Vodonik sulfid smanjuje bubrežnu I/R-indukovanu aktivaciju upalnog odgovora i apoptoze putem regulacije inhibicije NLRP3 signalnog puta posredovane Nrf2
Mar 14, 2022
Abstract. Povreda bubrežne ishemije/reperfuzije (I/R) može dovesti do akutnezatajenje bubrega, odgođena funkcija grafta i odbacivanje grafta. Upala posredovana domenom oligomerizacije koja veže nukleotide NOD-sličan receptor koji sadrži pirin domen 3 (NLRP3) učestvuje u razvojububrežnipovreda. Nrf2 ubrzava aktivaciju NLRP3 signalnog puta i dalje reguliše upalni odgovor. Osim toga, sumporovodik ima zaštitnu ulogupovreda bubrega; međutim, detaljni osnovni mehanizam ostaje slabo shvaćen. Ova studija je istraživala da li Nrf2 i NLRP3 putevi učestvuju u regulisanju sumporovodikabubrežniI/R-indukovana aktivacija upalnog odgovora i apoptoze. Miševi divljeg tipa i Nrf2-knockout (KO) miševi su podvrgnuti operaciji da se inducirabubrežniI/R putem bilateralnog stezanjabubrežnipedicles. Ukupno 20 mg/kg MCC950 (inhibitor NLRP3) je ubrizgano intraperitonealno dnevno 14 dana prije operacije.Renaltkivo i krv sakupljeni su od miševa I/R modela radi analize nivoa ekspresije mRNA NLRP3 i Nrf2, nivoa ekspresije proteina NLRP3, PYD i CARD koji sadrži domene, kaspaze-1, IL-1, Nrf2 i proteina hem oksigenaze 1, apoptoze ćelije, lučenje faktora tumorske nekroze‑ , IL‑1 i IL‑6 citokina ibubrežnihistopatologija i funkcija.RenalI/R je aktivirao NLRP3 i Nrf2 signalne puteve. Suprotno tome, tretman MCC950 inhibirao je aktivaciju NLRP3 signalnog puta i spriječio I/R-indukovanupovreda bubrega, oslobađanje citokina i apoptoza ububrežniI/R model miševa. Natrijum hidrosulfid (NaHS) ne samo da je ublažio povećanje nivoa ekspresije NLRP3 proteina, već je i ublažiopovreda bubrega,oslobađanje citokina i apoptoza ćelija izazvana bubrežnim I/R kod miševa divljeg tipa, ali ne i kod miševa Nrf2-KO. NaHS je ublažio aktivaciju inflamasoma NLRP3,povreda bubrega,upalni odgovor i ćelijska apoptoza putem Nrf2 signalnog puta kod bubrežnih I/R modela miševa.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREZU/BUBREZU
Uvod
Ishemija/reperfuzija bubrega (I/R) je vodeći uzrok akutnog stanjapovreda bubrega(AKI) koji se obično javlja tokombubrežnioperaciju i predisponira pojedince na teške disfunkcije u više organskih sistema. I/R-indukovana ćelijska smrt i upala unutarbubrežnitkivo je povezano sa složenim patofiziološkim procesima i potiče opadanjebubrežna funkcija,što dovodi do nakupljanja metaboličkih otpadnih proizvoda (1). Pored ishemije izazvanebubrežnioštećenje tkiva, također je utvrđeno da reperfuzija pokreće složenu patofiziološku kaskadu koja uključuje prekomjerno oslobađanje slobodnih radikala i nakupljanje upalnih stanica, što potom potiče upalu i dodatno pogoršava lokalnu ishemiju i ćelijsko oštećenje (2).
Podfamilije domena za vezivanje nukleotida i porodice koja sadrži ponavljanje bogata leucinom imaju ključnu ulogu u razvoju inflamatornog odgovora (3). NLR familija pirinskih domena sadrži 3 (NLRP3) inflamasoma (ranije poznati kao NACHT, LRR i PYD domeni koji sadrže protein 3 i kriopirin) je najkarakterističniji inflamazom do sada. Sve veći broj studija izvještava o povezanosti između NLRP3 irenal I/R. U AKI je uključen NLRP3bubrežniI/R povreda (4,5). Na primjer, obaranje NLRP3 i njegovog adaptera PYD i CARD domena koji sadrži (ASC) ublažava I/R-indukovanebubrežnidisfunkcija i prekomjeran priliv neutrofila ububrežnog tkiva(6). Osim toga, uništavanje NLRP3 i/ili kaspaze-1 štiti miševe od AKI izazvanog sepsom ili lipopolisaharidom (7,8). Ovi nalazi sugeriraju da inflamasom NLPR3 može imati ključnu ulogu u patogenezioštećenje bubrega.
Nrf2 je endogeni antioksidativni gen, lociran u citosolu, koji se kombinuje sa proteinom 1 (Keap) povezanim sa ECH sličnim Kelchu. Jednom aktiviran, Nrf2 se oslobađa iz Keep-a i translocira u jezgro, gdje se potom vezuje za elemente antioksidativnog odgovora kako bi pokrenuo transkripciju svojih nizvodnih antioksidativnih i citoprotektivnih ciljnih gena, kao što su superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza, glutation-transferaza izozimi, katalitičke i modifikatorske podjedinice ‑glutamil cistein ligaze i NADP(H): kinon oksidoreduktaza (9). Ranije je objavljeno da je Nrf2 povezan sa AKI izazvanim uvredom okoline, ishemijom ili ksenobioticima(10). Osim prijavljene zaštitne uloge u ozljedama tkiva, prethodne studije su također pokazale da prekomjerna ekspresija Nrf2 potiskuje aktivnost inflamasoma NLRP3 i ublažava ozljedu tkiva (11-13). Međutim, osnovni mehanizam Nrf2 signalnog puta i njegov učinak na aktivaciju inflamasoma NLRP3 ububrežniI/R ostaje nepoznat.Vodonik sulfid (H2S) je stekao priznanje zbog svoje sposobnosti da reguliše homeostazu sisara i osnovne ćelijske procese, kao što je autofagija (14). Brojna istraživanja su objavila da H2S ima zaštitnu ulogu protiv apoptoze, oksidativnog stresa i upale upovreda bubrega(15‑20). Ipak, osnovni zaštitni mehanizam H2S upovreda bubregainduciran I/R ostaje nepoznat. Stoga je ova studija istraživala nivoe ekspresije NLRP3 i njegovog adaptera, ASC, kod miševa renalnog I/R modela, a zatim je odredila efekat Nrf2 na ekspresiju NLRP3. Ova studija je takođe imala za cilj da utvrdi da li H2S štitibubrežnog tkivaprotivpovreda bubrega,upala i apoptoza putem Nrf2-posredovane inhibicije NLRP3.
Ključne riječi:bubrežna ishemija/reperfuzijska povreda, Nrf2, sumporovodik, apoptoza, povreda bubrega; zatajenje bubrega
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLESTI BUBREGA/BUBREGA
materijali i metode
Uspostavljanje renalnog I/R modela i grupa tretmana.Ukupno 24 mužjaka miševa divljeg tipa (težine 20-25 g; starosti 6-8 nedelja) dobijeno je iz Centra za laboratorijske životinje Akademije vojno-medicinskih nauka (Peking, Kina). Osim toga, devet Nrf2-knockout (KO) mužjaka miševa (težina, 20-25 g; starost, 6-8 sedmica) dobijeno je od Junke Biological Co., Ltd. Sve protokole za životinje odobrila je Komisija za brigu o životinjama i korištenje Opšta bolnica Medicinskog univerziteta Tianjin (odobrenje br. IRB2020‑DW‑04; Tianjin, Kina), a uloženi su svi napori da se patnja životinja i broj korištenih životinja svedu na minimum. Miševi su se aklimatizirali na okolinu 3 dana prije eksperimenta na 22˚C sa 40-60 posto vlažnošću, ciklusom svjetlo/mrak od 12 sati i slobodnim pristupom vodi i hrani za glodare. Nakon što su miševi anestezirani intraperitonealnim (ip) 50 mg/kg natrijum pentobarbitala, bilateralnibubrežnipedikule su ligirane 30 min pomoću mikroaneurizma klešta. Nakon toga su uklonjene stezaljke za mikroaneurizme. U kontrolnoj grupi operacija je izvedena istim postupkom; kako god,bubrežnipedikule nisu vezane. Nakon operacije, 0,9 posto otopine natrijum hlorida je korišteno da pomogne miševima da se oporave. Miševi su zatim žrtvovani nakon reperfuzije tokom 24 h. Ukupno 24 miša divljeg tipa nasumično je podijeljeno u sljedećih šest grupa: i) Kontrolna (Con) grupa (n=9); ii) I/R grupa (n=9); iii) I/R plus MCC950 grupa (n=3); i iv) I/R plus NaHS grupa (n=3). Ukupno devet Nrf2‑KO miševa je nasumično podijeljeno u sljedeće tri grupe: i) Con grupa (n=3); ii) I/R grupa (n=3); i iii) I/R plus NaHS grupa (n=3).
Prema prethodnim istraživanjima i preliminarnim eksperimentima (21,22), 20 mg/kg MCC950 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) je ubrizgano (ip) dnevno 14 dana prije operacije u I/R plus MCC950 grupa. Ukupno 50 µmol/kg natrijum hidrosulfida [NaHS; ip; razrijeđen u normalnom (0,9 posto) fiziološkom rastvoru; Sigma‑Aldrich; Merck KGaA] je ubrizgan prije operacije u I/R plus NaHS grupi. Kada su svi eksperimentalni postupci završeni, miševi su žrtvovani dislokacijom grlića materice, a tkivo i krv su prikupljeni za naknadnu analizu.
Western blotting. Bubrežno tkivoje sakupljen od miševa I/R modela nakon 24 h reperfuzije radi analize nivoa ekspresije proteina. Ukratko, ukupni i nukleinski proteini su ekstrahovani korišćenjem RIPA pufera (Thermo Fisher Scientific, Inc.) i koncentracija proteina je određena korišćenjem BCA Protein Assay kita (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Ukupno 40 µg proteina po traci je odvojeno preko 10% SDS-PAGE i prebačeno na poli-viniliden difluoridne membrane, a zatim blokirano sa 5% mlijeka 2 h na sobnoj temperaturi. Membrane su naknadno inkubirane sa sljedećim primarnim antitijelima preko noći na 4˚C: Anti‑NLRP3 (1:500; kat. br. ab214185; Abcam), anti-ASC (1:200; kat. br.sc‑514414; Djed Mraz Cruz Biotechnology, Inc.), anti-caspase-1 (1:200; kat. br. sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-IL-1 (1:1,000; mačka br. ab200478; Abcam), anti-Nrf2 (1:1,000; kat. br. ab137550; Abcam), anti-heme oksigenaza (HO)-1 (1:2,000 ; kat. br. ab68477; Abcam), anti-aktin (1:2,000; kat. br. ab8227; Abcam) i anti-histon H3 (1:2,000; mačka broj ab176842; Abcam). Nakon primarne inkubacije antitijela, membrane su inkubirane sa odgovarajućim HRP-konjugiranim sekundarnim antitijelima (1:5,000; kat. br. ab6721 i ab6728; oba Abcam) 1 h na sobnoj temperaturi. Proteinske trake su vizualizirane pomoću poboljšanog kompleta za hemiluminiscenciju (Thermo Fisher Scientific, Inc.) koristeći Bio-Imaging sistem (Bio‑Rad Laboratories, Inc.) i polukvantificirane korištenjem Quantity One (V4.6) softvera (Bio-Rad Laboratories , Inc.). Nivoi ekspresije proteina su normalizovani na -aktin za citoplazmatski protein ili histon za nukleinski protein.
Reverzna transkripcija – kvantitativna(RT‑q)PCR.Bubrežno tkivoje sakupljen od miševa I/R modela nakon 24 h reperfuzije radi analize nivoa ekspresije mRNA. Ukratko, ukupna RNK je ekstrahirana iz tkiva pomoću TRIzol® reagensa (kat. br. 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Ukupna RNK je reverzno transkribovana u cDNK koristeći RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (kat. br. K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) prema protokolu proizvođača. qPCR je naknadno izveden upotrebom SYBR PCR Master Mixa (Thermo Fisher Scientific, Inc.) na 7500 PCR sistemu u realnom vremenu (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Uslovi termocikliranja su bili sledeći: denaturacija na 95˚C tokom 5 min; 40 ciklusa na 95˚C u trajanju od 15 sekundi; i produžetak na 60˚C 20 sekundi. Sekvence prajmera specifične za gen navedene su u Tabeli I. Relativni nivoi ekspresije ciljnih gena su izračunati korišćenjem 2‑ΔΔCq metode (23) i normalizovani na nivoe ekspresije GAPDH.
Imunohistohemija (IHC). Bubrežno tkivoje sakupljen od miševa I/R modela nakon 24 h reperfuzije da bi se odredili nivoi ekspresije NLRP3 i Nrf2. ukratko,bubregtkivo je fiksirano na sobnoj temperaturi tokom 48 h u 10 posto formalina, uliveno u parafin i isječeno na dijelove od 5 µm. Sekcije su zatim blokirane sa 5% mleka na 37˚C tokom 30 minuta i inkubirane sa anti‑NLRP3 (1:100; kat. br. ab214185; Abcam) ili anti‑Nrf2 (1:200; kat. br. ab137550; Abcam) primarna antitijela preko noći. Nakon primarne inkubacije antitela, sekcije su inkubirane sa sekundarnim anti-zečjim antitelom obeleženim HRP (1:200; kat. br. ab214880; Abcam) na 37°C tokom 30 minuta, razvijenim pomoću rastvora diaminobenzidina za<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Ispitivanje bubrežne funkcije. Ukupno 2-3 ml krvi je prikupljeno nakon centrifugiranja na 3,000 xg tokom 10 minuta na 4˚C od miševa I/R modela nakon 24 h reperfuzije. Serum je uzet za analizububrežna funkcijaputem ELISA za određivanje nivoa kreatinina (kat. br. C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) i azota ureje u krvi (BUN; kat. br. C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute), prema uputstvima proizvođača.Povreda bubregaNivoi molekula-1 (KIM-1) u serumu mjereni su ELISA-om (kat. br. EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) prema uputama proizvođača.
Bojenje hematoksilinom i eozinom.Bubrežno tkivoje sakupljen od miševa I/R modela nakon 24 h reperfuzije za procjenububrežnihistopatološke promjene. Tkivo je fiksirano na sobnoj temperaturi 48 h u 10 posto formalina, a zatim stavljeno u parafin. Sekcije ugrađene u parafin isječene su na dijelove debljine 5 µm i obojene sa 0.5 posto hematoksilina 5 min i eozinom 3 min na sobnoj temperaturi (25˚C). Prisustvo krvarenja, nekroze tubularne ćelije, tubularne dilatacije i formiranja citoplazmatskih vakuola u tkivu ocijenjeno je na sljedeći način: 0, normalnobubreg;1, minimalna šteta; 2, umjereno oštećenje; i 3, teška oštećenja (24).Povreda bubregarezultati su izračunati na slijepi način od strane dva istraživača pod svjetlosnim mikroskopom (uvećanje, x200; Biorevo BZ‑9000; Keyence Corporation).
ELISA analiza nivoa TNF‑, IL‑1 i IL‑6. Krv je sakupljena (1 ml) od miševa I/R modela nakon 24 h reperfuzije. Serum je dobijen centrifugiranjem na 3,000 xg tokom 10 min na 4˚C. Serumski nivoi TNF‑ (kat. br. MTA00b), IL-1 (kat. br. MLB00C) i IL-6 (kat. br. M6000B) analizirani su pomoću komercijalni ELISA kompleti (R&D Systems, Inc.), prema protokolu proizvođača na čitaču mikroploča (kat. br. CA94089; Molecular Devices, LLC).
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI INFEKCIJU BUBREGA/BUBREGA
TUNEL bojenje.Bubrežno tkivoje sakupljen od miševa I/R modela nakon 24 h reperfuzije kako bi se procijenila ćelijska apoptoza korištenjem TUNEL bojenja. Ukratko, tkivo je fiksirano na sobnoj temperaturi 48 h u 10 posto formalina, stavljeno u parafin i izrezano na 5 µm debele dijelove. Sekcije su inkubirane sa TUNEL reagensom u vlažnoj komori na 37˚C 60 minuta u mraku (Roche Diagnostics) i obojene DAPI 5 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je nasumično odabrano 10 polja mikroskopa velike snage i posmatrano u svakoj sekciji pomoću fluorescentnog mikroskopa (uvećanje, x10).Statistička analiza. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD za tri eksperimenta i analizirani su pomoću GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Statističke razlike između dvije grupe analizirane su korištenjem uparenog Studentovog t-testa. Statističke razlike između više od tri grupe analizirane su korištenjem jednosmjerne ANOVA praćene post hoc Tukeyjevim testom višestrukih poređenja. Svi podaci su normalno raspoređeni i imali su jednaku varijaciju. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Rezultati
Tretman MCC950 sprječava I/R-indukovanu aktivaciju NLRP3 signalizacije koja slijedipovreda bubregakod miševa. NLRP3 inflamasomski put se aktivira i ima ključnu ulogupovreda bubrega(25,26). Prethodna studija je također objavila da se NLRP3 signalizacija aktivira u bubrežnom tkivu miševa 24 h nakon reperfuzije (4). Stoga je 24 h nakon reperfuzije odabrano kao trenutna vremenska tačka za procjenu. Nivoi ekspresije proteina NLRP3 su povećani oštećenjem bubrega I/R u I/R grupi u poređenju sa kontrolnom (Con) grupom (Slike 1A i B). Sličan trend je uočen u nivoima ekspresije NLRP3 mRNA (slika 1C). Štaviše, broj NLRP3-pozitivnih ćelija se povećao u I/R grupi u poređenju sa Con grupom, kao što je određeno IHC bojenjem (sl. 1D i E).
Kako bi se utvrdio osnovni mehanizam aktivacije inflamasoma NLRP3 i učinak na nizvodni signalni put nakon povrede bubrega I/R, miševi su tretirani inhibitorom NLRP3 MCC950. Western blotting rezultati su pokazali da I/R povećava nivoe ekspresije proteina NLRP3 i njegovog adaptera ASC i promovira sazrijevanje od pro-kaspase-1 do kaspaze-1 i pro-IL-1 do IL-1 u I/R grupi u poređenju sa Con grupa (sl. 2A-E). Ovi rezultati su pokazali da bubrežni I/R može inducirati aktivaciju puta NLRP3 inflamasoma, a tretman sa MCC950 može smanjiti nivoe ekspresije NLRP3, ASC, kaspaze-1 i IL-1 nakon povrede bubrega I/R.
Utjecaj inflamasoma NLRP3 napovreda bubrega, upala i apoptoza kod bubrežnih I/R modela miševa. Da bi
Odrediti efekat NLRP3 na oštećenje bubrega, miševi I/R modela su tretirani inhibitorom NLRP3 MCC950. Miševi na bubrežnom I/R modelu pokazali su značajno povećane nivoe BUN, serumskog kreatinina i KIM-1, koji je biomarker oštećenja bubrega (Slika 3A-C), što ukazuje na uspješnu indukciju bubrežne I/R ozljede. Histološki pregled bubrežnog tkiva kod miševa I/R modela otkrio je povećan histološki rezultat, što je dokazano teškim otokom tubularnog epitela, tubularnom dilatacijom i intersticijskim edemom, vakuolnom degeneracijom i gubitkom ruba četkice, što sugerira da bubrežni I/R može promovirati značajno oštećenje bubrežnog tkiva i povećan histološki rezultat (sl. 3D i E). Inhibicija NLRP3 tretmanom MCC950 značajno je smanjila I/R-indukovana povećanja nivoa BUN, kreatinina i KIM-1 i smanjila histološki rezultat, pri čemu je bubrežno tkivo pokazalo manje teško ozlijeđenih tubula (slika 3A-E).
Pored toga, analizirani su nivoi inflamatornih faktora i apoptotičkih ćelija nakon primene MCC950 kod miševa sa bubrežnim I/R modelom. Pokazatelji upale, uključujući TNF‑, IL‑1 i IL‑6, bili su značajno povećani u I/R grupi u poređenju sa Con grupom (slika 3F‑H). Štaviše, u poređenju sa Con grupom, procenat apoptotičkih ćelija je značajno povećan 24 h nakon reperfuzije u I/R grupi (sl. 3I i J). U poređenju sa I/R grupom, sekretorni nivoi citokina, TNF-, IL-1 i IL-6 i procenat apoptotičkih ćelija smanjeni su tretmanom MCC950 u grupi I/R plus MCC950 (slika 3F-J ). Ovi rezultati su pokazali da inhibicija inflamasoma NLRP3 može spriječiti oslobađanje inflamatornih faktora i apoptozu bubrežnog tkiva izazvanu I/R.
Nrf2 je neophodan za bubrežnu I/R-indukovanu regulaciju aktivnosti inflamasoma NLRP3.Prethodna studija je otkrila da se Nrf2 aktivira i da se nivoi ekspresije Nrf2 ciljnih gena povećavaju ububrežnog tkivanakon I/R povrede bubrega (27). Slični nalazi su dobijeni i u ovom istraživanju. Nivoi ekspresije nukleinskog, ukupnog proteina i mRNA Nrf2 analizirani su 24 h nakon bubrežne I/R povrede. Rezultati su pokazali da su, u poređenju sa Con grupom, nivoi ekspresije nukleinskog, ukupnog proteina i mRNA Nrf2 povećani u I/R grupi (slika 4A-D). Osim toga, IHC analiza je otkrila da su nivoi ekspresije Nrf2 u bubrežnom tkivu povećani, što je pokazano povećanim brojem Nrf2-pozitivnih
ćelije uočene u I/R grupi (slike 4E i F). Ovi podaci sugeriraju da aktivacija Nrf2 signalnog puta može inicirati zaštitni odgovor kod miševa na bubrežnom I/R modelu. Kako bi se potvrdio učinak Nrf2 na put NLRP3 inflamasoma u bubrežnom I/R, Nrf2-KO miševi su korišteni u narednim eksperimentima. Nivoi ekspresije proteina Nrf2 i njegovog ciljnog gena, HO‑1, bili su značajno smanjeni nakon bubrežnog I/R kod KO miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa (Slika 5A-C). Suprotno tome, u poređenju sa I/R grupom divljeg tipa, nivoi ekspresije NLRP3 i njegovog adaptora, ASC, kaspaze-1 i IL-1 bili su povećani u I/R KO grupi (sl. 5A i D-G). Ovi podaci ukazuju da bubrežni I/R može inducirati aktivaciju inflamasoma NLRP3 kod miševa Nrf2‑KO.
NaHS ublažava I/R-indukovano povećanje nivoa ekspresije NLRP3 proteina kod miševa divljeg tipa, ali ne i kod Nrf2-KO. Pokazalo se da NaHS ima efekte na ekspresiju Nrf2 i aktivaciju inflamasoma NLRP3 u različitim modelima bolesti (28-30). Ova studija je istraživala da li se efekat NaHS na aktivaciju NLRP3 puta javlja preko Nrf2 signalnog puta analizom nivoa ekspresijeproteina povezanih s Nrf2 i NLRP3 inflamazomima kod miševa divljeg tipa i KO.Kod miševa divljeg tipa, u poređenju sa Con grupom, nivoi ekspresije Nrf2, NLRP3, kaspaze-1 i IL-1 bili su povećani zbog povrede bubrega I/R. Pored toga, tretman NaHS dodatno je povećao ekspresiju Nrf2 i smanjio nivoe ekspresije NLRP3, kaspaze-1 i IL-1 u grupi I/R plus NaHS u poređenju sa I/R grupom (slika 6A-E). Kod Nrf2-KO miševa nisu uočene statistički značajne razlike u nivoima ekspresije Nrf2, NLRP3, kaspaze-1 i IL-1 između I/R i I/R plus NaHS grupa (slika 6A-E). U grupi I/R plus NaHS, nivoi ekspresije Nrf2 su bili značajno smanjeni, dok su nivoi ekspresije NLRP3, kaspaze-1 i IL-1 značajno povećani kod miševa Nrf2-KO u poređenju sa miševima divljeg tipa. Ovi rezultati sugeriraju da NaHS može smanjiti aktivaciju inflamasoma NLRP3 preko Nrf2 signalnog puta kod bubrežne I/R ozljede
NaHS ublažava oštećenje bubrega, upalu i apoptozu putem Nrf2 signalnog puta kod bubrežnih I/R modela miševa. NaHS ima važnu ulogu u oštećenju bubrega kod AKI, I/R i drugih modela bolesti (31). NaHS je ublažio bubrežno I/R-indukovano histopatološko oštećenje, što je pokazano smanjenim oticanjem tubularnog epitela, tubularnom dilatacijom i intersticijskim edemom ibubreghistološki rezultati u I/R plus NaHS grupi u poređenju sa I/R grupom kod miševa divljeg tipa (sl. 7A i B). Indikatori bubrežne funkcije, uključujući kreatinin, BUN i KIM-1, također su smanjeni NaHS tretmanom u I/R plus NaHS grupi u poređenju sa I/R grupom kod divljeg tipa
miševi (slika 7C-E). Međutim, kod miševa Nrf2‑KO, NaHS nije uspio smanjiti povećanjebubreghistološki rezultat i nivoi indikatora bubrežne funkcije induciranih bubrežnim I/R. Nadalje, postotak apoptotičkih ćelija i oslobađanje citokina, TNF-, IL-1 i IL-6, svi su smanjeni nakon tretmana NaHS u I/R plus NaHSgrupa u poređenju sa I/R grupom kod miševa divljeg tipa (slika 7F-J). Međutim, NaHS nije bio u stanju da ispolji zaštitni efekat protiv apoptoze i prekomernog oslobađanja inflamatornih faktora nakon reperfuzije bubrežnog tkiva u I/R plus NaHS grupi miševa Nrf2-KO u poređenju sa I/R plus NaHS miševima divljeg tipa (Sl. 7F‑J). Ovi rezultati sugeriraju da NaHS može ublažiti oštećenje bubrega, upalu i apoptozu kod bubrežnih I/R miševa divljeg tipa, ali ne i kod miševa Nrf2-KO.
Diskusija
Upala je ključni patogeni proces AKI izazvan I/R (4). NLRP3 inflamazom i Nrf2 signalni put učestvuju u regulaciji upale upovreda bubrega(32). Ova studija je otkrila da je AKI izazvan I/R aktivirao inflamasom NLRP3 i njegov adaptor, ASC, promovirao sazrijevanje pro-kaspase-1 i pro-IL-1 i ubrzao prekomjerno oslobađanje citokina i apoptozu, što je kulminiralo teškim bubrežna disfunkcija. Inhibicija inflamasoma NLRP3 tretmanom MCC950 poboljšala je funkciju bubrega, nivoe upale i apoptozu u bubrežnom tkivu. Pored aktivacije NLRP3, bubrežni I/R je također aktivirao Nrf2 signalni put. Međutim, odsustvo Nrf2 kod miševa Nrf2‑KO dovelo je do dalje regulacije inflamasoma NLRP3 i njegovog adaptora. Utvrđeno je da tretman s NaHS-om ublažava aktivnost inflamasoma NLRP3 putem Nrf2 signalnog puta. Štaviše, oštećenje bubrega, upala i apoptoza smanjeni su NaHS tretmanom putem Nrf2 posredovane inhibicije aktivacije NLRP3 inflamasoma.
Ozljeda bubrega I/R važan je klinički problem i primarni uzrok AKI, što dovodi do povećanog rizika od razvoja kroničnebolest bubrega(33). Upala je važno patološko obilježje ishemijske ozljede i nastaje kao posljedica aktivacije imunoloških stanica putem prepoznavanja molekularnih obrazaca povezanih s patogenom i oštećenjem (34). Štaviše, ranije je objavljeno da inflamasom NLRP3 ima ulogu u nizubolesti bubregaregulacijom upale, piroptoze, apoptoze i fibroze (35). NLRP3 inflamasom je proteinski kompleks koji se sastoji od NLRP3, njegovog adapterskog proteina, ASC i kaspaze-1. Kaspaza-1 cijepa pro-IL-1 i pro-IL-18 u zrele, aktivirane sekretorne forme. Povreda bubrega izazvana različitim patologijama, uključujući ishemiju (33), aktivira kompleks inflamasoma, pojačava ekspresiju NLRP3 i promoviše kasnije sazrevanje pro‑IL‑1 (36). NLRP3 KO koristeći malu interferirajuću RNK kod miševa ili bubrežnih tubularnih epitelnih ćelija ispoljava zaštitni efekat protiv oštećenja bubrežnog tkiva izazvanog ishemijom ili ozljedom ćelije u odsustvu glukoze (37). Sadašnji rezultati su pokazali da je bubrežni I/R inducirao aktivaciju inflamasoma NLRP3, dok je inhibicija NLRP3 pomoću MCC950 značajno smanjila nivoe ekspresije NLRP3 i ASC i sazrijevanje pro-kaspase-1 i pro-IL-1 u bubrežnom I/R model povrede. Osim toga, inhibicija NLRP3 od strane MCC950 je poboljšala bubrežnu disfunkciju i smanjila histopatološke ozljede i rezultat, prekomjerno oslobađanje citokina i broj apoptotičkih stanica. Ovi podaci sugeriraju da aktivacija NLRP3 može imati ključnu ulogu u oštećenju bubrega, a inhibicija NLRP3 može imati zaštitni učinak protiv ozljeda tkiva i disfunkcije izazvane bubrežnim I/R.
Prethodne studije su objavile da Nrf2 učestvuje u inflamatornom odgovoru (10-12). Pored toga, Nrf2 ima ključnu anti-inflamatornu, antioksidativnu ili anti-apoptotičku ulogu u ishemijskim stanjima. Aktivacija signalnog puta elementa odgovora Nrf2/antioksidansa ublažava upalu i apoptozu u bubrežnom tkivu miševa izazvanih ciklofosfamidom (38). Druga studija je pokazala da aktivacija Nrf2 sulforafanom inhibira aktivnost NF-κB signalnog puta, čime se ublažava upala u distrofičnom mišićnom tkivu (39). Nadalje, nokdaun Nrf2 potiče aktivaciju inflamasoma NLRP3 i dovodi do aktivacije IL-1 u modelu ishemije (11). Sadašnji podaci podržavaju nalaze da bubrežni I/R može inducirati signalni put Nrf2 i ekspresiju njegovih nizvodnih ciljnih gena, kao što je HO‑1. Nrf2-KO miševi su dodatno promovirali aktivaciju inflamasoma NLRP3, što je pokazalo da su nivoi ekspresije NLRP3, ASC, kaspaze-1 i IL-1 povećani u bubrežnom I/R modelu. Ovi rezultati sugeriraju da je Nrf2 ispoljavao inhibitorni efekat na aktivaciju inflamasoma NLRP3 kod bubrežne I/R ozljede.
Prethodna istraživanja su objavila da jebubregproizvodi H2S (40). Nadalje, H2S povećava bubrežni protok krvi i potiče funkciju klirensabubreg, što pokazuje povećana brzina glomerularne filtracije (41). Štaviše, H2S ne samo da ublažava upalu i oksidativni stres, već ima i ključnu ulogu u regulaciji endotelne disfunkcije i hipertenzije (28). H2S učestvuje u regulaciji bolesti povezanih s bubrezima, kao što su I/R ozljede i opstruktivna i dijabetička nefropatija (42), međutim, osnovni mehanizmi ostaju slabo shvaćeni. NHS je korišten kao egzogeni donor H2S u istraživanjima (43). U ovoj studiji, isporuka H2S bila je u obliku NaHS. Sadašnji rezultati su pokazali da je NaHS poboljšao ozljedu tkiva,bubregdisfunkcija, prekomjerno oslobađanje citokina i apoptoza izazvana bubrežnim I/R. Ranije je objavljeno da NaHS sprječava mikroglijalnu aktivaciju i upalu uzrokovanu ozljedom živca regulacijom Nrf2 signalnog puta (44). U skladu sa hipotezom da NaHS reguliše upalu putem Nrf2 signalnog puta, ovi rezultati su pokazali da NaHS povećava nivoe ekspresije Nrf2 i inhibira nivoe ekspresije NLRP3 kod bubrežnih I/R modela miševa. Nadalje, Nrf2 KO je ukinuo regulatorne efekte NaHS na Nrf2 i NLRP3 inflamasom. Ova studija je također istraživala ulogu Nrf2 na oštećenje i funkciju bubrega nakon liječenja NaHS; inhibicija Nrf2 ne samo da je delimično preokrenula zaštitni efekat NaHS napovreda bubregai disfunkciju, ali je također preokrenuo inhibitorni učinak NaHS na inflamatorni odgovor i apoptozu nakon bubrežne I/R. Ovi rezultati sugeriraju da bi Nrf2 mogao biti potreban za zaštitni učinak NaHS-a na AKI induciran I/R, a NaHS može imati svoju zaštitnu ulogu protiv ozljeda tkiva putem inhibicije NLPR3 inflamasoma posredovane Nrf2. Zaključno, I/R-indukovana povreda bubrega aktivirala je NLRP3 inflamasom i Nrf2 signalni put, a inhibicija inflamasoma NLRP3 štitila je od oštećenja bubrega. Nrf2 je negativno regulirao aktivaciju inflamasoma NLRP3 i ublažio NaHSpovreda bubregai disfunkcija, apoptoza i inflamatorni odgovor putem inhibicije NLRP3 inflamasoma posredovane Nrf2. Ovi rezultati pružaju novi uvid u potencijalnu buduću metu za liječenje ishemijske ozljede bubrega.
