktne antivirusne efekte gdje je virus direktno pogođen flavonoidom i indirektne efekte gdje flavonoid poboljšava odbrambene mehanizme domaćina protiv virusne infekcije. Ovdje se raspravlja o osnovnim antivirusnim mehanizmima flavonoida s osvrtom na najvažnije flavonoide koji demonstriraju ove mehanizme.

2.1. Direktni antivirusni mehanizmiS

2.1.1. Inhibicija virusne proteaze

Virusne proteaze se koriste za cijepanje virusnih poliproteinskih prekursora na određenim mjestima za oslobađanje funkcionalnih proteina. Pokazalo se i da specifične virusne proteaze cijepaju proteine ​​ćelije domaćina, uključujući faktore inicijacije translacije (eF4 i elF3d) u HIV-u, kako bi spriječili translaciju proteina domaćina [29,30]. Koronavirusi stvaraju tri vrste virusnih proteaza, uključujući 3-cistein sličan kimotripsinu (3CLpro), proteazu sličnu papainu (PLpro) i glavnu proteazu (M pro)[31]. 3CLpro je važan za život SARS-CoV-a. ciklusa, PLpro igra ulogu u replikaciji SARS-CoV-2, a Mopar je odgovoran za sazrijevanje funkcionalnih proteina u SARS-CoV-2 [32,33]. Kao rezultat toga, ovi molekuli su pogodne mete lijekova u antivirusnim istraživanjima i otkrivanju lijekova [34].

Kaempferol koji je flavonoid u izobilju u nekoliko namirnica smanjio je CPE u Vero E6 ćelijama inficiranim kliničkim izolatima SARS-CoV-2 sa oko 88 posto inhibicije pri koncentraciji od 125 μM. Povezano in silico istraživanje sugerira da je inhibicija enzima SARS-CoV-2 3CLpro glavni mehanizam djelovanja [35]. Dodavanje kempferola 3CLpro i PLpro SARS-CoV i MERS-CoVekspresanim u E.coli izazvalo je antivirusne efekte putem inhibicije ovih enzima [36]. Park i saradnici (2017) su pokazali da prisustvo hidroksilne grupe u kempferolu uzrokuje snažniju antivirusnu aktivnost kroz inhibiciju 3CLpro i PLpro [37]. Epigalokatehin galat (EGCG) je flavonoid koji se nalazi u čaju (Camellia sinensis L.) sa antifungalnim, antibakterijskim i antivirusnim svojstvima [38.39]. Studije su pokazale da EGCG inhibira aktivnost reverzne transkriptaze (RT), aktivnost proteaze, p24, ulazak virusa i proizvodnju virusa u THP-1 i H9 ćelijama inficiranim HIV-om-1, a modifikacija liposoma EGCG pojačala je njegovu inhibiciju efekti. Studije bez ćelija su takođe pokazale značajno smanjenje kinetike proteaze nakon tretmana sa EGCG. Smatra se da je galoil grupa u EGCG odgovorna za njegovo antibakterijsko i antivirusno djelovanje [40]. Isoliquiritigenin, halkon, može se koristiti kao terapeutsko sredstvo kod bakterijskih i virusnih infekcija [41]. Ovo jedinjenje pokazalo je inhibitorni efekat na SARS-CoV, te MERS-CoV 3CLpro i PLpro izražene u E.coli. Prisustvo prenil funkcionalne grupe na rezorcinolnom prstenu omogućava stvaranje hidrofobnih interakcija sa proteazama [37]. Teaflavini su polifenoli koji se nalaze u raznim vrstama čaja [42]. Eksperimenti na SARS-CoV rekombinantnoj proteazi pokazali su značajno smanjenje aktivnosti 3CLpro nakon tretmana teaflavin-3,3'-digalatom sa IC50 vrijednošću od 9,5 uM. Galatna grupa vezana za 3' poziciju u nekim teaflavinima može biti od suštinskog značaja za interakciju sa 3CL proaktivnim mestom [43]. Prenylisoflavonoidi ekstrahovani iz Erythrina senegalensis DC. korišteni su za procjenu anti-proteazne aktivnosti protiv rekombinantne HIV-1 proteaze. Rezultati su pokazali da ova jedinjenja mogu inhibirati HIV-1 rekombinantnu proteazu in vitro sa vrijednostima od 0,5 do 30 μMIC50. Hidroksi i prenil grupe mogu biti odgovorne za inhibiciju HIV proteaze [44]. Kvercetin i kvercetin- -galaktozid su smanjili aktivnost PLpro, 3CLpro, deubikvitinacije i DelSGilacije kod SARS-CoV, MERS-CoV i HIV-1. Položaj hidroksilnih grupa može biti efikasan u anti-proteaznoj aktivnosti. Kvercetin sa pet hidroksilnih grupa na 3,5,7,3' i 4' pozicijama pokazao je snažan inhibitorni efekat na virusne proteaze; dok je prisustvo glikozilne grupe na pozicijama 3,7A' smanjilo inhibitorni efekat [37,45].

2.1.2. Inhibicija virusne RNA polimeraze i virusne mRNA

RNK-ovisna RNA polimeraza (RdRp) je važan enzim koji katalizuje replikaciju RNK iz RNK sekvence [46]. Ovaj enzim je kodiran u svim RNK virusima, kao iu nekim eukariotima [47]. Virusi su obavezni intracelularni paraziti, tj. ne mogu samostalno preživjeti izvan ćelija. Moraju koristiti opremu za ćelijsku translaciju za prevođenje mRNA za proizvodnju proteina, koji je potreban za replikaciju. Prema tome, bilo kakva interferencija s translacijom mRNA bi inhibirala replikaciju, širenje i evoluciju virusa [48].

Nedavno istraživanje Zandi et al. otkrili su in vitro antivirusni efekat baikalina i baicaleina na infekciju SARS-CoV-2 u ćelijskoj liniji Vero CCL-81 putem inhibicije RdRp-a, s većom potencijom baicaleina. Dalje in silico procene su pokazale da ova dva jedinjenja imaju veći afinitet prema RdRp u poređenju sa ponovnim oslobađanjem: Čini se da je mesto vezivanja baikalina i baicaleina drugačije od remdesivira; stoga se ovi flavonoidi mogu koristiti kao pomoćni tretman uz remdesivir [49]. Efekti kvercetin-7-O-glukozida (Q7G) su procijenjeni u in vitro studiji na MDCK ćelijama inficiranim virusima influence A i B u poređenju sa standardnim antivirusnim agensom oseltamivirom. Oseltamivir je korišten kao kontrolirani lijek i pokazao je umjerenu antivirusnu aktivnost sa vrijednostima IC50 od 25,4 do 42,2 ug/mL; dok je Q7G inhibirao virus gripe A i B sa IC50 vrijednostima od 3,10 ug/mL do 8,19 ug/mL. Oseltamivir je takođe pokazao slabiju aktivnost protiv gripa B od gripa A; dok je Q7G pokazao snažnu aktivnost protiv svih virusa gripa. Dodatno, kvantitativni PCR testovi su prijavili veći pad u sintezi virusne RNK nakon tretmana Q7G u poređenju sa oseltamivirom, što ukazuje na inhibitorni efekat Q7G na virusnu RNK polimerazu. Analiza molekularnog spajanja otkrila je da je ova interakcija posljedica vezivanja Q7G za PB2 podjedinicu virusne RNK polimeraze [50].

Oroxylin A(OA) je flavonoid koji se nalazi u Oroxylum Indicum(L.)Kurz. Pokazalo se da OA može inhibirati nekoliko sojeva gripe A u MDCK stanicama na način ovisan o dozi. Oralno liječenje miševa inficiranih virusom gripe H1N1 sa OA također je smanjilo smrt uzrokovanu virusom, gubitak tjelesne težine i ozljede pluća, sa stopom preživljavanja od 60,0 posto pri dnevnoj dozi od 100 mg/kg. Izvještava se da su antivirusni efekti OA uzrokovani smanjenjem regulacije H1N1 matrix1(M1)mRNA transkripcije i sinteze proteina (u et al. 2018). Protein M1 je protein unutar virusnog omotača koji se veže za virusnu RNK i može posredovati u inkapsidaciji RNA nukleoproteinskih jezgara u omotač membrane [51]. Iako OA može inhibirati sintezu proteina, ne može blokirati ulazak virusa u ćeliju domaćina ili ulazak nukleoproteina (NP) u jezgro ćelije domaćina [52]. Baicalin i biochanin A mogu inhibirati infekciju gripom H5N1 u ćelijama A549 sa IC50 vrijednostima od 18,79 odnosno 8,92 μM. Ovaj efekat je posredovan supresijom izvoza nuklearnog virusnog ribonukleoproteina (RNP) [53]. Druge studije su takođe pokazale da baikalin može smanjiti ekspresiju proteina M1 gripa [54,55].

Domaćin cdc2-slična kinaza 1 (CLK1) ima ključnu ulogu u spajanju gena M2 virusa H1N1 virusa gripe i važna je meta protiv gripe. M2 je protonski kanal u virusnoj ovojnici virusa influence A [56,57]. Pokazano je da je galokatehin{10}}galat izolovan iz Pithecellobium clypearia inhibitor cdc2-kao kinaze 1 domaćina (CLK1), mete protiv gripe zbog svoje uloge u alternativnom spajanju virusne M2 mRNA. Istraživanja učinka galokatehin{16}}galata u dnevnoj dozi od 30 mg/kg na ICR miševe inficirane virusom H1N1 pokazala su značajno veće preživljavanje do 8 dana. Takođe je inhibirao virusom izazvane akutne povrede pluća i gubitak težine. Dodatno, procjene na A549 ćelijama zaraženim H1N1- pokazale su značajnu regulaciju virusnih NP i M2 mRNA. Štaviše, fosforilacija faktora spajanja SF2/ASF i SC35, ključnih faktora za alternativno spajanje gena virusa M2, značajno je smanjena nakon tretmana galokatehin{29}}galatom [58]. Cirsimaritin (CST), flavonoid iz Artemisia scoparia Waldst. i Kitam je procijenjen u pogledu njegovih in vitro antivirusnih efekata na ćelije MDCK i THP-1 inficirane sa tri soja virusa gripa koji su pokazali vrijednosti IC50 u rasponu od 5,8 do 11,1 ug/mL, u poređenju sa 3,4 do 8,9 ug/mL za ribavirin. Podaci su pokazali da CST može efikasno smanjiti ekspresiju M2 gripa i proteina na način ovisan o dozi, tako da je potentnost CST-a pri 20 ug/mL bila veća od 10 uM standardnog antivirusnog ribavirina [59]. Luteolin je još jedan flavonoid sa inhibitornim efektom na ekspresiju M2mRNA. U MDCK ćelijama inficiranim različitim sojevima gripa, 15 μM luteolina je bilo efikasnije od 10 μM oseltamivira u ćelijama inficiranim H1N1 i H2N3. Luteolin je također smanjio ekspresiju proteina I omotača virusa gripe (COPI), posredujući ulazak virusa i endocitni put, u inficiranim stanicama [60]. Santin je flavonoid ekstrahovan iz Artemisia rupestris L., za koji je takođe sugerisano da ima efekte protiv virusa gripa kroz supresiju ekspresije M2 mRNA na način ovisan o dozi [61].

Ukazano je da bi kvercetin mogao biti vjerojatan terapeutski agens protiv infekcije gripom u ranim fazama infekcije tako da se može koristiti za profilaksu virusa gripe. Istraživanja o efektima kvercetina na ćelije MDCK i A549 inficirane sojevima virusa influence A otkrila su da on može inhibirati virusnu NP mRNA na način ovisan o dozi, s najvećom aktivnošću pri koncentraciji od 50 μM 【62】.

Istraživanja su pokazala da tricin (4'5,7-trihidroksi-3',5'-dimetoksiflavon) pokazuje antivirusno djelovanje protiv A i B sojeva gripa. RT-PCR testovi su pokazali da tricin može potisnuti sintezu mRNA proteina M u MDCK ćelijama inficiranim virusom gripa; bez značajnih efekata na biosintezu neuraminidaze i hemaglutinina. Efektivna koncentracija tricina od 50 posto, koji bi mogao inhibirati sintezu virusne mRNA, bila je 3.4-10 uM

za sojeve virusa influence A i 4,9 μM za virus gripe B. Kod miševa inficiranih virusom gripe, tricin je u dozi od 20 ug/kg poboljšao gubitak tjelesne težine i vrijeme preživljavanja [63].

2.1.3. Ulazak virusa, replikacija i infektivnost

RNK virusi kodiraju proteine ​​koristeći ćelijsku mašineriju domaćina za svoj životni ciklus. Razumijevanje ovih potreba ćelije domaćina ne samo da nas informira o molekularnim putevima koje koristi virus, već predstavlja i dodatne ciljeve za razvoj lijekova [64].

In vitro studija procijenila je učinak kvercetina i izorhamnetina na SARS-CoV-2ulazak u ACE2h ćelije. ACE2 eksprimiran na plućnim ćelijama je ko-receptor virusnog šiljka proteina i stoga je glavna meta antivirusnih agenasa protiv SARS-CoV-2. Uočeno je da ova dva flavonoida imaju visok afinitet vezivanja za ACE2 i da posljedično smanjuju ulazak virusa putem inhibicije vezivanja šiljastog proteina za ovaj receptor [65]. Druga studija procijenila je učinak baicaleina na infekciju SARS-CoV-2 u Vero E6 ćelijama i hACE2 transgenim miševima. Uočeno je značajno smanjenje in vitro i in vivo replikacije virusa, kao i gubitak tjelesne težine i ozljede pluća kod životinja [66]. Dihidroksi-6'-metoksi-3',5'-dimetilhalkon i miricetin-3'5'-dimetil eter 3-O- -D-galaktopiranozid su flavonoidi izvedeno iz Cleistocalyx operculate(Roxb.) Merry. i LM Perry. Test smanjenja citopatskog efekta (CPE) pokazao je da ovi flavonoidi inhibiraju virusnu replikaciju virusa gripe H1N1 u MDCK ćelijama. Studije odnosa strukture i aktivnosti (SAR) su pokazale da OH grupe na C-7 i C-4, dvostruka veza između C-2 i C-3, a posebno karbonilna grupa na poziciji C-4, nalaze se kritične funkcionalne grupe koje značajno poboljšavaju antivirusna svojstva flavonoida [67].3-deoksisappanhalkon (3DSC) izolovan iz Caesalpinia sappan L. može inhibirati replikaciju virusa gripe u visokim koncentracijama putem inhibicija ekspresije virusnog NP u MDCK ćelijama inficiranim virusom H1N1. U jednakoj koncentraciji (30 uM), i ribavirin i 3DSC su pokazali značajnu inhibiciju ekspresije NP, iako je ribavirin imao jači efekat [68]. Studije su pokazale da biohanin A i baicalein inhibiraju aktivaciju kaspaze{42}}, enzima uključenog u replikaciju virusa [53,69]. Ovi spojevi također mogu inhibirati nuklearni izvoz virusnih RNP kompleksa, što je ključno za replikaciju virusa [53]. Biochanin A je pokazao inhibitorni efekat protiv p38 aktiviranog mitogenom i NF-kB, za koje se pokazalo da su uključeni u replikaciju virusa. NF kB i p38 se aktiviraju zbog oksidativnog stresa i poznato je da utiču na replikaciju i patologiju virusa influence A [53,70]. Istraživanja na ćelijskim kulturama MDCK ćelija i ćelija A549 inficiranih virusom gripe pokazala su da baicalein može inhibirati replikaciju virusa u koncentracijama od 20-80 ug/mL. Zanimljivo je da je baikalin pokazao slično antivirusno djelovanje kao ribavirin i oseltamivir u koncentracijama od 40 ug/mL i 60 ug/mL, respektivno. Baicalin je takođe inhibirao replikaciju virusa u plućima miševa in vivo[71]. Pokazalo se da CST smanjuje NF-kB protein i NF-KB fosforilaciju u jezgru [59]. Već je poznato da NF-KB ima važnu ulogu uupala, oksidativni stresi supresija imuniteta domaćina [72]. Smanjenje regulacije NF-kB također inhibira replikaciju u različitim tipovima virusa, uključujući virus gripe [73].

U Vero E6 ćelijama inficiranim SARS-CoV-2, naringenin bi mogao inhibirati CPE na način ovisan o vremenu i koncentraciji. Ovaj efekat je posredovan inhibicijom endo-lizozomalnih dvopornih kanala (TPC), što je put koji uključuje infektivnost SARS-CoV-2, ebole i MERS-a putem olakšavanja ulaska virusa [74]. EGCG je pokazao inhibitorni efekat ovisan o dozi (25,50 μM) na replikaciju HIV-a u T-ćelijama; međutim, inhibicija replikacije virusa nije bila direktno pogođena RT inhibicijom. Fassina et al. analizirali su enzim p24, koji je uključen u pakovanje virusnih čestica. Rezultati su pokazali smanjenje koncentracije p24 i RT aktivnosti kod HIV-inficiranih T limfoblasta. Na osnovu sljedećih rezultata, zapaženo je da EGCG inhibira replikaciju virusa kroz smanjenje regulacije virusne infekcije. Još uvijek nema sigurnosti o tačnom efektu EGCGon virusne infekcije [75]. gp120 signalizacija je obično povezana sa povećanom replikacijom HIV-1 u prethodno inficiranim ćelijama[75]. Studije pokazuju inhibitorni efekat genisteina na gp120 i, kasnije, replikaciju HV-1 virusa. Nije bilo promjena u replikaciji virusa nakon primjene

istracija genisteina u koncentraciji od {{0}},5 ug/mL, ali u rasponu od 5-10 ug/mL, genistein bi mogao potisnuti replikaciju virusa [76]. Herbacitrin je flavonoid koji se dobija iz Drosera peltata Thunb. i ranije je bio poznat kao antivirusni agens. Pokazalo se da herbacitrin inhibira i RT i integrazu u HIV-1 inficiranim MT-4 i MT-2 ćelijskim kulturama, što rezultira blokadom replikacije virusa u različitim fazama. U koncentraciji od 21,5 ug/M, herbacitrin bi mogao potisnuti R aktivnost, dok bi mogao inhibirati integrazu u nižoj koncentraciji, 2,15 uM [77]. Scutellarin pročišćen od Erigeron breviscapus je flavonoid sa anti-HIV-1 djelovanjem. Ovaj flavonoid je inhibirao HIV{14}} RT aktivnost i fuziju ćelija kao glavni učesnici virusne replikacije [Z8]. Hesperidin i linarin su flavonoidi sa rutinozom u A prstenu i metoksi (-OCH3) supstitucijom u B prstenu. Pokazalo se da izokvercetin inhibira replikaciju virusa influence A i B u inficiranim MDCK stanicama. Kombinacija izokvercetina sa amantadinom također je pokazala sinergistički učinak na replikaciju virusa u MDCK stanicama inficiranim virusom influence A samo u malim dozama (0,5 uM za izokvercetin i 1 uM za amantadin). Vrijednosti titra virusa nakon primjene izokvercetina i amantadina bile su oko 7,5; povećanje koncentracije izokvercetina i amantadina smanjilo je sinergistički učinak na titre virusa na vrijednost od 5 [79]. Q3R izveden iz Houttuynia cordata ispoljava efekte protiv virusa gripe. Efekti Q3R na MDCK ćelije inficirane virusom influence A upoređeni su sa oseltamivirom. Q3R je više inhibirao plućne lezije i edem nego oseltamivir. Q3R je takođe imao veću efikasnost u poređenju sa oseltamivirom. Inhibicijski efekat Q3R na replikaciju virusa gripa bio je indirektan i kroz interakciju sa virusnim česticama. Oseltamivir je pokazao umjerenu antivirusnu aktivnost, oko 58 posto protiv virusa influence A, i slabu antivirusnu aktivnost manje od 49 posto s dozama ispod 10 ug/mL; dok je Q3R pokazao 86 posto inhibicije virusa pri 100 ug/mL i 66 posto inhibicije u koncentracijama od 10 ug/mL [80]. Pokazalo se da kvercetin 3- -OD-glukozid (Q3G) sprječava replikaciju virusa ebole in vitro. Profilaktička primjena Q3G 30 minuta prije infekcije pokazala je značajnu prevenciju virusa ebole. Q3G takođe može inhibirati ulazak virusa u ranim fazama. Dakle, O3G bi mogao biti efikasan flavonoid za profilaksu virusa ebole [81].

2.2.Indirektni antivirusni efekti

2.2.1. Utjecaj na interferone

Interferoni (IFN) sastoje se od grupe proteina koje proizvodi nekoliko imunoloških stanica kao odgovor na mnoge patogene poput virusa, parazita, bakterija i tumorskih stanica. Postoje tri glavne klase IFN-a, uključujući tip I ili interferone stabilne na kiselinu (IFN-podtipovi, IFN-, IFN-K, IFN-e, IFN-w i IFN-t), tip II (IFN-y), i IFN tipa III koji su poznati kao IFN-λ 【82-84】. Oni pokazuju širok spektar bioloških aktivnosti kao što je aktivacija urođenog imunološkog odgovora, povećanje ekspresije molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), supresija angiogeneze. Njihova najvažnija uloga je da ometaju virusne infekcije [84,85].

U ranim fazama virusne infekcije, IFN aktiviraju urođeniimunološki sistem. Nedavne studije su prijavile smanjenje indukcije i signalizacije IFN tipa I i tipa I kod pacijenata sa COVID-19 [86]. Ove vrste IFN-a su pokazale antivirusno djelovanje smanjenjem imigracije neutrofila na mjesto upale, povećanjem prezentacije antigena, suzbijanjem pro-upale posredovane mononuklearnim makrofagom i aktiviranjem stečenog imuniteta za progresiju odgovora B i T stanica specifičnih za antigen [ 86-90]. Stoga bi upotreba IFN-a u ranoj fazi bolesti mogla smanjiti simptome COVID-19 smanjenjem replikacije virusa. Istraživači su također izvijestili da bi se nivoi IFN-a mogli povećati kod pacijenata sa COVID-19 sa ARDS-om. Brzi porast nivoa IFN-a mogao bi potaknuti proinflamatorne citokine u alveolarno tkivo i rezultirati upalom pluća i ozljedom pluća[90,91]. Stoga se čini da bi pojačana ili disregulacija odgovora IFN-a i drugih proinflamatornih citokina ili oboje mogli imati značajnu ulogu u progresiji i patološkim karakteristikama SARS-CoV-2.

Neka al. istražiti efekte baikalina protiv gripe, glikoziloksi flavona koji je 7-O-glukuronid baicaleina, u in vitro i in vivo modelu infekcije virusom influence A. Faktor 6 (TRAF6) povezan sa TNF receptorom je efikasan medijator u signalnom putu proizvodnje IFN. Prekomjerna ekspresija TRAF6 dovodi do povećane proizvodnje IFN tipa I [54]. MikroRNA (miRNA) su male molekule koje kontroliraju regulaciju gena nakon transkripcije [92]. Pokazalo se da miR-146a ima regulatornu ulogu u upali [93]. miR-146a bi mogao poboljšati replikaciju H1N1 i H3N2 kroz smanjenje TRAF6. Baicalin (20 ug/mL) je pokazao značajno smanjenje ekspresije miR-146a, virusnog NP, nivoa Ml proteina, virusnog titra, a također je povećao stopu preživljavanja miševa [54]. U drugoj studiji, Nayak i kolege su predstavili aktivnost baikalina protiv virusa gripe (H1N1-pdm09) kroz regulaciju virusnog proteina NS1, što je rezultiralo povećanjem regulatornog faktora interferona 3 (IRF-3), IFN - , i IFN- . Ova pojačana regulacija IFN-a smanjila je replikaciju virusa što bi moglo smanjiti virusne transkripte i ekspresiju proinflamatornih citokina, uključujući IL-8 i TNF-x [55].

Ding et al. dizajnirao je studiju za istraživanje efekata hesperidina, flavanon glikozida, na ozljedu pluća uzrokovanu virusom gripe A (H1N1) kod mužjaka pacova. Rezultati su pokazali da hesperidin ublažava ozljedu pluća smanjenjem proizvodnje proinflamatornih citokina, uključujući IFN-, TNF-x i IL-6, supresijom MAPK signalnih puteva. Hesperidin je također smanjio IFN- u H1N1 inficiranim plućnim mikrovaskularnim endotelnim stanicama [94]. U drugoj studiji Kim et al. izokvercetin je efikasno ublažio ozljedu pluća uzrokovanu virusom H1N1 kod miševa smanjenjem IFN-, iNOS, RANTES, titara virusa, virusnog bronhitisa i bronhiolitisa [79].

Oroxylin A (OA) iz Oroxylum Indicum(L.)Kurz spriječio je ozljedu pluća uzrokovanu virusom gripe A H1NI kod miševa putem pojačane regulacije IFN- i IFN- 【52】. Wogonin, još jedan flavonoid izolovan iz Scutellaria baicalensis Georgi, pokazao je značajnu aktivnost protiv gripe regulacijom AMPK puteva. Wogonin je također povećao regulaciju IFN-, IFN-λl i IFN nizvodnih molekula, uključujući gen otpornosti na miksovirus A (MxA) i 2-5' oligoadenilat sintetazu (OAS), u MDCK i A549 inficiranim ćelijama [95].

2.2.2. Učinak na proinflamatorne citokine (TNF, IL i MCP)

CoV sadrže neke otvorene okvire za čitanje koji kodiraju nekoliko pomoćnih proteina. Pokazalo se da ovi pomoćni proteini moduliraju inflamatorne puteve kao što su IFN signalizacija i proinflamatorni citokini [96]. Razjašnjeno je da bi prognoza COVID-19 mogla biti pogoršana lučenjem proinflamatornih citokina, uključujući interleukine, IFNy i TNF- [97]. Blanco-Mello i saradnici su ukazali da neodgovarajući imunološki odgovor može pomoći umnožavanju virusa i komplikacijama zbog teških vrsta COVID-19 [98]. Ruan i saradnici su također pokazali da je povišenje inflamatornih citokina kao što je IL-6 povezano sa ARDS-om, respiratornom insuficijencijom i nepovoljnim kliničkim ishodima [99]. Respiratorna insuficijencija uzrokovana oštećenjem pluća rezultat je prekomjerne proizvodnje proinflamatornih citokina nakon infiltracije imunoloških stanica u pluća [100]. Citokinska oluja je sistemski upalni odgovor povezan sa širokim spektrom faktora poput infekcija i određenih lijekova. Nekoliko studija je pokazalo značajnu povezanost između citokinske oluje, teške upale i zatajenja više organa kod pacijenata sa COVID-19 [101-103]. Prepoznavanje virusa SARS-CoV{16}} sa urođenim i adaptivnim imunološkim sistemom moglo bi rezultirati aktivacijom i proizvodnjom upalnih citokina. Prema nedavnim studijama, nivoi proinflamatornih citokina u plazmi su povećani kod pacijenata sa COVID-19. Ovi inflamatorni citokini kao što su TNF-, IL6, IL 2, IL-1, IL7, IL 10 i IL-18, kao i protein hemoatraktant monocita-1(MCP-1 ), imaju ključnu ulogu u patološkoj progresiji i težini COVID-19 kroz povećanje virusnog opterećenja, upale pluća, oštećenja pluća, neuroloških poremećaja i mortaliteta [97,101].

Ovi događaji mogu dovesti do otkazivanja više organa i ozljede pluća kao glavne komplikacije SARS-CoV-2; stoga se modulacija proinflamatornih citokina može smatrati razumnim ciljem liječenja kod COVID-19. Osim toga, u mnogim studijama su dokazani značajni protuupalni efekti flavonoida; stoga, oni mogu biti obećavajući spojevi u borbi protiv komplikacija povezanih s upalom COVID-19 [97].

Yang et al. dokazao je zaštitni efekat 3-deoksisapanhalkona (30 μM) na in vitro upalu izazvanu virusom gripe H1N1 i apoptozu smanjenjem nivoa IL-1 i IL-6 [68]. Baicalein, flavon i biochanin A, O-metilirani izoflavon, smanjenu ekspresiju proinflamatornih citokina u A549 stanicama i primarnim makrofagima (MDM) izvedenim iz ljudskih monocita inficiranim sojevima virusa gripe H5N1, koji bi mogli spriječiti upalno oštećenje tkiva i aktivaciju putanja [53]. U A549 i MDCK ćelijama inficiranim gripom A, baicalin, glikozilirani oblik baicaleina (baicalein{17}}glukuronid), mogao bi povećati nivoe IFN, što rezultira smanjenjem proizvodnje proinflamatornih citokina. Stoga su IL-8 i TNF- bili značajno niži u ćelijama tretiranim baikalinom u poređenju sa netretiranim kontrolnim ćelijama [55].

In vitro studija je pokazala da koncentracije CST-a, dimetoksiflavona od 2,5, 5 i 10 ug/mL, imaju značajan uticaj na slabljenje puta transdukcije NF-kB signala u THP-1 ćelijama inficiranim gripom A (H1N1) virus. Nakon inhibicije NF-kB, dolazi do proizvodnje proupalnih citokina uključujući I-1, IL-8, IL-10 i TNF-, kao i proteina COX{{ povezanog s upalom 15}}, suprimirani su CST-om na način ovisan o dozi[59]. U in vitro studiji koju su sproveli Yonekawa et al. o antivirusnim svojstvima hesperidina i linarina, ovi flavonoidni glikozidi su inhibirali replikaciju R5-HIV-1-NL(AD8) virusa u CD4 plus NKT ćelijama povećanjem proizvodnje antiinflamatornih citokina uključujući IL-2, IL-5 i IL-13. Uočeno je da stimulativni efekat ova dva flavonoida kritično zavisi od ostatka šećera jer aglikoni (hesperetin i akacetin) nisu pokazali takvu aktivnost. Nadalje, metoksi(-OCH3) supstitucija na B prstenu je neophodna za stimulacijsku aktivnost hesperidina i linarina na CD4 plus NKT ćelijama. Oni također mogu izazvati sekreciju RANTES, MIP-1 i MIP-1 iz V61 plus eksprimirajućih T ćelijskih receptora koji su kasnije potisnuli replikaciju virusa u CD4 plus NKT ćelijama[104]. Kang et al. izvijestili su o efektima pročišćenih flavonoida iz Pithecellobium clypearia Benth protiv gripe na in vitro modelu infekcije virusom influence A. Ovi pročišćeni flavonoidi su potisnuli proizvodnju IL-6 i MCP-1 u H1N1-inficiranim ljudskim A549 ćelijama pluća[105]. Mehrbod i dr. istraživali protuupalni učinak kvercetin-3-O- -L-ramnopiranozida (Q3R), glikoziliranog flavona, na MDCK ćelije inficirane virusom gripa H1N1. Q3R u koncentraciji od 150 ug/mL značajno je smanjio titar virusa i povećao proizvodnju IL-27, što bi moglo dodatno povećati lučenje IL-10 CD4 plus T ćelijama i poboljšati njihovu antivirusnu aktivnost. S druge strane, O3R je potisnuo proizvodnju TNF-a kao jednog od važnih inflamatornih medijatora koji izaziva groznicu i pokreće NF-kB proinflamatorni put, dodatno pogoršavajući stanje pacijenata [106]. Trimetoksi flavon Santin pokazao je aktivnost protiv gripe u THP-1 i MDCK ćelijama u koncentraciji od 60 μM. Virus gripe A (H3N2) inducira proizvodnju pro-upalnih citokina u THP-1 stanicama što rezultira upalom i ozljedom pluća [61]. Protuupalni citokini također mogu biti izmijenjeni tokom infekcije virusom gripe. IL-10 je protuupalni citokin koji može biti induciran virusom influence. IL-10 inhibira invarijantne prirodne T ćelije ubice smanjujući proizvodnju IL-12 dendritskim ćelijama iz plućnih monocita[107]. Nivoi IL-6, IL-8, IL-10, IL-1 i TNF- su značajno smanjeni u grupi liječenoj Santinom kroz smanjenje MAPK i NF- kB signalni putevi [61].

Pored navedenog, galokatehin{0}}galat, genistein i teaflavini su drugi flavonoidi sa modulirajućim efektima na proizvodnju proinflamatornih citokina [58,76,108]; stoga se čini da ovi molekuli imaju poželjan protuupalni učinak, koji pomaže u kontroli upale povezane s virusnom infekcijom.

2.2.3. Učinak na sub-ćelijske upalne puteve (NF-kB, PI3K/Akt i MAPK/JNK)

Kada virus uđe u ćeliju domaćina, ćelija domaćin prepoznaje njegovu replikaciju preko receptora za prepoznavanje uzoraka (PRR)[109]. Struktura RNK virusa je uključena u oligomerizaciju PRR-a i aktivaciju nizvodnih transkripcionih faktora, posebno regulatornih faktora interferona (IRF) i NF-kB. Aktivacija NF-kB i IRF-a dovodi do uključivanja ćelijske antivirusne odbrane indukcijom interferona tipa I i I i sekrecijom hemokina [110].

Chiou i saradnici su istraživali efekte 8-prenylkaempferola (8-PK) u A549 ćelijama inficiranim virusom influence A (H1N1). Rezultati su pokazali da je ometanje PI3K-Akt puta glavni mehanizam 8-PK koji vodi do zaštitnih efekata protiv virusa gripa A.8-PK smanjuje NF-kB i IRF-3 nuklearnu translokaciju kroz slabljenje Akt fosforilacije i aktivnosti PI3K. Konačno, sa smanjenom proizvodnjom regulirane aktivacije, normalne T ćelije eksprimiraju i luče (RANTES) kroz H1N1-inficirane A549 ćelije [111]. Zhu et al. predstavlja autofagiju izazvanu virusom influence A (H3N2) u ćelijama zaraženim A549 i Ana{20}} putem supresije mTOR signalnog puta. Baicalin bi mogao povećati fosforilaciju mTOR i spasiti efekte virusa H3N2 na način ovisan o dozi [112]. U drugoj studiji, otkriveno je da baicalin ispoljava aktivnost virusa gripe (H1N1-pdm09) smanjenjem regulacije PI3k/Akt puta uzrokovanog modulacijom ekspresije virusnog proteina NS1 55]. Osim toga, biohanin A, O-metilirani izoflavon, pokazao je zaštitne efekte na ćelije inficirane virusom H5N1 gripa A kroz smanjenje fosforilacije AKT, ERK1/2, JNK i p38. Također bi mogao modulirati ćelijske signalne puteve, smanjiti IL-6, IL-8, CXCL10(IP-10), TNF- i poboljšati nivoe IkB [53].

CST je predstavljao inhibitorne efekte na in vitro model infekcije virusom influence A kroz inhibiciju signalnog puta NF-kB/p65, što je rezultiralo smanjenjem proinflamatornih citokina. CST je takođe smanjio nivoe fosfo-p38 MAPK i fosfo-JNK [59]. U drugoj studiji Dinga et al., primjena hesperidina u dnevnim dozama od 200 i 500 mg/kg tokom pet dana mogla bi inhibirati upalu pluća kod ozljede pluća izazvane virusom gripe A (H1N1) kod pacova. Ovaj efekat je posredovan putem slabljenja proizvodnje proinflamatornih citokina, uključujući IL-6 i TNF-. Hesperidin je također smanjio ekspresiju IL-6 i TNF-a u H1N1 inficiranim plućnim mikrovaskularnim endotelnim stanicama putem inhibicije MAPK signalnih puteva [94]. Nadalje, studije su predložile ERK signalni put kao glavni modulator MAPK signalnog puta. Izorham-netin (50 μM), monometoksi flavon, smanjio je fosforilaciju ERK u MDCK ćelijama nakon infekcije virusom gripa A(H1N1) [113]. Jeong i kolege su istraživali citotoksične efekte piroksilina A i tektorigenina u CHME5 ćelijama i primarnim ljudskim makrofagima inficiranim HIV-om-1-D3. Ovi flavonoidi ispoljavaju svoje efekte kroz smanjenje fosforilacije PI3K, Akt, mTOR, PDK1, GSK-3 i Bada u ćelijama tretiranim lipopolisaharidom/cikloheksimidom Santin je potisnuo replikaciju virusa influence A u MDCK i THP{{32} inficirane ćelije [114]. Pri koncentraciji od 60 uM, Santin je oslabio fosforilaciju p38 MAPK, ERK, JNK/SAPK i NF-kB[61].