Obrazac ekspresije -tubulina, inverzina i njegova meta razbarušena-1 i morfologija primarnih cilija u normalnom razvoju i bolesti bubrega kod ljudi

edmund.chen@wecistanche.com

sažetak:Prostorno-temporalna ekspresija -tubulina, inverzije i razbarušenih-1 (DVL-1) proteina povezanih sa Wnt-signalnim putem i primarna morfologija cilija analizirani su u razvojububrezi(14.-38. razvojna sedmica), zdrav postnatalni (1.5- i 7- godina) i patološki promijenjen čovjekbubrezi,uključujući multicističnu displastikububrezi(MCDK), fokalna segmentalna glomeruloskleroza (FSGS) i nefrotski sindrom finskog tipa (CNF). Analiza je izvršena dvostrukom imunofluorescencijom, elektronskom mikroskopijom, semikvantitativnim i statističkim metodama. Citoplazmatska ko-ekspresija -tubulina, inverzija i DVL-1 uočena je u proksimalnim izvijenim tubulima (pct), distalnim uvijenim tubulima (dct) i glomerulima (g) analiziranih tkiva. Tokombubregrazvoja, ukupna ekspresija -tubulina, inverzije i DVL-1spala je, dok je u postnatalnom periodu blago porasla. Najveće ekspresije -tubulina i inverzije karakteriziraju dct i g, dok visoki DVL-1 karakteriše pct. -tubulin, inverzija i DVL-1 obrasci ekspresije u MCDK, FSGS i CNFbubreziznačajno se razlikovala od zdrave kontrole. U poređenju sa zdravimbubrezi, patološki promijenjenbubreziimao dismorfne primarne cilije. Različita dinamika ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 tokombubregrazvoj bi mogao ukazati na to da je prebacivanje između kanonskog i nekanonskog Wnt signala od suštinskog značaja za normalnobubregmorfogeneza. Nasuprot tome, njihov poremećen izraz u patološkombubrezimože biti povezana s abnormalnim primarnim cilijama, što dovodi do kroničnogbolesti bubrega.

Ključne riječi:razvoj bubrega kod ljudi; -tubulin; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; bubrezi, bubrezi

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLESTI BUBREGA/BUBREGA

Uvod 

Razvoj definitivnog ili metanefričkogbubrezipočinje tokom pete gestacijske sedmice (GW), koja se zatim kontinuirano diferencira i formira trajne bubrege [1,2]. Signalne interakcije između metanefričnog mezenhima i ureternog pupoljka osiguravaju pravilnububregrazvoj tokom nefrogeneze. Ukratko, mokraćovod inducira prijelaz mezenhima u epitel (MET) u metanefričnom mezenhimu, koji se kondenzira i formirabubrežnivezikule, zatim tijela u obliku zareza i S, i na kraju dovode do formiranja glomerula [3]. Zauzvrat, mezenhim indukuje dalje grananje ureternog pupoljka. Metanefrični bubrezi postaju funkcionalne jedinice za izlučivanje u 11. nedelji ljudskog razvoja. Međutim, nefrogeneza se završava u periodu od 34. do 36. nedelje fetalnog razvoja, kada se završi višestruko grananje, ali se dalji proces diferencijacije bubrega nastavlja u postnatalni period [4,5]. Poremećaji ovih složenih interakcija rezultiraju različitim kongenitalnim abnormalnostima bubrega i urinarnog trakta (CAKUT), uključujući displaziju, policističnu bolest bubrega, multicističnu displastikubolest bubrega(MCDK), što posljedično dovodi do kroničnogbolest bubrega(CKD) [6].

U ovoj studiji bili smo fokusirani na izgled primarne cilije i Wnt-signalni put, koji igra važnu ulogu tokom normalne nefrogeneze i ububregproces oporavka, nakon akutnog ili kroničnogbolest bubrega[7]. Postojanje primarnih cilija tokom nefrogeneze i veliki broj razvojnihbubregdefekti koji se javljaju kod pacijenata sa cilijarnom bolešću ukazuju na to da je prava primarna funkcija cilija neophodna za normalnobubregorganogeneza [8,9]. Primarni cilijum je organela zasnovana na mikrotubulama važna za homeostazu tkiva, gde je -tubulin osnovna komponenta [10]. Gubitak acetilacije -tubulina u imortaliziranim stanicama pokreće tranziciju epitela u mezenhim (EMT), što implicira da je acetilirani -tubulin važan u stabilizaciji mikrotubula [11]. Tokom ljudskog razvoja, primarni Wnt put posredovan cilijama omogućava proliferaciju, diferencijaciju i morfogenezu tkiva [12]. Značajan broj djece sa poremećenom funkcijom primarne cilije i poremećenim Wnt-signalnim putem razvija CKD, gdje je kongenitalnabubrežniporemećaji su odgovorni za skoro polovinu slučajeva [13]. Najčešća kongenitalna cistična bolest kod djece je multicistična displastikabolest bubrega(MCDK) [14]. Višestruke ciste koje ne komuniciraju [15] i nemaju normalnebubrežniparenhima su karakteristični mikroskopski nalazi za MCDK. Fokalna segmentalna glomeruloskleroza (FSGS) jedna je od najčešćih glomerularnih bolesti koje dovode do krajnjeg stadijumabolest bubrega[16]. U početku, FSGS je karakterističan po tome što je fokalni, zahvaća samo manji dio glomerula i segmentalan, koji uključuje promjene samo u segmentu glomerularnog kruga [17]. Kongenitalni nefrotski sindrom finskog tipa (CNF) je neuobičajena autosomno recesivno naslijeđenabolest bubregapredstavljeno prenatalnim izbijanjem ekstenzivnog gubitka proteina [18], povezanog sa cistogenezom proksimalnih tubula [19]. Mnogi oblici primarnih glomerularnih bolesti razvijaju proteinuriju kao rezultat oštećene barijere glomerularne filtracije [20]. Značajna količina studija implicira da ozljede i disfunkcija podocita imaju suštinsku ulogu u patogenezi proteinurije CKD [21]. Studija Vukojevića i sar. pokazuje povećan broj trepetljastih i slabo diferenciranih podocita u CNF [22]. Prethodne studije su pokazale da Wnt/-catenin signalni put ima fundamentalnu ulogu u moderiranju disfunkcije podocita sa proteinurijom [23]. Postoje dva glavna puta Wnt-signalizacije, jedan poznat kao kanonski - zavisan od katenina i drugi nekanonski - nezavisan od -catenin. Tokom mišabubregrazvoja, kanonska Wnt-signalizacija je aktivna na vrhovima mokraćovodnih pupoljaka i u tijelima u obliku slova S [24]. Nadalje, Wnt putem kanonske signalizacije ima značaj za održavanje MET tokom nefrogeneze [25]. Naime, vezanje proteinskog kompleksa koji sadrži Dvl za membranski receptor je obavezno za aktivaciju Wnt puta, dok onemogućavanje ključnih komponenti ovog puta dovodi do ranog perinatalnog mortaliteta zbog odsustva nefrogene zone ububreg[25]. 

Utvrđeno je da je protein koji je ključan kao molekularni prekidač između kanonskih i nekanonskih Wnt signalnih puteva inverzija [26]. Iako su otkrivene interakcije različitih proteina s inverzijom, njihova točna funkcija još nije u potpunosti razjašnjena. Ububrežniepitelnih ćelija, inverzija se nalazi u primarnim cilijama, djelujući kao cilijarni protein [27]. Osim toga, inverzija formira stabilan kompleks sa tubulinom u kulturamabubrežnićelije, a one se kolokaliziraju in vivo [27,28]. Čini se da inverzija igra bitnu ulogu u ranoj morfogenezi pronefričnog sistema i određivanju simetrije lijevo-desno tokom razvoja [29,30]. Značajan događaj i za kanonske i za nekanonske Wnt-signalne puteve u regrutaciji citoplazmatskog Dvl-a na ćelijsku membranu. Budući da su prethodni nalazi pokazali da se inverzija i Dvl kolokaliziraju u bubrežnim epitelnim stanicama, može se spekulirati da bi inverzija također mogla imati ulogu u nekanonskoj signalizaciji. Disregulacija Wnt-signalizacije posredovana inverzijom izaziva aberantnu proliferaciju u tubulima [31]. Genetski testovi su otkrili mutaciju DVL-1 kod pacijenata sa autosomno dominantnim Robinowovim sindromom, što predstavlja heterogene poremećaje kod nekih pacijenata povezanih sa urogenitalnim ibubrežnianomalije [32].

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREZNU DIJALIZU

Razvojni obrazac ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 je istražen na različitim životinjskim modelima. Tako je njihova ekspresija u pronefrosu Xenopus laevis potvrđena primjenom intravitalne mikroskopije [31], dok su konfokalnom mikroskopom i masenom spektrometrijom pronađeni u ćelijskim linijama dobivenim iz proksimalnih tubularnih stanica miša [33]. Osim toga, svjetlosna mikroskopija i dvostruka imunofluorescencija otkrile su njihovo prisustvo u dijelovima miševabubrezi[34]. Studije na inverzionim nokaut miševima su prijavile uvećane, difuzne ciste ububrežnimedula i korteks povezani sa situs visceralnom inverzijom [35]. Kod ljudi je mutacija inverzije predstavljena infantilnom nefronoftizom koja je dovela do prekida trudnoće [36]. Uprkos brojnim studijama obubrežni-tubulin, inverzija i obrazac i funkcija ekspresije DVL-1, prema našem najboljem saznanju, obrazac ekspresije ovih proteina u ljudskom fetalnom i postnatalnom ljudskom tkivu još nije istražen i doveden do korelacije. Osim toga, nisu prijavljeni dokazi koji bi razmatrali ekspresiju inverzije i DVL-1 u ranom ljudskom razvoju. Stoga je ova studija imala za cilj analizirati prostorni i vremenski obrazac ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 tokom fetalnog i postnatalnog stadija zdravog čovjeka.bubrezi, kao i ububregtkiva MCDK, FSGS i CNFbubrezikako bi se utvrdila moguća karika koja nedostaje između ovih entiteta. Naime, predlažemo da poremećeni obrasci ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 proteina mogu biti osnovni proces cistogeneze i abnormalna funkcija primarnih cilija što dovodi do hroničnebolesti bubrega. 

Rezultati

Analiza razvojnog i postnatalnogbubregtkiva rađena je na izrazito diferenciranim strukturamabubreg:proksimalni uvijeni tubuli (pct), distalni uvijeni tubuli (dct) i glomeruli (g). Tokom analiziranih razvojnih faza iu postnatalnimbubregtkiva, -tubulin, inverzija i DVL-1 su pokazali pozitivne obrasce ekspresije, ali sa razlikama u intenzitetu, distribuciji i količini. Analiza patološkogbubrežnog tkivaMCDK, FSGS i CNF je urađen na punoj slici pozitivnih ćelija u poređenju sa kontrolom zdravog bubrežnog tkiva.

2.1. Svetlosna mikroskopija, elektronska mikroskopija i imunohistohemija (-Tubulin) zdravog i patološki promenjenog postnatalnog ljudskog bubrežnog tkiva

2.1.1. Zdravo postnatalno svjetlo bubrega

mikroskopija postnatalnogbubregtkivo pokazuje dobro definisanobubregstrukture, sa jasnom razlikom između medule i korteksa i formiranja pct, dct i g u kortikalnom regionu. Imunohistohemijsko bojenje -tubulina otkriva prisustvo jedne primarne cilije u centru apikalne ćelijske površine svake tubularne ćelije i u 0.018 posto ± 0,00014 posto SD na površini glomerularnih stanica. Elektronska mikroskopija pokazuje prisustvo samo jedne primarne cilije koja proizlazi iz bazalnog tijela na apikalnoj ćelijskoj površini tubula (slika 1a).

2.1.2. CNF

Većina analiziranih g je manja i lobulirana (80 posto), dok je manjina normalne veličine ili hipertrofična (20 posto, n=100). Nađena je segmentna ili globalna skleroza g, dok su pct i dct djelimično prošireni i obloženi atrofičnim epitelom. Ultrastrukturno se uočava gubitak mikrovila i smanjenje visine ćelije uz multifragmentaciju jezgara. U podocitima se procesi stopala difuzno gube. Tubularne primarne cilije su dezorganizirane, posebno u cistama proksimalnih tubula, pokazujući promjene u dužini i položaju citoplazme (Slika 1b).

2.1.3. MCDK

U bubrežnom tkivu se mogu naći sporadični nezreli i zreli g.Bubregtkivo je ispunjeno brojnim ovalnim cistama. Stubčaste epitelne ćelije prekrivaju ciste i okružene su labavim vezivnim tkivom. Imunohistohemijsko bojenje na -tubulin pokazuje višestruke dugačke i neorganizirane primarne cilije na površini epitelnih ćelija (Slika 1c).

2.1.4. FSGS

U 90 posto g pronađena je ekstenzivna segmentna skleroza (n=100), povezana s intersticijskom fibrozom i znacima tubularnog oštećenja. Smanjenje visine epitelnih ćelija sa gubitkom mikrovila nalazi se u elektronskom mikroskopu, dok endotelne ćelije i mezangijalni regioni imaju pravilnu ultrastrukturu. U elektronskom mikroskopu, izuzetno duga i dislocirana (decentralizovana) cilija se uočava na površini distalne tubularne ćelije (slika 1e). Podociti pokazuju difuzni gubitak procesa stopala sa ekstenzivnim mikrovilusnim tkivom. Imunohistohemijsko bojenje na a-tubulin pokazuje višestruke dugačke i neorganizirane primarne cilije na površini epitelnih ćelija (Slika 1c).

2.2. Imunohistohemijsko bojenje na 心Tubulin, inverzija i DVL-1- i statistička analiza razvoja i zdravih postnatalnih ljudskih bubrega

U 14., 15. i 16. sedmici gestacije,bubregtkivo je predstavljeno različitim razvojnim fazama formiranja nefrona: od metanefričnih čašica,bubrežnivezikule stadijume da komanduju nefronima u obliku slova S, formirajući tako nefrogenu zonu u spoljašnjem korteksu (slika 2). Diferenciranje pct, dct i g može se uočiti u kortikalnim regijama bližimbubregmedula. Tokom 22. GW, dijelovi medule i korteksa postali su jasno prepoznatljivi, dok su u 38. GW,bubregstrukture se pojavljuju kao visoko diferencirane, koje sadrže zrele oblike pct, dct i g

2.2.1. a-Tubulin

Tokom razvoja, a-tubulin je snažno izražen u svim razvojnimbubregstrukture, prvenstveno vizualizirajući oblik primarnih cilija na površinama parijetalnih epitelnih ćelija Bowmanove kapsule, g, pct i dct. Unutarbubregtkivu, 82-97 posto pct ćelija eksprimira a-tubulin, dok u dct ekspresija opada sa 99 posto na 72 posto u 38. GW (vidi sliku 3, tabela 1). Među različitim razvojnim fazama, najjači izraz a-tubulina nalazi se u g 16. GW.bubrezi, koji sadrži 93 posto pozitivnih ćelija. gipki 14., 15. i 22. GW (vidi sliku 3a,b, Tabela 1), oko 70 procenata g ćelija eksprimira a-tubulin, dok je najmanja ekspresija uočena u 38. GW (p < 0,01)="" sa="" 34="" posto="" pozitivnih="" ćelija="" (slika="" 3c).="" u="">bubregtkivo (1.5- godina i 7- godinabubrezi), najjača imunoreaktivnost na a-tubulin je uočena na apikalnoj ćelijskoj površini pct i dct (slika 3d-f). Ekspresija a-tubulina je takođe prisutna u perinuklearnoj citoplazmi dct i parijetalnim epitelnim ćelijama Bowmanove kapsule. a-tubulin sve mrljebubrežnistrukture sa prosjekom od 50 posto pozitivnih ćelija u pct, 94 posto u dct i 85 posto u g (Slika 3f). Dct mrlje se značajno razlikuju od pct (p < 0,0001).="" sve="" ispitivane="" strukture="" pozitivno="" su="" obojene="" na="" a-tubulin,="" sa="" 77="" posto="" pozitivnih="" stanica="" u="" pct,="" 72="" posto="" u="" dct="" i="" 58="" posto="" u="" g="">

Slika 3. Imunofluorescentno bojenje -tubulina i DAPI u tkivima bubrega u razvoju i postnatalnim ljudskim bubrežnim tkivima (a–e). Bubrezi 14., 15./16., 38. GW (a–c);bubreziod 1.5- i 7--godišnje djece (d,e). Pozitivno bojenje -tubulina (strelice) prikazano je u svakoj strukturi u korteksu kroz razvojne i postnatalne faze (a–e), proksimalne uvijene tubule (pct), distalne uvijene tubule (dct) i glomerule (g). Detalji primarnih cilija u pct (d) i dct (a–c,e) prikazani su kao umetci većeg povećanja (bijeli okvir). Uvećanje ×40, skala bar 100 µm. Distribucija -Tubulin pozitivnih ćelija po strukturi kroz različite faze razvoja iu postnatalnom periodu prikazana je na grafikonu (f). Grafikon (g) (ukupni broj protein pozitivnih ćelija u posmatranim strukturama) prikazuje ekspresiju proteina povezanu sa vremenom razvoja (linearna regresija) i međuodnos -Tubulina sa DVL-1 kroz razvoj i sazrijevanje (dvosmjerna ANOVA praćena SIDAK-ov posthoc test). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD.

Distribucija -tubulin-pozitivnih ćelija po strukturi kroz različite faze razvoja iu postnatalnom periodu prikazana je na grafikonu (f). Grafikon (g) (ukupni broj protein pozitivnih ćelija u posmatranim strukturama) prikazuje ekspresiju proteina povezanu sa vremenom razvoja (linearna regresija) i međuodnos -tubulina sa DVL-1 kroz razvoj i sazrijevanje (dvosmjerna ANOVA praćena Sidakov post hoc test). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD.

2.2.2. Dvostruko imunofluorescentno bojenje do inverzije i DVL-1 i DAPI nuklearno bojenje u razvoju i zdravom postnatalnim bubrežnim inverzija ekspresija u razvoju i postnatalnog bubrežnog tkiva

U 14., 15. i 16. GW, inverzija pokazuje jaku granularnu ekspresiju u g, i blagu granularnu ekspresiju u citoplazmi pct i dct (slika 4a,b), dok u 22. i 38. GW (vidi sliku 4c) snažno pozitivna ekspresija je uočena u g (Tabela 1). Između 14. i 22. GW, oko 50 posto ćelija izražava verziju. U 16. GW, pct ćelije izražavaju inverziju u 73 posto ćelija, dok se smanjuju na 29 posto ćelija (p < 0,05)="" u="" 38.="" gw="" (vidi="" sliku="" 4f).="" pozitivna="" ekspresija="" inverzije="" nalazi="" se="" u="" otprilike="" 80-90="" posto="" dct="" i="" g="" stanica="" u="">bubregtkiva 14. i 16. GW, sa najnižom ekspresijom u dct 38. GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" respektivno)="" gdje="" je="" 66="" posto="" ćelija="" bilo="" pozitivno.="" u="">bubrezi, pct se snažno mrlja na apikalnoj ćelijskoj membrani, dok se dct boji uglavnom na bazalnoj ćelijskoj membrani i u perinuklearnoj citoplazmi (slika 4d,e). U toj fazi smo našli izraz inverzije kod svih istraživanihbubrežnistrukture, uključujući pct, dct i g, sa srednjom ekspresijom pozitivnih ćelija od 92 posto za pct, 88 posto za dct i 90 posto za g (Slika 4f). Nismo uočili značajnu razliku u jačini signala ekspresije inverzije između struktura. Najveća ekspresija inverzije nalazi se u g, sa prosjekom od 94 posto pozitivnih ćelija (slika 4f). Značajna razlika je pronađena u poređenju bojenja g (gdje je 94 posto ćelija pozitivno obojeno) sa pct, gdje je 58 posto ćelija pozitivno obojeno (p < 0.01)="" i="" sa="" dct,="" gdje="" je="" 49="" posto="" ćelija="" pozitivno="" (p="">< 0,0001,="" slika="">

Ekspresija DVL-1 u razvoju i postnatalnom bubrežnom tkivu

Blaga do jaka ekspresija DVL{{0}} uočena je u citoplazmi pct, dct i g u fetalnom periodu (vidi sliku 4a–c, tabela 1). U pct, 76–86 posto ćelija izražava DVL-1 u 14.–22. GW, dok u 38. GW ima 57 posto pozitivnih ćelija (Slika 4g). U dct 14. i 15. GW, 68–70 posto ćelija izražava DVL-1, u 16. i 22. GW broj pozitivnih ćelija pada na 42–5{{41} } posto , dok je u 38. GW ekspresija (p < 0,001),="" uočena="" u="" 19="" posto="" dct="" ćelija.="" ekspresija="" dvl-1="" raste="" u="" g="" kroz="" fetalne="" faze:="" u="" 14.="" gw="" iznosi="" 6="" posto,="" dok="" se="" u="" 15.,="" 16.="" i="" 22.="" gw="" povećava="" na="" 10="" posto="" (p="">< 0,01).="" u="" 38="" gw,="" 14="" posto="" g="" ćelija="" izražava="" dvl-1="" (slika="" 4="" g).="" u="" postnatalnom="" periodu,="" dvl-1="" imunoreaktivnost="" je="" raspršena="" u="" citoplazmi="" (tabela="" 1)="" i="" pct="" i="" dct="" (slika="" 4d,e).="" signal="" se="" nalazi="" u="" svim="" istraživanim="" strukturama,="" ali="" najviše="" u="" perinuklearnoj="" citoplazmi.="" intenzitet="" dvl-1="" ekspresije="" je="" značajno="" veći="" u="" pct="" u="" poređenju="" sa="" dct="" i="" g="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" procenata="" ćelija="" u="" pct="" i="" dct="" izražava="" dvl-1,="" dok="" je="" u="" g="" 21="" procenat="" ćelija="" pozitivno="" (slika="" 4="" g).="" nismo="" pronašli="" značajnu="" razliku="" između="" procenta="" imunoreaktivnih="" ćelija="" u="">bubrežnistrukture. Procenat DVL-1 imunoreaktivnih ćelija je 34 posto u pct, 36 posto u dct i 27 posto u g, respektivno (Slika 4g).

Slika 4. Dvostruko imunofluorescentno bojenje inverzije (zeleno), DVL-1 (crveno) i DAPI (plavo) u tkivima bubrega u razvoju i nakon porođaja (14.–38. GW, 1.5- i {{6 }}godišnje bubrežno tkivo). Pozitivno bojenje (strelice) je prikazano u svakoj strukturi kroz sve faze razvoja (a–c) i postnatalni period (d,e). Spojeni mikrofoni zajedno sa interesantnim strukturama u korteksu: proksimalni uvijeni tubuli (pct), distalni uvijeni tubuli (dct) i glomeruli (g). Kolokalizacija inverzije/DVL-1 (glava strelice) je prikazana na spojenim mikrofotografijama. Negativne kontrolne bojenje su prikazane kao umetci na inverziji i DVL-1 (a). Eritrociti se mogu vidjeti kao snažno obojene ćelije u blizini dct. Detalji su prikazani kao umetci većeg uvećanja. Uvećanje ×40, skala bar 100 µm. Dinamička pozitivna ćelijska distribucija inverzije i DVL-1 u strukturama bubrega (pct, dct, g) kroz razvojne i postnatalne faze prikazana je na grafikonima (f,g). Grafikon (h) prikazuje ekspresiju proteina (ukupni broj pozitivnih ćelija u strukturama) povezanu sa vremenom razvoja (Linearna regresija) i međuodnosom inverzije na DVL-1 kroz razvoj i sazrijevanje (dvosmjerna ANOVA praćena Sidakovim post hoc testom ). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD.

Ko-ekspresija inverzije i DVL-1 je uočena u citoplazmi bubrega g, dct i pct tokom razvoja (vidi sliku 4a–c, spajanje). U postnatalnom periodu, koekspresija inverzije i DVL-1 karakteriše različite ćelijske kompartmente tubularnih ćelija u pct i dct, dok koekspresija u g karakteriše jaka prevalenca ekspresije inverzije (vidi sliku 4d, spajanje ). U 7-godini postnatalnih bubrega, ko-ekspresija inverzije i DVL-1 se vidi u tubularnim ćelijama dct i pct, te u g gdje ekspresija inverzije blago prevladava u odnosu na DVL-1 (Slika 4e, spajanje).

2.2.3. Razlike u ekspresiji -tubulina, inverzije i DVL-1 između različitih razvojnih faza bubrega i postnatalnih bubrega

Broj -tubulin-pozitivnih ćelija u pct fetalnog bubrežnog tkiva bio je statistički značajno veći u poređenju sa bubrežnim tkivom djece 7-godišnje (13. (p < 0.0{="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" i="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" ranog="" fetalnog="" stadijuma="" (13.,="" 15.,="" 16.="" i="" 22.="" gw)="" imao="" je="" više="" pozitivnih="" ćelija="" u="" odnosu="" na="" bubrežno="" tkivo="" 38.="" gw="" i="" 1.{19}}="" godine="" starosti="" djece="" (p="">< 0,0001,="" slika="" 3f).="" kada="" smo="" uporedili="" različite="" razvojne="" faze,="" našli="" smo="" niže="" nivoe="" ekspresije="" inverzije="" u="" pct-u="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" i="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" gw="" u="" odnosu="" na="">bubrežnitkiva od 1.5--godišnjeg djeteta. U dct, statistički značajno niža ekspresija inverzije je pronađena upoređujući 16. GW sa 38. GW bubrežnog tkiva (p < 0.0001).="" nadalje,="" niža="" ekspresija="" inverzije="" u="" dct="" je="" uočena="" u="" bubrežnom="" tkivu="" djeteta="" 7-godine="" starog;="" upoređujući="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" oba),="" 16.="" i="" 1.5-godišnje="" bubrežno="" tkivo="" sa="" dct="" 7-godišnjeg="" bubrežnog="" tkiva="" (p="">< 0,00001,="" respektivno,="" slika="" 4f).="" uočeni="" signal="" ekspresije="" dvl-1="" kroz="" različite="" faze="" otkrio="" je="" da="" je="" pct="" 13.="" (p="">< 0.01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Veza između ekspresije -tubulina i inverzije na DVL-1 u razvoju i postnatalnog bubrežnog tkiva

- Ekspresije tubulina i inverzije su upoređene sa ekspresijom DVL-1 kroz razvojne faze iu postnatalnom bubrežnom tkivu. -tubulin je imao statistički veću ekspresiju u svim posmatranim fazama, u poređenju sa ekspresijom DVL-1 (p < 0.001,="" slika="" 3g).="" kroz="" sve="" posmatrane="" faze,="" inverzija="" je="" imala="" veću="" ekspresiju="" u="" odnosu="" na="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" slika="" 4="">

2.2.5. Poređenje imunohistohemijskog bojenja na -Tubulin, verzija i DVL-1- i Statistička analiza patološki promijenjenog tkiva bubrega (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Razlika bojenja -tubulina u MCDK, FSGS i CNF bila je statistički značajna u poređenju na zdravo postnatalno bubrežno tkivo kao kontrolnu grupu (p < 0.0001,="" respektivno).="" displastična="" bubrežna="" tkiva="" imala="" su="" značajno="" veću="" ekspresiju="" u="" odnosu="" na="" kontrolnu="" grupu,="" dok="" su="" fsgs="" i="" cnf="" pokazali="" značajno="" nižu="" ekspresiju="" -tubulina="" u="" odnosu="" na="" zdravu="" kontrolnu="" grupu="" (slika="">

Inverzija

Inverzija je izražena u citoplazmi neorganizovanih epitelnih ćelija i tubulima MCDK (Slika 5a). U CNF, ekspresija inverzije karakteriše g i dct, dok se manje intenzivno pokazuje u pct cistama (slika 5b). U FSGS, inverzija je snažno izražena u g i dct, ali manje intenzivno u pct cistama (slika 5c). Prostorna ekspresija inverzije pokazala je statistički značajnu veću stopu bojenja u zdravom tkivu bubrega (Slika 5g) u poređenju sa MCDK, FSGS i CNF (p <>

Slika 5. Dvostruko imunofluorescentno bojenje inverzije (zeleno), DVL-1 (crveno) i DAPI (plavo) u patološkim tkivima bubrega u MCDK (a), CNF (b) i FSGS (c): tubule (t) , glomeruli (g), pct cista (c), visina pct epitelnih ćelija (*). Struktura i ko-lokalizacija ćelija inverzije i DVL-1 (vrhovi strelica) prikazani su u spojenim sekcijama sa detaljima u umetnutim većim uvećanjima. Negativne kontrolne bojenje su prikazane kao umetci na inverziji i DVL-1 (a). Uvećanje ×40, skala 10{{20}} µm. Odnos -tubulina (d) i inverzije (e) prema DVL-1 ekspresiji u MCDK, FSGS i CNF (dvosmjerna ANOVA praćena SIDAK-ovim post hoc testom). Razlika u visini epitelnih ćelija (f) FSGS, CNF i MCDK pct u poređenju sa zdravom kontrolom (jednosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim post hoc testom, n=50). Razlika u ukupnom procentu pozitivnih ćelija -tubulina, inverzije i DVL-1 u MCDK, CNF i FSGS u poređenju sa zdravom kontrolom (g–i), jednosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim post hoc testom). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. Značajne razlike su označene p-vrijednošću (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" je="" veoma="" blago="" izražen="" samo="" u="" neorganizovanim="" tubulima="" mcdk,="" dok="" u="" cnf="" njegova="" ekspresija="" karakteriše="" dct="" i="" g="" (slika="" 5a,b).="" u="" fsgs,="" dvl-1="" je="" uočena="" kao="" blaga="" reaktivnost="" u="" g,="" dct="" i="" pct="" (slika="" 5c).="" zdrava="" tkiva="" bubrega="" obojena="" na="" dvl-1="" pokazala="" su="" značajno="" veću="" stopu="" bojenja="" (slika="" 5="" h)="" za="" razliku="" od="" mcdk="" i="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" oba),="" dok="" za="" cnf="" nije="" pronađena="" značajna="">

2.2.6. Veza između ekspresije -tubulina i inverzije na DVL-1 u patološki promijenjenom bubrežnom tkivu (MCDK, CNF, FSGS)U MCDK, FSGS i CNF, -tubulin je obojen značajno više od DVL-1 (p < 0.0001,="" respektivno,="" slika="" 5d).="" inverzija="" je="" značajno="" veća="" u="" poređenju="" sa="" dvl-1="" u="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" i="" u="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" slika="">

2.2.7. Razlike u visini epitelnih ćelija proksimalnih uvijenih tubula između zdrave kontrole i patološki promijenjenog bubrežnog tkiva (MCDK, CNF, FSGS)Upoređena je visina pct epitelnih ćelija (n {{0}} po grupi) između ćelija tubula u zdravom bubrežnom tkivu i patološki promijenjenim tkivima bubrega (Slika 5b,c,f). Srednja visina epitelnih ćelija u HC bila je 12,91 µm ± 1,847 µm i bila je značajno veća u poređenju sa CNF i FSGS (p < 0.0001).="" srednja="" visina="" ćelije="" u="" cnf="" pct="" bila="" je="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" dok="" je="" u="" fsgs="" bila="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" pct="" epitelne="" ćelije="" mcdk="" nisu="" pokazale="" značajne="" promene="" u="" visini="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" u="" poređenju="" sa="">

2.2.8. Razlike u dužini primarne cilije između zdrave kontrole i patološki promijenjenog bubrežnog tkiva (MCDK, CNF, FSGS)

Primarna dužina cilije (n= 50 po grupi) je upoređena između HC i patološki promijenjenog tkiva bubrega (Slika 6c). Zdrava tkiva bubrega i MCDK su obojeni -tubulinom kako bi se uvjerila specifičnost bojenja -tubulinom cilija (Slika 6a,b). U zdravom bubrežnom tkivu primarni cilijum je bio dugačak 5,065 µm ± 1,229 µm, dok su u MCDK, CNF i FSGS bili značajno duži (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Diskusija

Cilj našeg istraživanja bio je istražiti imunohistohemijsku ekspresiju a-tubulina, inverzije i DVL-1 u fetalnojbubrežnitkiva i postnatalnog tkiva bubrega. Nadalje, željeli smo istražiti da li je ekspresija i obrazac bojenja a-tubulina, inverzije i DVL-1 poremećen kod različitih bolesti bubrega u poređenju sa zdravom kontrolom. Naime, uprkos velikom interesovanju drugih istraživača za ulogu a-tubulina, inverzije i DVL-1 tokom razvoja bubrega, većina prethodnih studija koristila je životinje ili in vitro eksperimentalne modele. Koliko nam je poznato, ovo je prva studija koja je pokazala ekspresiju i lokalizaciju a-tubulina uz inverziju i DVL-1 u fetalnim i postnatalnim ljudskim bubrezima, a koja je istraživala ekspresiju navedenih proteina u bubrezima bolesti, kao što su MCDK, FSGS i CNF. Također smo analizirali promjene u dužini i izgledu cilija pomoću svjetlosne i elektronske mikroskopije, jer je naša prethodna studija već pokazala da poremećaji cilijara mogu biti povezani s cistogenezom u FSGF i CNF [19].

U kanonskom Wnt-signalnom putu, vezivanje Wnt liganada za receptore regrutuje Dvl [37]. Procesi MET i put polariteta ravnih ćelija tokom ranih faza morfogeneze bubrega kontrolišu se Wnt signalizacijom. Posredovanjem Wnt puta, primarne cilije kontrolišu ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju i morfogenezu tkiva [12] kroz organizovanje ćelijskog citoskeleta i orijentacije ćelije, kao i elongacije tubularne strukture [2,38]. U našoj studiji, -tubulin, inverzija i DVL-1 su bili prisutni u strukturama bubrega, i svi su kolokalizovani ne samo tokom razvoja fetalnog bubrega već iu tkivu bubrega od 1.5- i {{9 }}godišnja djeca. Ovi nalazi su u skladu sa aktivacijom Wnt-signalnog puta za koji je dokazano da se javlja već tokom tubulogeneze [39]. Dodatno, naši rezultati su otkrili da su ekspresija -tubulina i inverzija recipročno povezani sa DVL-1 i da pokazuju statistički značajnu razliku između njihovih obrazaca ekspresije. To je u korelaciji s eksperimentalnim modelima, jer mutacija pune porodice Dvl proteina kod miševa rezultira nedostatkom procesa gastrulacije, dok mutacije koje ne uključuju cijelu familiju proteina pokazuju defekte u nodalnom smještaju cilija zajedno sa defektima organa [40] . Prethodni nalazi sugeriraju da inverzija ima ulogu u migraciji stanica u Xenopus pronephros. Budući da taj segment korelira sa Henleovom petljom kod sisara i distalnim tubulima, to bi moglo ukazivati ​​na važnost inverzije tokom razvoja bubrega i kod ljudi [41]. U skladu s tom pretpostavkom, prethodne studije su otkrile da mutacija gena inverzije može dovesti do nefronoftize tipa 2, koja je posredovana abnormalnom ekspresijom DVL-1 [42]. Uprkos tome što je uloga primarnog cilijuma kontroverzna u regulaciji Wnt-signalnog puta, otkrili smo da se -tubulin kolokalizirao sa inverzijom i DVL-1 u analiziranim uzorcima bubrega. Nadalje, prethodne studije su istakle da primarna cilija zajedno sa inverzijom reguliše degradaciju Dvl-a utječući na Wnt-signalni put [43]. Kod bolesti bubrega kod ljudi povezanih s razvojem cista, uočena je abnormalna lokalizacija i funkcija primarnih cilija [19]. Slično, ova studija je također potvrdila morfološke promjene formiranja primarnih cilija u patološkim stanjima kao što su CNF, FSGS i MCDK. Prethodni nalazi su potvrdili da prekomjerna aktivacija kanonskog Wnt puta nakon oštećenja bubrega dovodi do ireverzibilnih strukturnih promjena bubrežnog tkiva [44]. Naprotiv, primarnoj cilijumu je data uloga prelaska sa kanonskog na nekanonski Wnt put u pomaganjububrežnipopraviti. Nadalje, utvrđeno je da pretjerana aktivacija kanonskog Wnt puta u transplantiranom bubrežnom tkivu ima pozitivnu prediktivnu vrijednost prema fibrozi bubrega [45]. Ako kanonski Wnt put prevladava na račun nekanonskog, on podržava teoriju o fibrozi bubrega kao ishodu. Naši nalazi o smanjenoj ekspresiji -tubulina i inverzije u CNF i FSGS impliciraju neaktivnost nekanonskog Wnt puta, posebno jer oba stanja imaju tendenciju da dovedu do završne fazebubrežna bolest.Naime, smatra se da normalna lokalizacija i funkcija primarnog cilijuma može biti faktor u održavanju pravilnog Wnt puta i samim tim preduslov za normalan razvoj. Nasuprot tome, ako je Wnt put poboljšan, to može rezultirati nereguliranom proliferacijom i diferencijacijom stanica što dovodi do karcinogeneze [46]. Kao što je prethodno opisano, kanonski Wnt put je obavezan za iniciranje MET-a i formiranje nefrona, dok njegov poremećaj može dovesti dobubrežnihipoplazija [47]. Naši rezultati podržavaju ovu ideju otkrivajući najnižu ekspresiju DVL-1 sa najvećom ekspresijom -tubulina u MCDK u poređenju sa zdravom kontrolom. Ovi rezultati mogu implicirati najnižu aktivaciju kanonskog Wnt puta, što bi mogao biti osnovni uzrok odsustva formiranja nefrona. Nasuprot tome, najveća ekspresija -tubulina sa najnižom ekspresijom DVL-1 može objasniti nalaze više cista jer nema organiziranog elongacije i ćelijske polarizacije vođene nekanonskim Wnt putem. Prethodne studije su takođe pokazale da inverzija inhibira kanonski Wnt signalni put ciljajući Dvl za degradaciju [26]. Utvrđeno je da je ovaj korak u njihovoj interakciji neophodan za inhibiciju kanonskog Wnt-signala u održavanju normalnog izduženja i pozicioniranja cijevi. Inverziona mutacija dovodi do pojačane regulacije kanonske Wnt signalizacije, što je kasnije izazvalo abnormalnu proliferaciju u tubularnim stanicama. Pokazalo se da je ovaj korak ključan u cistogenezi [42], dok nokautiranje inverzije kod miševa dovodi do policistične bolesti bubrega [48]. Prema teoriji obubrežnicistogeneze, inverzija se smatra "mikoproteinom", zbog svoje lokalizacije na primarnim cilijama ububrežnitubularne ćelije. U našem istraživanju primarne cilije su bile prisutne na apikalnoj ćelijskoj površini tubularnih ćelija u svim analiziranim fazama, dok je u fetalnim fazama ekspresija -tubulina bila jača nego u postnatalnom periodu.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOL U BUBREZIMA/BUBREZIMA

Prethodne studije su pokazale da na funkciju primarne cilije može uticati disregulacija -tubulina tokom razvoja, što može dovesti do cistogeneze, abnormalnog razvoja bubrega i moguće hronične bolesti bubrega u djetinjstvu [31,49]. Ovo je u skladu sa našim nalazima skraćenih i dismorfnih primarnih cilija uočenih u MCDK ili sa višestrukim i ekstremno izduženim ili dislociranim cilijama pronađenim u proširenim tubulima CNF i FSGS u poređenju sa zdravom kontrolom. U prilog činjenici da se kanonski i nekanonski Wnt-signalni putevi, regulirani primarnim cilijama, smatraju obaveznim za normalan razvoj bubrega, otkrili smo značajno niže bojenje inverzije i DVL-1 u MCDK u poređenju sa zdravom kontrolom [31,49]. Različita dinamika obrasca ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 kroz različite faze razvoja bubrega može ukazivati ​​na prebacivanje između kanonskog i nekanonskog Wnt-signalnog puta tokom normalne morfogeneze bubrega. Predlažemo da njihova razmjena određuje transkripciju u kanonskom putu ili redoslijedu ćelijske migracije i polarizacije tokom razvoja bubrega u nekanonskom signalnom putu. Njihova ravnoteža i izraženost u svim istraživanim strukturama bubrega implicira njihovu važnu ulogu u normalnom razvoju bubrega. Tokom normalnog razvoja bubrega (od 13. GW do 38. GW), ukupna ekspresija -tubulina, inverzije i DVL-1 se smanjuje kako tkivo bubrega dobija zrelu morfologiju. U tkivima bubrega starim 1.5- i 7--tubulin i inverzija su pokazali blagi porast ekspresije što potvrđuje činjenicu da nekanonski Wnt put ostaje aktivan nakon rođenja. Naprotiv, DVL-1 opstaje sa smanjenim obrascem ekspresije što bi moglo dodati zaključku da je kanonski Wnt put utišan u zdravom tkivu bubrega. Kao rezultat patoloških stanja bubrega, epitelne ćelije bubrega mogu reagovati ponovnim pojavom EMT-a i fibroze [50] povezane s reaktivacijom kanonskog Wnt puta [44]. Stoga, poremećaji -tubulina, inverzije i DVL-1 pronađeni u bolesnim bubrezima mogu biti osnovni patološki mehanizam i rezultat prelaska s nekanonskog na kanonski Wnt put u bubregu u razvoju, aludirajući na promjenu između reverzibilnog i ireverzibilnog bubrega. oštećenja. Nadalje, promjene u njihovim prenatalnim i postnatalnimbubrežniobrazac ekspresije može biti povezan s oštećenjem funkcije bubrega u odrasloj dobi, što dovodi do kongenitalnih bolesti i kroničnog zatajenja bubrega.

4. Materijali i metode

4.1. Human Samples

Uzorci tkiva bubrega fetusa prikupljeni su nakon gubitka trudnoće u 14., 15., 16., 22. i 38. GW na Odjelu za ginekologiju i porodništvo KBC-a Split. Sav dobijeni fetalni materijal pregledan je od strane patologa, a za ispitivanje su korištena samo tkiva bez znakova abnormalnosti, maceracija ili intrauterine smrti i sa normalnim kariogramom. Prije uzimanja uzoraka pregledana je medicinska dokumentacija majki, a u slučaju zdravstvenih problema koji bi mogli utjecati na ishod trudnoće, bubrežna tkiva su isključena iz studije. Zrelost je određivana obimom glave, obimom abdomena i dužinom femura [51] u korelaciji sa menstrualnim kalendarom pacijentica. Uzorci bubrežnog tkiva starosti 1.5- i 7- godine prikupljeni su nakon slučajne smrti. Uzorci su dobiveni na Odjelu za patologiju KBC-a Split. Uzorci multicističnog displastičnog tkiva bubrega (MCDK) dobijeni su nakon gubitka trudnoće, fokalne segmentalne glomeruloskleroze (FSGS) i nefrotskog sindroma finskog tipa (CNF) zbog nefrektomije. Sav dobijeni materijal pregledan je i evaluiran od strane patologa, koji je klasifikovao dijagnoze. Protokol studije odobrilo je Etičko povjerenstvo Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu (20. svibnja 2016.) u skladu s Helsinškom deklaracijom i njenim ažuriranjima (klasifikacijski broj: 003-08/16-03/0001, registarski broj: 2181-198-03-04-16-0024, 20. maj 2016.) [52].

4.2. Imunohistohemija

Fiksacija sakupljenog uzorka tkiva obrađena je sa 4 procenta paraformaldehida u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS) tokom 24 h na 22 ◦C. Nakon dehidracije u 100 postotnom etanolu, uzorci su stavljeni u parafin, kao što je prethodno opisano [53]. Uzorci su narezani na 5 µm debele dijelove pomoću mikrotoma i potom montirani na mikroskopska stakla. Da bi se potvrdila očuvanost tkiva, svaki 10. presek je obojen hematoksilinom i eozinom [54]. Depart-feminizacija i imunohistohemija su obavljene kao što je prethodno opisano [2,55,56]. Nakon ispiranja u PBS-u, mikroskopska stakalca su inkubirana preko noći sa primarnim antitelima u vlažnoj komori na 22 ◦C (StainTray sistem za bojenje slajdova; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Primarna korišćena antitela bila su zečja monoklonska anti-alfa tubulinska antitela (razblaživanje 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), zečja poliklonska anti-inverziona antitela (razblaživanje 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge monoclonal, UK), DV -1 antitijelo (1:150 razrjeđenje; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD) i zečje poliklonsko anti-gama tubulinsko antitijelo (kako bi se potvrdilo primarno bojenje alfa-specifično za cilije tubulin, razrjeđenje 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Nakon ispiranja u PBS-u, sekundarna antitijela su davana sat vremena kako je navedeno: magareći anti-zečji IgG H&L, Alexa Fluor 488 (razrjeđenje 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) i kozji anti-mišji IgG H&L, TRITC (razrjeđenje 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorid (DAPI) je korišten za bojenje jezgara i nakon 2-min inkubacije, slajdova oprani su u PBS-u i prekriveni medijumom za montažu i pokrovnim stakalcima. Nespecifično bojenje je spriječeno korištenjem proteinskog bloka (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) prije primarne aplikacije antitijela. Kao negativna kontrola urađen je predadsorpcijski test, dok je specifičnost sekundarnih antitijela provjerena izostavljanjem primarnih antitijela iz postupaka bojenja.

4.3. Elektronska mikroskopija

Fiksacija odbubregtkiva je izvedena u 4% paraformaldehidu tokom 24 h, nakon čega je uslijedila naknadna fiksacija u 1% osmijum tetroksidu u trajanju od 1 h. Proces dehidracije izveden je serijom etanola, a završen je ugradnjom u smolu LX 112 [22]. Tanki rezovi od jednog mikrometra su obojeni toluidin plavim i proučavani kako bi se odabrali ultratanki rezovi. Ultratanki rezovi debljine 0.05 mikrometara su ispitivani nakon bojenja uranil acetatom i olovnim citratom. Za dobijanje mikrofotografija korišten je mikroskop JEOL 1200 EX.

4.4. Genetska analiza

Kao što je prethodno opisano [19], pomoću leukocita iz periferne krvi, ekstrahirana je genomska DNK. Pronađena je homozigotna misense mutacija u genu NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg) što je potvrdilo dijagnozu kongenitalnog nefrotskog sindroma finskog tipa (CNF) [57].

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI INFEKCIJU BUBREGA/BUBREGA

4.5. Analiza podataka

Analiza preseka je izvršena na FL fluorescentnom mikroskopu koristeći 3 FL fluorescentna kanala (Olympus BX51, Tokio, Japan). Slike su snimljene digitalnom kamerom DP71 (Olympus, Tokyo, Japan) na velikom (×40) uvećanju. Samobubrežnikorteks koji sadrži proksimalne uvijene tubule (pct), distalne uvijene tubule (dct) i glomerule (g) bili su od interesa. Slike su zatim obrađene softverom ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, SAD, https://imagej.nih.gov/ij/ (pristupljeno 15. oktobra 2018.), 1997–2021. ) i Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Kalifornija, SAD) za dalju evaluaciju. Prije brojanja ćelija, korišten je alat ImageJ podijeljenih kanala. Nakon toga, originalna imunofluorescentna mikroskopska fotografija je oduzeta crvenim ili zelenim kanalom (ovisno o tome koji je izvorni kanal bio) pomoću alata ImageJ kalkulatora slike kako bi se spriječilo curenje signala. Vrijednosti ispod praga od 50 smatrane su negativnim. Izbrojali smo imunoreaktivne signale u ćelijama od najmanje 20 struktura (pct, dct ili g) po stadiju ili ukupan pozitivan broj ćelija po mikro fotografiji multicistične displastikebubregtkiva, FSGS i CNF. Klasificirali smo ćelije kao pozitivne ako se signal imunofluorescencije akumulirao na bilo kojem nivou membrane, citoplazme ili jezgra iznad vrijednosti 50 izmjerene na ImageJ softveru korištenjem threshold komande. Negativne ćelije su kategorisane kao ćelije bez ikakve imunoreaktivnosti. Dva nezavisna istraživača su analizirala podatke.

4.6. Semikvantitativna analiza

Intenzitet -tubulina, inverzije i DVL-1 signala bojenja procijenila su dva nezavisna istraživača koristeći ImageJ softver. Ukupni intenzitet signala je izmjeren nakon što je slika postavljena u 8-bit tip; nakon toga, intenzitet bojenja markerom je procijenjen u 20 pct, dct i g mjerenjem zacrtane površine strukture. Ako su rezultati između evaluatora bili različiti, treći nezavisni istraživač je razjasnio sumnju. Maksimalni intenzitet signala za -tubulin bio je 84,125 ± 3,214 SD, za inverziju 71,50 ± 2,715 SD i za DVL-1 80,916 ± 1,875 SD. Najveća zasićenost signalne boje na fotografijama mikroskopa označena je sa 3 (66,66–99,99 posto ukupnog intenziteta signalne slike), zatim 2 (33,33–66,66 posto) za srednji intenzitet signala i 1 (0,33 posto –33,33 posto) za nizak intenzitet signala (Tabela 1.).

4.7. Statistička analiza

Za određivanje razlika između faza i konstrukcija urađen je Kruskal-Wallisov test, a zatim Dunnov post hoc pomoću softvera GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego Kalifornija, SAD, www.graphpad.com (pristupljeno 15. oktobra). 2018.)). Broj pozitivnih ćelija izražen je u procentima kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD), dok je statistička značajnost potvrđena pri p < 0,05.="" broj="" analiziranih="" struktura="" bio="" je="" 4200="" u="" 35="" uzoraka,="" sa="" ukupnim="" brojem="" prebrojanih="" 135.256="" ćelija.="" koristili="" smo="" 2-način="" anova="" sa="" sidakovim="" post="" hoc="" testom="" da="" testiramo="" razlike="" u="" ekspresiji="" -tubulina,="" inverzije="" i="" dvl-1="" u="" različitim="" razvojnim="" fazama.="" za="" proučavanje="" ekspresije="" proteina="" u="" odnosu="" na="" vrijeme="" razvoja,="" koristili="" smo="" linearnu="" regresiju.="" jednosmjerna="" anova="" praćena="" tukeyjevim="" post="" hoc="" testom="" korištena="" je="" za="" istraživanje="" razlika="" u="" ekspresiji="" -tubulina,="" inverzije="" i="" dvl-1="" kod="">bubregtkiva u poređenju sa tkivima MCDK, FSGS i CNF. Razlike u ekspresiji proteina između MCDK, FSGS i CNF istražene su 2-način ANOVA nakon čega je uslijedio Sidakov post hoc test. Jednosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim post hoc testom korištena je za procjenu razlika u dužini cilija i visini epitelnih stanica pct između zdrave kontrolne i patološkebubregmaramice. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) sa statističkom razlikom priznatom na p <>