Disekcija odgovora antitijela Gam-COVID-Vac vakcinisanih subjekata sugerira uključivanje epitopa izvan RBD-a u neutralizaciju SARS-CoV-2
Oct 16, 2023
sažetak: Milioni ljudi su vakcinisani Gam-COVID-Vac, ali fine specifičnosti indukovanih antitela nisu u potpunosti proučene. Plazma od 12 naivnih i 10 rekonvalescentnih ispitanika iz 2019. (COVID-19) dobijena je prije i nakon dvije imunizacije Gam-COVID-Vac. Reaktivnost antitijela u uzorcima plazme (n=44) proučavana je na panelu mikro-niz rekombinantnih savijenih i nesavijenih proteina teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) i 46 peptida koji se prostiru na šiljci proteina (S) i imunoglobulinom G (IgG) podklase enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA). Sposobnost antitela izazvanih Gam-COVID-Vac da inhibiraju vezivanje domena za vezivanje receptora (RBD) za njegov receptor angiotenzin-konvertujući enzim 2 (ACE2) ispitana je testom molekularne interakcije (MIA). Kapacitet antitijela za neutralizaciju virusa proučavan je testom neutralizacije virusa pseudotipiziranog tipa (pVNT) za Wuhan-Hu{25}} i Omicron. Otkrili smo da je vakcinacija Gam-COVID-Vac izazvala značajno povećanje IgG1, ali ne i drugih IgG podklasa protiv preklopljenog S, podjedinice šiljastog proteina 1 (S1), spike proteinske podjedinice 2 (S2) i RBD na uporediv način u naivnih i rekonvalescentnih pacijenata. subjekti. Neutralizacija virusa je bila u visokoj korelaciji sa vakcinacijom izazvanim antitelima specifičnim za savijeni RBD i novi peptid (tj. peptid 12). Peptid 12 se nalazio blizu RBD-a u N-terminalnom dijelu S1 i potencijalno bi mogao biti uključen u tranziciju konformacije prije fuzije u postfuziju proteina šiljaka. Ukratko, vakcinacija Gam-COVID-Vac inducirala je S-specifična IgG1 antitijela kod naivnih i rekonvalescentnih subjekata na uporediv način. Osim antitijela specifičnih za RBD, antitijela inducirana protiv peptida blizu N-kraja RBD-a također su povezana s neutralizacijom virusa.
Ključne riječi: SARS-CoV-2; COVID-19; Gam-COVID-Vac; epitop; antitelo; neutralizacija virusa; test molekularne interakcije; Omicron
prednosti dodatka cistanche-povećavaju imunitet
Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity
【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Uvod
Nakon prvih slučajeva infekcije teškim akutnim respiratornim sindromom koronavirusom 2 (SARS-CoV-2) krajem 2019. godine u Wuhanu, Kina, nova bolest koronavirusa (COVID-19) brzo se proširila svijeta i prerasla u globalnu pandemiju [1–4]. Brz razvoj COVID-19 vakcina i uvođenje globalnih programa vakcinacije zajedno sa pojavom manje patogenih SARS-CoV-2 varijanti smatraju se značajnim faktorima za smanjenje smrtnih slučajeva povezanih sa COVID{10}} i ozbiljnost pandemije [1,5]. Prve vakcine koje su postale dostupne bile su genetske vakcine zasnovane na adenovirusom posredovanom prijenosu gena koji kodira SARS-CoV-2 površinski protein S [6–8]. SARS-CoV-2 S protein sastoji se od S1 podjedinice koja sadrži domenu za vezivanje receptora (RBD) koja se veže za svoj receptor ACE2 na ljudskim stanicama i S2 podjedinice koja osigurava vezivanje virusa na membranu ćelije domaćina proteolitičkim cijepanjem fuzioni peptid (FP) tokom virusne infekcije [9]. S gen koji se koristi za prijenos gena u određenim vakcinama baziranim na adenovirusu (npr. COVID{25}} vakcina Janssen) može se modificirati kako bi stabilizirao protein i utjecao na njegovo cijepanje, ali to nije slučaj za ostale [10]. Ljudske ćelije koje su inficirane adenovirusima koji sadrže gen koji kodira S proizvode različitu količinu S antigena koji se oslobađa i predstavlja glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC) klase II u T stanicama što rezultira CD4+ pomoći T stanicama za proizvodnju S-specifičnih antitijela. S protein eksprimiran u transficiranim stanicama također je predstavljen MHC klase I na površini inficirane ćelije i pokreće aktivaciju S-specifičnih citotoksičnih CD8+ T ćelija, koje mogu prepoznati ćelije koje proizvode S antigen i uništiti ih. Princip vakcinacije, odnosno unošenje S-kodirajućih genetskih informacija u ćelije domaćina i naknadna proizvodnja S antigena od strane inficiranih ćelija, sličan je vakcinama sa messenger ribonukleinskom kiselinom (mRNA), iako se tehnologija prenosa gena razlikuje od adenovirusa. -bazirane vakcine. Dakle, "genetske vakcine" u određenoj mjeri oponašaju prirodnu infekciju SARS-CoV-2. Identifikacija epitopa prepoznatih antitijelima od vakcinisanih subjekata uključenih u neutralizaciju virusa je ključna ne samo za razumijevanje mehanizma djelovanja postojećih vakcina već i za razvoj rafiniranih strategija aktivne vakcinacije i pasivne imunizacije protiv COVID-19 [11 ,12]. Većina trenutnih vakcina fokusirana je na dobijanje odgovora S-specifičnih antitijela s posebnom pažnjom na odgovor RBD-specifičnih antitijela jer je uočeno da su RBD-specifična antitijela u korelaciji s visokom neutralizirajućom aktivnošću protiv SARS-CoV-2 [ 13–15]. Međutim, broj mutacija dobijenih od strane svake nove varijante zabrinutosti (VOC) ukazuje na važnost identifikacije epitopa koji su sačuvani među VOC ciljanim neutralizirajućim antitijelima koja se nalaze ne samo u RBD već i izvan RBD [16]. U stvari, postoje studije koje ukazuju na prisustvo neutralizirajućih epitopa izvan RBD-a, koji se prepoznaju po antitijelima nakon imunizacije [17–20]. 2020. vektorska vakcina Gam-COVID-Vac, takođe nazvana Sputnik-V, postala je dostupna za upotrebu u kliničkoj praksi i trenutno je odobrena za upotrebu u više od 70 zemalja (https://sputnikvaccine.com/about-vaccine / (pristupljeno 17. januara 2023.)). Prema izvoru Our World In Data (OWID), 79 miliona ljudi u Rusiji primilo je najmanje jednu injekciju vakcine, a 72 miliona je potpuno vakcinisano (https://ourworldindata.org/covid-vaccinations?country= RUS (pristupljeno 22. marta 2022.)). Gam-COVID-Vac se sastoji od dvije vrste vakcina, koje su zasnovane na dva različita vektora humanog adenovirusa (hAd26 i hAd5) koji nose nativni oblik S-proteina Wuhan-Hu-1 soja SARS-CoV{{ 73}}. Sputnjik-V sadrži dve injekcije, jednu sa hAd26 i drugu sa hAd5 i Sputnjik svetlošću, sa samo hAd26. Dva različita vektora adenovirusa koriste se za prvu i drugu imunizaciju kako bi se smanjila mogućnost da cijepljeni subjekti proizvedu imunitet na imunitet na S protein protiv adenovirusa. Zapravo, antitijela specifična za adenovirus bi ograničila efikasnost dopunske vakcinacije neutralizacijom vektora adenovirusa. Stoga se 21. dan nakon prve doze vakcine sa rAd26 vrši ponovljena isporuka antigena vektorom rAd5 [8,21]. Nekoliko studija je u značajnoj mjeri istraživalo odgovore na S- i RBD-specifična antitijela i aktivnost neutralizacije virusa u serumima Gam-COVID-Vac vakcinisanih [10,22,23]. Prijavljeno je povećanje RBD-specifičnih IgG antitijela tri mjeseca nakon primjene Gam-COVID-Vac-a i pokazano je da antitijela unakrsno reaguju sa Alpha, Beta, Delta i Omicron varijantama koje izazivaju zabrinutost [24–26]. Gam-COVID-Vac je također upoređen sa nekoliko drugih licenciranih vakcina protiv SARS-CoV{100}}, koje su pokazale visoku neutralizaciju virusa i visoku efikasnost protiv mortaliteta uzrokovanog COVID{102}}za Sputnjik-V, iako je neznatna inferiornost kod nekih mRNA vakcina u vezi virusne neutralizacije pronađena je [24]. Konačno, pokazalo se da imunizacija pacijenata sa virusom humane imunodeficijencije pozitivnih (HIV+) liječenih antiretrovirusnom terapijom (ART-liječenih) Gam-COVID-Vac pokazuje epidemiološku efikasnost protiv originalnog divljeg tipa i Delta varijante SARS-CoV{{ 113}} [27]. Međutim, do sada nije izvršena detaljna analiza prepoznavanja epitopa od strane antitijela kod Gam-COVID-Vac vakcinisanih subjekata i potrebni su podaci za razumijevanje izotipa imunoglobulina i odgovora podklase IgG kod Gam-COVID-vakcinisanih subjekata. Ovdje smo istraživali dvije grupe ispitanika koji su bili vakcinisani Gam-COVID-Vac, jednu koja je imala prethodnu infekciju SARS-CoV-2 i drugu grupu osoba koje nisu bile naivne na SARS-CoV-2. Izvršili smo preciznu analizu specifičnosti epitopa induciranih antitijela koristeći mikro-niz SARS-CoV-2-savijenih i nesavijenih proteina i peptida koji obuhvataju kompletan S protein, uključujući RBD. Nadalje, analizirani su odgovori podklase IgG. Naša studija otkriva da subjekti vakcinisani protiv Gam-COVID-vakcinacije stvaraju RBD-specifična antitijela koja mogu blokirati RBD-ACE2 interakciju. Zanimljivo je da smo otkrili da je neutralizacija virusa također povezana s antitijelima usmjerenim protiv peptida izvan RBD-a, koji mogu biti uključeni u tranziciju preto-postfuzione konformacije šiljastog proteina.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
2. Rezultati
2.1. Gam-COVID-vakcinisani subjekti uključuju naivne i rekonvalescentne subjekte COVID-19
Rekonvalescentni subjekti su bili zaraženi sojem Wuhan-Hu-1 prema njegovoj prevalenci i podacima o sekvenciranju dobijenim u vrijeme infekcije u moskovskoj regiji. Naivni subjekti nisu imali simptome COVID-19 i nisu imali SARS-CoV-2-specifična antitijela u vrijeme regrutovanja. Ispitanici su uključivali 15 žena i 7 muškaraca sa srednjom starošću od 60 (tj. 25-70 godina) (Tabela 1).
Tabela 1. Demografske, kliničke i serološke karakteristike ispitanika.
Uzorak plazme je uzet od svakog od ispitanika u vremenskoj tački 0 (tj. bazna linija) (Slika 1A), a zatim je svaki ispitanik vakcinisan Sputnjikom-V u intervalu od približno 21 dan između prvog i drugog injekcija (vremenske tačke 1 i 2). U vremenskoj tački 3 sakupljen je drugi uzorak plazme da bi se odredili odgovori antitijela izazvane vakcinom (Slika 1A). Subjekti su posmatrani dodatnih 120 dana. 110. dana nakon završne vakcinacije jedan ispitanik (tj. subjekt 22) je imao COVID-19 dok ostali nisu razvili nikakve simptome COVID-19 (Tabela 1).
Slika 1. Dizajn studije i SARS-CoV-2-specifični odgovori antitijela prije i nakon vakcinacije Sputnjikom-V. (A) Dizajn studije. Uzorci plazme su dobijeni od COVID-19-naivnih (n=12) i rekonvalescentnih subjekata (n=10) u vremenskoj tački 0 (osnovna linija), zatim su subjekti dobili dva Sputnjik-V vakcinacije u vremenskoj tački 1 i 2, respektivno, a uzorak plazme je dobijen u vremenskoj tački 3 (tj. 80-85 dan nakon prve vakcinacije). (B) Nivoi IgG antitela specifičnih za nukleokapsid (y-osa: ISU) kod naivnih i rekonvalescentnih subjekata (x-osa) na početku. Horizontalna linija označava graničnu vrijednost za pozitivnost. (C) Nivoi IgG antitijela (y-ose: ISU) specifični za RBD, S, S1 i S2 kod subjekata u vremenskoj tački 0 i 3 (x-ose). (D) S lijeva na desno nivoi IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 antitijela (y-ose: vrijednosti optičke gustine OD) do S (gornji dio) i RBD (donji dio) u vremenskim tačkama 0 i 3 ( x-ose). Značajne razlike između grupa utvrđene Wilcoxon testom su naznačene: ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns—nije značajno.
2.2. Vakcinacija Gam-COVID-Vac izaziva široke IgG odgovore na S, uključujući S1, RBD i S2
prednosti dodatka cistanche-povećavaju imunitet
Izvršili smo detaljnu analizu odgovora antitijela na veliki panel savijenih i nesavijenih SARS-CoV-2 proteina i peptida koji obuhvataju S protein u uzorcima plazme SARS-CoV-2-naivnih i rekonvalescentnih subjekata nakon punog kursa imunizacije Gam-COVID-Vac (Slika 1A,B; Tabela 1). Prilikom poređenja uzoraka plazme iz vremenske tačke 0 i vremenske tačke 3 nakon vakcinacije, pronađena je značajna indukcija IgG odgovora protiv savijenih, ali ne i nesavijenih RBD, S, S1 i S2 (Slika 1C). Tri mjeseca nakon vakcinacije subjekti su pokazali 21-putostruko povećanje RBD-specifičnih IgG antitijela (p < 0.{{20}}001) i {{ 18}} puta povećanje S-specifičnih IgG antitela (tj. vremenska tačka 0: medijan 0,291, vremenska tačka 3: medijan 5,778) (p < 0,0001), respektivno. IgG antitijela na S1 povećana su 3.7-puta (p=0.0023) i IgG antitijela na S2 povećana 2.8-puta (p=0.0094) (Slika 1C ). Vakcinacija Gam-COVID-Vac inducirala je uglavnom IgG odgovore na savijene S, S1 i RBD uporedivo kod naivnih i rekonvalescentnih subjekata (slike 1C, S2 i S3), što ukazuje da se može koristiti za jačanje SARS-CoV-2- specifični odgovori antitijela i kod rekonvalescenta. Značajno povećanje IgG antitela na RBD, S i S1 primećeno je kod naivnih i rekonvalescentnih subjekata (Slika S2) i nije bilo značajnih razlika u pogledu nivoa IgG na RBD, S, S1 i S2 kod naivnih i rekonvalescentnih subjekata u vremenskoj tački 3. (Slika S3).
2.3. Gam-COVID-Vac vakcinacija izaziva uglavnom odgovor IgG1 podklase na S i RBD
Prijavljeno je da alergen-specifična imunoterapija (AIT) inducira uglavnom alergen-specifične IgG1 i IgG4 odgovore koji se razlikuju ne samo u pogledu njihovih efektorskih funkcija (IgG1 može posredovati ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitijela (ADCC) i aktivaciju komplementa dok IgG4 nema ove efektorske funkcije), ali iu pogledu njihove kinetike (IgG1: brz početak i rani pad: IgG4: spor početak, ali trajni nivoi) [28–30]. Stoga smo istražili odgovore podklase IgG (tj. IgG1–IgG4) na S i RBD kod ispitanika vakcinisanih Sputnjikom-V. Slika 1D pokazuje da je vakcinacija izazvala gotovo isključivo odgovor podklase IgG1 na S i RBD. Nakon vakcinacije pronađena su značajna povećanja nivoa IgG1 specifičnih za S i RBD (p=0.0002 i p=0.0071, respektivno). Međutim, nisu mogli biti otkriveni relevantni odgovori podklase IgG2, IgG3 ili IgG4 specifični za S i RBD (Slika 1D).
2.4. Indukcija antitijela koja neutraliziraju viruse i antitijela koja inhibiraju RBD-ACE2 interakciju Gam-COVID-Vac vakcinacijom
Za detekciju antitijela za neutralizaciju virusa koristili smo pVNT test, gdje su virusolike čestice pseudotipizirane sa S-proteinom iz originalnog Wuhan-Hu-1 soja i nedavno opisanog VOC Omicron. Antitijela s neutralizirajućim djelovanjem za soj Wuhan Hu{4}} pronađena su kod svih osim jednog (tj. subjekta 22) od 22 ispitanika (slika 2A, tabela 2), dok su titri neutralizirajućih antitijela za Omicron bili značajno niži (slika 2B) i pronađeno samo kod 17 od 20 ispitanika (Slika 2A, Tabela 2). Za subjekte 6, 7, 10, 11, 15 nije pronađena relevantna neutralizacija (Slika 2A, Tabela 2). Titri neutralizacije virusa za Omicron bili su 25 puta niži nego za WT (medijan 141,9 i 5,7 za Wuhan-Hu-1 i Omicron, respektivno) (Slika 2B).
Slika 2. Aktivnost neutralizacije virusa u plazmi 3 mjeseca nakon vakcinacije Sputnik-V i povezanost sa odgovorima IgG antitijela na peptide izvedene iz RBD i S. (A) Neutralizacija virusa (ID50) (y-osa) protiv soja Wuhan-hu-1 (zeleno) i Omicron (narandžasta) dobijena je plazmom iz naivnih (plava) i rekonvalescentna (crvena) subjekti (x-ose). (B) Poređenje neutralizacije virusa (y-osa: ID50 dobijena za plazmu od testiranih subjekata, trake predstavljaju medijane sa interkvartilnim rasponom (IQR) Wuhan Hu-1 (zeleno) i Omicron (narandžasto) Horizontalna linija predstavlja rezultate dobijene plazmom od zdravog, neinficiranog kontrolnog subjekta (zdrava kontrola, HC) Značajne razlike između sojeva utvrđene su Mann-Whitney testom: **** p < 0. {{30}}001. (C) Lokalizacija RBD i peptida u korelaciji sa neutralizacijom virusa u šemi S (S1, S2). (D) Korelacije između titara neutralizacije virusa za Wuhan-Hu{{19 }} (WT) ili Omicron (y-ose) i nivoi IgG specifični za RBD i peptide izvedene iz šiljaka 12, 32 i 46A (x-ose: ISU). Plavi i crveni simboli označavaju naivne i rekonvalescentne subjekte, redom. ukazuju na značajne korelacije prema neparametrijskom Spearman testu, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 **** p < 0,0001, ns=nije značajno.
Tabela 2. Poređenje nivoa IgG specifičnih za S, S1, S2 i RBD izmjerenih mikro nizom sa inhibicijama vezivanja RBD na ACE2 i titrima neutralizacije virusa (Wuhan-Hu-1, Omicron) utvrđenih za plazmu iz ispitivanih subjekata. Toplotno mapiranje je izvršeno za svaki parametar posebno pomoću programa Excel. Najviši nivo se smatrao tamnocrvenim, a najniži bijelim.
Činjenica da su se kod svih osim jednog subjekta (tj. subjekta 22) antitijela za neutralizaciju virusa povećala nakon vakcinacije ukazuje da su ona izazvana vakcinacijom (Tabela 2). Subjekt 21 je već pokazao visoko blokiranje RBD-ACE2 interakcije u MIA i visoku neutralizaciju virusa na početku (Tabela 2). Značajno je da su uzorci plazme vakcinisanih Gam-COVID-Vac rekonvalescentnih subjekata koji su imali umjerenu bolest (#1, 2, 17, 18, 21) imali veće titre neutralizacije virusa od onih iz rekonvalescenta koji su imali blagu bolest (#22) ili nisu imali simptome (#4, 5, 7, 9) (Tabele 1 i 2). Međutim, ključni nalaz je bio da inhibicija vezivanja RBD za ACE2 i neutralizacija virusa nisu uvijek bili povezani. Više od 25% inhibicije vezivanja RBD Wuhan Hu-1 za ACE2 dogodilo se samo kod 6 ispitanika koji su također pokazali inhibiciju u testu neutralizacije virusa zbog vakcinacije (tj. subjekti 1, 2, 3, 17, 18 i 19) (Tabela 2). Zanimljivo je da je aktivnost neutralizacije virusa (50% infektivne doze (ID50) > 100) uočena kod 6 ispitanika iako nisu pokazali nikakvu ili slabu inhibiciju vezivanja RBD za ACE2 (Tabela 2: Subjekti 6, 10, 12, 13, 16, 20) .
2.5. Neutralizacija virusa kod ispitanika vakcinisanih Gam-COVID-Vac je u snažnoj korelaciji sa IgG odgovorima na RBD i na S-izveden peptid 12
Kao što je ranije navedeno, plazma nekoliko Gam-COVID-Vac vakcinisanih subjekata (npr. kod ispitanika 6, 10, 12, 13, 16, 20; Tabela 2) pokazala je aktivnost neutralizacije virusa, ali nije inhibirala RBD-ACE2 interakciju. Stoga smo analizirali reaktivnost IgG antitijela na peptide koji obuhvataju S protein analizom čipa baziranom na mikro nizu [13] (slika S4 i slika 2C) i korelirali peptidno specifične IgG odgovore s neutralizacijom virusa Wuhan-Hu{{19} } soj i Omicron (slika 2D). IgG odgovori na tri peptida (tj. peptidi 12, 32, 46A) kao što su IgG odgovori na savijeni RBD značajno su korelirali sa neutralizacijom soja Wuhan-Hu-1 (Slika 2C, D). Peptid 12 se istakao jer su odgovori antitijela na nesavijeni peptid 12 (slika S1), ali ne i na nesavijene peptide 32 i 46A bili značajno pojačani Gam-COVID Vac kod naivnih subjekata (slika 3A) i također su u značajnoj korelaciji s neutralizacijom Omikrona (slika 2D ). Nije primijećeno značajno pojačanje kod rekonvalescentnih subjekata na peptide 12, 32 ili 46A (Slika 3A). Sekvenca peptida 12 je visoko konzervirana među sojevima SARS-CoV-2 (Slika 4) i nalazi se u S1 blizu N-terminusa RBD-a i stoga označava regiju koja može biti relevantna za tranziciju pre- do postfuzijske konformacije S proteina (slika 3B).
Slika 3. Srednji nivoi IgG antitijela (y-ose: ISU) na peptide izvedene iz S (P12, P32, P46A) kod vakcinisanih naivnih i rekonvalescentnih subjekata u vremenskim tačkama 0 i 3 (x-ose) (A) . Značajne razlike između grupa utvrđene Wilcoxon testom su naznačene: * p < 0.05, ns=nije značajno. (F) (B) Slika 3. Srednji nivoi IgG antitela (y-ose: ISU) na peptide izvedene iz S (P12, P32, P46A) kod vakcinisanih naivnih i rekonvalescentnih subjekata u vremenskim tačkama 0 i 3 (x -osi) (A). Indicirane su značajne razlike između grupa utvrđenih Wilcoxon testom: * p < 0,05, ns=nije značajno. (B) Vizualizacija peptida 12, 32 i 46A u površinskom prikazu SARS-CoV-2 trimera šiljastog proteina (pogled sa strane, konformacija prije fuzije) generiranog s PyMOL-om. Peptid 12 je istaknut u modelu S-trimera crvenom bojom, peptid 32 plavom, a 46A narandžastom. Ugljikohidrati su prikazani svijetlosivom bojom.
Slika 4. Poravnanje sekvence proteina Wuhan-Hu-1 (gore) i Omicron (dolje) SARS-CoV-2 S-proteina. RBD je obojen svijetlo žutom bojom, a peptidi 12, 22, 25, 32, 33, 46A i 47 su podvučeni. Slijed Wuhan S-proteina odgovara WA1 izolatu (GeneBank pristupni br.: BCN86353.1), Omicron S-proteinska sekvenca Omicron je klada GRA, linija B.1.1.529 BA.1 zasnovana na GISAID bazi podataka ( https://www.gisaid.org/ (pristupljeno 15. marta 2022.)). Zamjene aminokiselina su označene bojama prema njihovoj hidropatiji i svojstvima naboja (ružičasta=hidrofobna, zelena=neutralna, svijetloplava=bazična hidrofilna i svijetlocrvena=kisela hidrofilna).
3. Diskusija
Vakcina bazirana na vektorima Gam-COVID-Vac koja se naziva i Sputnjik-V, bila je jedna od prvih vakcina protiv SARS-CoV-2 koja je postala dostupna za upotrebu u kliničkoj praksi. Međutim, dostupno je relativno malo informacija o finim specifičnostima odgovora antitijela kod subjekata koji su vakcinisani protiv COVID-19. U ovoj studiji smo izvršili detaljnu analizu odgovora antitijela na složene i nesavijene SARS-CoV-2 proteine i peptide koji obuhvataju S protein u uzorcima plazme od SARS CoV-2-naivnih i rekonvalescentnih subjekata nakon kompletan kurs imunizacije Gam COVID-Vac-om. Gam-COVID-Vac je inducirao uglavnom IgG1, ali nijednu drugu podklasu IgG odgovora na savijene S, S1, S2 i RBD na uporediv način kod naivnih i rekonvalescentnih subjekata, što ukazuje da se može koristiti za pojačavanje SARS-CoV-2- specifični odgovori antitijela i kod rekonvalescenta. Kao i druge genetske vakcine, odgovor antitijela izazvan Gam-COVID-Vac uglavnom se nalazio u podklasi IgG1 koja ima kraći poluživot u usporedbi s odgovorom podklase IgG4 koji je održiviji. Na primjer, specifični odgovori podklase IgG4 povezani su sa dugotrajnom zaštitom tokom imunoterapije specifične za alergen, dok se specifični odgovori IgG1 brzo nagomilavaju, ali nestaju nakon nekoliko mjeseci [28–30]. U skladu s tim, bit će potrebne česte dopunske injekcije Gam-COVID-Vac i drugih genetskih vakcina kako bi se neutralizirajući odgovori antitijela zadržali na visokom nivou. Vakcinacija s Gam-COVID-Vac inducira odgovor antitijela koji u velikoj mjeri imitira onaj koji se javlja nakon prirodne infekcije SARS-CoV-2 [13]. Osim toga, odgovori antitijela nakon prirodne infekcije uglavnom pripadaju podklasi IgG1 i usmjereni su protiv savijenih S, S1, S2 i RBD [13]. Novo i zanimljivo otkriće naše studije je da plazma nekoliko Gam-COVID-Vac vakcinisanih subjekata (npr. kod ispitanika 6, 10, 12, 13, 16, 20; Tabela 2) pokazuje aktivnost neutralizacije virusa, ali ne inhibira RBD-ACE2 interakcija. Stoga smo analizirali reaktivnost IgG antitijela na peptide koji obuhvataju kompletan S protein analizom čipa na bazi mikro nizova [13] (Slike 2D i S4) i korelirali peptidno specifične IgG odgovore s neutralizacijom virusa Wuhan-Hu{{62} } soj i Omicron BA.1 (Slika 2D). IgG odgovori na tri peptida (tj. peptidi 12, 32, 46A) kao što su IgG odgovori na RBD značajno su korelirali sa neutralizacijom soja Wuhan-Hu-1 (slika 2C, D). Međutim, peptid 12 je bio jedinstven jer su odgovori antitijela samo na peptid 12, ali ne i na peptide 32 i 46A bili značajno pojačani vakcinacijom (Slika 3A) i također su u značajnoj korelaciji s neutralizacijom Omikrona (Slika 2D). Veličina pojačanja IgG odgovora na peptid 12 izazvanog vakcinom bila je skromna, ali značajna kod naivnih subjekata i prilično uporediva sa povećanjem IgG antitela usmerenih na S i S1. Međutim, IgG antitela protiv izolovanog nesavijenog peptida (slika S1) mogu predstavljati samo deo antitela usmerenih protiv peptida 12 u savijenom proteinu. Nadalje, važni su ne samo nivoi već i avidnost antitijela. Sekvenca peptida 12 je visoko očuvana među sojem Wuhan-Hu-1 i BA.1 Omicron VOC (slika 4) i izvedena je iz regije koja može biti relevantna za prijelaz pre u postfuziju konformacija S proteina (slika 3B). Štaviše, poređenje novih mutantnih varijanti Omikrona (BA.1, BA.2, BA.4/5, BA.2.12.1, BA.2.75, BQ.1), pokazuje da peptid 12 (284–313 aa. ) ostaje nepromijenjen u smislu sekvence aminokiselina, za razliku od, na primjer, peptida 32 (https://covariants.org/shared-mutations, (pristupljeno 28. novembra 2022.)). Posebno su opisana monoklonska antitela sa sposobnošću neutralizacije virusa koja ciljaju na region N-terminalnog domena (NTD) čiji je peptid 12 deo [31], a objavljeno je da i druge vakcine mogu izazvati odgovor antitela usmeren protiv ovog regiona. [18–20,32], što ukazuje da region definisan peptidom 12 može biti važan za indukciju neutralizujućih antitela. Stoga se može pretpostaviti da antitijela inducirana Gam-COVID-Vac vakcinacijom mogu neutralizirati SARS-CoV-2 pomoću dva mehanizma, jednim jednostavno inhibiranjem RBD-ACE2 interakcije i drugim ciljanjem regije koja sadrži peptid 12 S- protein koji može biti uključen u strukturne promjene (tj. prelazak predfuzije u fuzijsku konformaciju S). Naša studija ima ograničenja. Na primjer, koristili smo test neutralizacije baziran na pseudotipiziranim lentivirusima, ali su ti testovi široko korišteni i pouzdani [33]. Također je ograničenje naše studije to što su peptidi na našem mikro nizu bili rasklopljeni i stoga su mogli identificirati samo dio neutralizirajućih antitijela koja su prepoznala nesavijene peptide, dok je čak i veći dio antitijela mogao biti vezan za konformacijske epitope u identificiranim region. Nadalje, ograničenje naše studije je to što smo analizirali samo mali broj ispitanika. Međutim, naša studija jasno pokazuje da antitijela s različitom specifičnošću epitopa mogu doprinijeti zaštitnom učinku vakcinacije Gam COVID-Vac. Osim toga, studija pokazuje odgovor na potencijalno konzervirani peptid koji se može koristiti za stvaranje široko neutralizirajućih antitijela.
Prednosti suplemenata cistanche-kako ojačati imuni sistem
4. Materijali i metode
4.1. Studija o populaciji i etičkoj izjavi
Zdravi subjekti sa (n {{0}}) ili bez (n=12) ranijih infekcija SARS-CoV-2 uključeni su u studiju u decembru 2020. godine u Institutu Nacionalnog istraživačkog centra Imunologija Federalne medicinsko-biološke agencije Rusije (Etički broj: #12-1, 29. decembar 2020.). Svi učesnici su dali pismeni informirani pristanak. Prethodna infekcija SARS-CoV-2 potvrđena je prethodnim pozitivnim PCR testom i simptomima COVID-19 ili prisustvom SARS-CoV-2-specifičnih antitijela usmjerenih na nukleokapsidni antigen i/ili RBD i/ili S antigen kao što je opisano [13]. Svi ispitanici su imunizovani intramuskularno sa dve doze Sputnjika-V (Gam-COVID-Vac, Biocard, Moskva, Rusija) u intervalu od tri nedelje. Uzorci krvi su uzeti dan prije prve vakcinacije (T0, slika 1A) i 80 do 85 dana nakon prve vakcinacije (T3, slika 1A).
4.2. Detekcija SARS-CoV-2-specifičnih odgovora antitijela
Imunoglobulinski odgovor pacijenata koji nisu bili naivni i rekonvalescenti sa COVID{{{0}} je procijenjen u uzorcima plazme prije i nakon imunizacije Sputnjikom-V (Slika 1A). Specifični IgG za sveobuhvatni panel SARS-CoV-2 proteina i 46 peptida (25–30 mera) koji obuhvataju S protein izmjeren je u 1:50 razrijeđenih uzoraka plazme tehnologijom mikromreža kao i ranije opisano [13]. Aminokiselinske sekvence, broj aminokiselina i molekularna težina za sve sintetičke peptide na čipu sa mikro nizom prikazani su u Tabeli 3. Za peptide 12 i 32 i RBD izražene u Escherichia coli (E. coli) (razvijeno) a u ćelijama ljudskog embrionalnog bubrega 293 (HEK293) (savijeni) dati su spektri kružnog dihroizma (CD) (slika S1). Peptidi 12 i 32 nisu otkrili nikakvu specifičnu sekundarnu strukturu koja je određena kružnim dihroizmom (CD) kao što je prikazano na slici S1. Detaljnije, staklena stakalca koja sadrže mikronise okružene epoksidnim okvirom (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Njemačka) aktivirana su organskim polimerom reaktivnog amina, MCP-2 (Lucidant Polymers, Sunnyvale, CA , SAD) kako bi se olakšalo vezivanje proteina i peptida. SARS-CoV-2 antigeni/peptidi su uočeni upotrebom koncentracije od 0,5-1 mg/mL u (75 mM Na2HPO4, pH=8.4) u tri primjerka pomoću SciFlexArrayer S12 (Scienion AG, Berlin, Njemačka) [13]. Ekspresija i pročišćavanje proteina i sinteza peptida opisani su u [13]. Reaktivnost IgG antitijela na antigene u mikro nizu mjerena je prvo ispiranjem mikroniza u trajanju od 5 minuta fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom sa 0,5% Tween 20 (PBST) i sušenjem centrifugiranjem pomoću Sigma 2–7 centrifuge i MTP{45}} rotor (oba Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Njemačka). Zatim su dodani alikvoti od 35 µL 1:50 razblaženih uzoraka plazme (razblaživač uzorka, Thermofisher, Waltham, MA, USA) i inkubirani 2 h na 22 ◦C. Nakon drugog koraka ispiranja, primijenjeno je 30 µL sekundarnih antitijela (DyLight 550 (Pierce, Rockford, IL, SAD) označenih anti-humanim IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, SAD)) i inkubirano 30 minuta na 22 ◦ C RT. Čipovi su zatim oprani, osušeni i naknadno skenirani konfokalnim laserskim skenerom (Tecan, Männedorf, Švicarska). Analiza slike je obavljena pomoću softvera za akviziciju i analizu slike mikromrežom MAPIX (Innopsys, Carbonne, Francuska), a konverzija izmjerenih jedinica fluorescencije u ISAC standardizirane jedinice (ISU) je izvedena kako je opisano [13]. Specifični nivoi antitela izraženi su u ISAC standardizovanim jedinicama (ISU). S i RBD-specifični odgovori IgG1-4 antitijela mjereni su u uzorcima plazme (razrijeđenim 1:50) u duplikatima pomoću ELISA-e kao što je prethodno opisano [13] s varijacijom<5% for their average values.
Tabela 3. Sintetički SARS-CoV-2 peptidi izvedeni iz šiljastih proteina §.
4.3. Far UV kružni dikroizam (CD) spektri
Za peptide, P12 i P32, kao i RBD eksprimiran u ćelijama E. coli i HEK293 CD analiza je izvedena korištenjem Jasco J-180 spektropolarimetra (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japan) koji je prethodno opisan [34]. CD spektri peptida i proteina (Slika S1) mjereni su u koncentraciji od 0.1 mg/mL u 10 mM NaH2PO4 (pH 8.0), koji je korišten za uočavanje antigena.
4.4. Test neutralizacije virusa zasnovan na pseudovirusima (PVT)
Aktivnost neutralizacije virusa u uzorcima plazme određena je testom neutralizacije virusa na bazi pseudovirusa kao što je prethodno opisano [35]. Da bi se proizvele SARS-CoV-2 spike virusne čestice (VLP), ćelije HEK293T su kotransfektovane sa 3 plazmida: lentivirusni plazmid za pakovanje pCMV∆8.2R (Addgene, Teddington, UK), pUCHR-GFP i pCAGGS-S∆19 plazmid koji kodira divlji tip SARS-CoV-2 spike proteina (identičan referentnim Wuhan-Hu-1 i WA1 izolatima) ili pCAGGS-S∆19-Om plazmid koji kodira SARS-CoV-2 Omicron spike protein (ljubazan poklon Andreja Gorčakova, Laboratorija za imunogenetiku, Institut za molekularnu i ćelijsku biologiju, Sibirski ogranak Ruske akademije nauka, Novosibirsk, Rusija). Prije upotrebe u pVNT-u, VLP-ovi su titrirani graničnim razrjeđivanjem i inkubirani 4 dana sa hACE2-transficiranim HEK293T ćelijama. Za upotrebu u testu odabrana je doza virusnih čestica koja je dala 50% ćelija pozitivnih na zeleni fluorescentni protein (GFP). Za pVNT, svi uzorci plazme su toplotno inaktivirani 30 minuta na 56 ◦C prije upotrebe. Četvrtog dana, ćelije nakon infekcije su ponovo suspendovane, a procenat GFP-pozitivnih ćelija meren je protočnom citometrijom. Vrijednosti ID50 su izračunate korištenjem sigmoidalne krive (softver GraphPad Prism 9.2.0, Sigmoidal, 4PL), rekonstruisane procentom neutralizacije pri različitim naznačenim koncentracijama u plazmi.
4.5. Test molekularne interakcije (MIA)
Za otkrivanje kapaciteta uzoraka plazme kod rekonvalescentnih ili naivnih subjekata COVID{{0}} (Tabela 1), prije i nakon Sputnjik-V imunizacije, da inhibiraju vezivanje 50 ng/mL RBD-hu-1 na ACE2 receptor molekularni test interakcije (MIA) izveden je kako je opisano [13,36–39]. Ovaj test može mjeriti inhibiciju označenog RBD na ELISA ACE2 vezanog na ploču antitijelima ili inhibiciju drugog spoja RBD-ACE2 interakcije [38]. Ukratko, rekombinantni ACE-2 (GenScript, Piscataway, NJ, SAD) je obložen (2 µg/mL) preko noći na NUNC Maxisorb pločama sa 96 jažica (Thermofisher). Nakon toga su provedena tri ciklusa ispiranja puferom za ispiranje, a zatim su ploče blokirane 3 h na sobnoj temperaturi puferom za blokiranje. Uzorci seruma su razrijeđeni 1:2 u PBS, 0,05% Tween 20, 1% BSA i prethodno inkubirani 2 h sa 50 ng His-označenog rekombinantnog RBD (GenScript). Zatim su prethodno inkubirani uzorci seruma dodani na ploče koje sadrže ACE-2 3 h, a ploče su isprane i inkubirane preko noći sa 1:1000 razrijeđenim mišjim monoklonskim anti-His tag antitijelom (Dianova, Hamburg, Njemačka) . Nakon 3 koraka ispiranja, 1:1000 razrijeđeno HRP-vezano anti-mišje IgG1 antitijelo (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) je dodano 2 h i detekcija je izvršena sa ABTS. Vrijednosti srednje optičke gustoće (OD) koje odgovaraju vezanom RBD mjerene su na 405 nm i 492 nm (referenca) u TECAN Infinite F5 ELISA čitaču sa integriranim softverom i-control 2.0 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Švicarska). Kontrola bafera (preklapanje bez RBD) je oduzeta od svakog rezultata. Određivanja su izvršena u duplikatima i rezultati su prikazani kao srednje vrijednosti sa varijacijom od<5%.
Prednosti suplemenata cistanche-kako ojačati imuni sistem
4.6. Vizualizacija peptida u strukturi šiljastog proteina
Površinska reprezentacija SARS-CoV-2 šiljastog proteina generirana je u PyMOL-u (PyMOL Molecular Graphics System, verzija 2.5.0a0, Schrödinger, LLC, New York, NY, SAD) baziran na na PDB unosu 6XR8.
4.7. Statistička analiza
Statistička analiza je izvršena korištenjem GraphPad Prism (verzija 9.2.0 GraphPad Software, La Jolla California). Wilcoxon test (Slike 1C, D i 3A), Mann-Whitney test (Slike 2B i S3) i Friedmanov test (Slika S2) korišteni su za poređenje između dvije ili više grupa. p < 0.05 se smatralo statistički značajnim. Korelacija između dvije grupe određena je Spearmanovim rang testom (slika 2D). Urađena je normalizirana nelinearna regresija korištenjem softvera GraphPad Prism (Sigmoidal 4PL). Podaci su predstavljeni kao medijan ± IQR. Zvjezdica označava značajne razlike između grupa, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns—nije značajno.
5. Zaključci
Ukratko, naša studija je prva koja detaljno proučava epitop i specifičnost podklase IgG antitijela induciranih Gam-COVID-Vac i otkriva različite mehanizme neutralizacije virusa izazvane Gam-COVID-Vac antitijelima. Konkretno, dobili smo dokaz da su antitijela usmjerena na peptid (tj. peptid 12) koji se nalazi blizu, ali izvan RBD-a u N-terminalnom dijelu S1, povezana s neutralizacijom virusa. Potencijalna aktivnost peptidnih 12-specifičnih antitijela koja neutraliziraju virus može biti posljedica njihove sposobnosti da ometaju tranziciju konformacije šiljastog proteina prije u postfuziju. Predlažemo da se razmotri uključivanje regije definisane peptidom 12 u imunogenom obliku u vakcine kako bi se inducirala antitijela protiv ovog epitopskog područja i testirala antitijela inducirana takvim vakcinama za neutralizaciju virusa. U slučaju da se virusna neutralizacija vakcina može poboljšati, uključivanje epitopa imunogenog peptida 12 može poboljšati efikasnost COVID-19 vakcina. Osim toga, može se razmotriti razvoj antitijela protiv peptida 12-definiranog epitopa za pasivnu imunizaciju. Budući da je peptidom 12-definisani epitop sačuvan u trenutno poznatim SARS-CoV-2 varijantama, vakcine i antitijela usmjerena na peptid 12. maja unakrsnu zaštitu od SARS-CoV-2 varijanti. Stoga pružamo nova znanja koja mogu biti od pomoći za razvoj novih strategija aktivne i pasivne vakcinacije protiv COVID-19.
Reference
1. Rodriguez-Coira, J.; Sokolowska, M. SARS-CoV-2 vakcine kandidati—Sastav, mehanizmi djelovanja i faze kliničkog razvoja. Allergy 2021, 76, 1922–1924. [CrossRef] [PubMed]
2. Sharma, A.; Ahmad, FI; Lal, SK COVID-19: Pregled evolucije, prijenosa, otkrivanja, kontrole i prevencije bolesti od novog korona virusa. Virusi 2021, 13, 202. [CrossRef] [PubMed]
3. Arshad, B.; Iqbal, T.; Bhatti, KP Review-Uvid u Off-Label terapijske strategije protiv blage i teške COVID-19 infekcije. Pak. J. Pharm. Sci. 2021, 34, 1469–1484. [CrossRef] [PubMed]
4. Zaman, W.; Saqib, S.; Ullah, F. COVID-19: Filogenetski pristupi mogu pomoći u pronalaženju resursa za prirodni lijek. Phytother. Res. 2020, 34, 2783–2785. [CrossRef]
5. Rubio-Casillas, A.; Redwan, EM; Uversky, VN SARS-CoV-2 Povremena virulencija kao rezultat prirodne selekcije. COVID 2022, 2, 1089–1101. [CrossRef]
6. Logunov, DY; Dolžikova, IV; Zubkova, OV Sigurnost i imunogenost heterologne prime-boost COVID-19 vakcine bazirane na vektorima rAd26 i rAd5 u dvije formulacije: Dvije otvorene, nerandomizirane studije faze 1/2 iz Rusije. Lancet 2020, 396, 887–897, Ispravka u Lancet 2021, 397, 98. [CrossRef]
7. Folegatti, PM; Ewer, KJ; Aley, PK Sigurnost i imunogenost ChAdOx1 nCoV-19 vakcine protiv SARS-CoV-2: Preliminarni izvještaj faze 1/2, jedno-slijepo, randomizirano kontrolirano ispitivanje. Lancet 2020, 396, 467–478, Ispravka u Lancet 2020, 396, 1884. [CrossRef]
8. Logunov, DY; Dolžikova, IV; Shcheblyakov, DV Sigurnost i efikasnost heterologne prime-boost vakcine COVID-19 bazirane na vektorima rAd26 i rAd5: privremena analiza randomiziranog kontroliranog ispitivanja faze 3 u Rusiji. Lancet 2021, 397, 671–681, Ispravka u Lancet 2021, 397, 670. [CrossRef]
9. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mehanizmi ulaska SARS-CoV-2 u ćelije. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]
10. Heinz, FX; Stiasny, K. Prepoznatljive karakteristike trenutnih vakcina protiv COVID-19: poznate i nepoznanice prezentacije antigena i načina djelovanja. NPJ Vaccines 2021, 6, 104. [CrossRef]
11. Lim, HX; Masomian, M.; Khalid, K.; Kumar, AU; MacAry, PA; Poh, CL Identifikacija epitopa B-ćelija za izazivanje neutralizirajućih antitijela protiv SARS-CoV-2 šiljastog proteina putem bioinformatike i ciljanja monoklonskih antitijela. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4341. [CrossRef]
12. Moroy, G.; Tuffery, P. Strategije zasnovane na peptidima protiv napada SARS-CoV-2: ažurirana perspektiva u silikonu. Front. Lijek. Discov. 2022, 2, 899477. [CrossRef]
13. Gattinger, P.; Niespodziana, K.; Stiasny, K. Neutralizacija SARS-CoV-2 zahtijeva antitijela protiv epitopa domena konformacionog vezivanja receptora. Allergy 2022, 77, 230–242. [CrossRef]
14. Niu, L.; Wittrock, KN; Clabaugh, GC Strukturni krajolik neutralizirajućih antitijela protiv SARS-CoV-2 domene vezivanja receptora. Front. Immunol. 2021, 12, 647934. [CrossRef]
15. Shan, S.; Mok, CK; Zhang, S. Snažno i zaštitno ljudsko neutralizirajuće antitijelo protiv SARS-CoV-2 varijanti. Front. Immunol. 2021, 12, 766821. [CrossRef]
16. Bajpai, P.; Singh, V.; Chandele, A. Široko neutralizirajuća antitijela na SARS-CoV-2 pružaju novi uvid u neutralizaciju varijanti i drugih ljudskih koronavirusa. Front. Cell. Zaraziti. Microbiol. 2022, 12, 928279. [CrossRef]
17. Vishwakarma, P.; Yadav, N.; Rizvi, ZA Teški akutni respiratorni sindrom Koronavirus 2 Novi epitopi bazirani na šiljcima proteina izazivaju snažne imunološke odgovore in vivo i inhibiraju replikaciju virusa in vitro. Front. Immunol. 2021, 12, 613045. [CrossRef]
18. Garrett, ME; Galloway, JG; Wolf, C. Sveobuhvatna karakterizacija odgovora antitijela na SARS-CoV-2 Spike protein pronalazi dodatne epitope izazvane vakcinom osim onih za blagu infekciju. eLife 2022, 11, e73490. [CrossRef]
19. Peng, M.; Dou, X.; Zhang, X. Zaštitni antigeni epitopi otkriveni imunosignaturama nakon tri doze inaktivirane SARS-CoV-2 vakcine. Front. Immunol. 2022, 13, 938378. [CrossRef]
20. Polvere, I.; Parrella, A.; Zerillo, L. Raznolikost humoralnog imunološkog odgovora na različite vakcine protiv COVID-19: implikacije za politiku "Green Pass". Front. Immunol. 2022, 13, 833085. [CrossRef]
22. Tuhvatulin, AI; Dolžikova, IV; Shcheblyakov, DV Otvoreno, nerandomizirano ispitivanje faze 1/2 o sigurnosti, podnošljivosti i imunogenosti jednodozne vakcine "Sputnik Light" za prevenciju infekcije koronavirusom kod zdravih odraslih osoba. Lancet Reg. Health Eur. 2021, 11, 100241. [CrossRef] [PubMed]
22. Gonzalez, S.; Olszevicki, S.; Salazar, M. Efikasnost prve komponente Gam-COVID-Vac (Sputnjik V) na smanjenje SARS-CoV-2 potvrđenih infekcija, hospitalizacija i mortaliteta kod pacijenata starosti 60–79 godina: Retrospektivna kohortna studija u Argentini. EClinicalMedicine 2021, 40, 101126. [CrossRef] [PubMed]
23. Gushchin, VA; Dolžikova, IV; Shchetinin, AM Neutralizirajuća aktivnost seruma iz Sputnjika V-cijepljenih ljudi protiv varijanti zabrinutosti (VOC: B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2, B.1.617.3) i moskovskog endemskog SARS-a -CoV{15}} varijante. Vakcine 2021, 9, 779. [CrossRef] [PubMed]
24. Voko, Z.; Kiss, Z.; Surjan, G. Efikasnost pet vakcina protiv SARS-CoV-2 širom zemlje u Mađarskoj – studija HUN-VE. Clin. Microbiol. Zaraziti. 2022, 28, 398–404. [CrossRef] [PubMed]
25. Jeewandara, C.; Fernando, S.; Pushpakumara, PD Imuni odgovori nakon prve doze Sputnjika V (Gam-COVID-Vac). Sci. Rep. 2022, 12, 1727. [CrossRef]
26. Ikegame, S.; Siddiquey, MNA; Hung, CT Neutralizirajuća aktivnost seruma vakcine Sputnik V protiv SARS-CoV-2 varijanti. Nat. Commun. 2021, 12, 4598. [CrossRef]
27. Gushchin, VA; Tsyganova, EV; Ogarkova, DA Sputnik V zaštita od COVID-19 kod osoba koje žive sa HIV-om pod antiretrovirusnom terapijom. EClinicalMedicine 2022, 46, 101360. [CrossRef]
28. Shamji, MH; Valenta, R.; Jardetzky, T. Uloga alergen-specifičnih IgE, IgG i IgA u alergijskim bolestima. Allergy 2021, 76, 3627–3641. [CrossRef]
29. Eckl-Dorna, J.; Weber, M.; Stanek, V. Dvije godine liječenja rekombinantnom vakcinom protiv alergije na polen trava BM32 inducira kontinuirano povećanje odgovora IgG4 specifičnog za alergen. EBioMedicine 2019, 50, 421–432. [CrossRef]
30. Shamji, MH; Kappen, JH; Akdis, M. Biomarkeri za praćenje kliničke efikasnosti alergenske imunoterapije za alergijski rinokonjunktivitis i alergijsku astmu: EAACI Position Paper. Allergy 2017, 72, 1156–1173. [CrossRef]
31. mr Tortorici; Beltramello, M.; Lempp, FA Ultrapotentna ljudska antitijela štite od izazivanja SARS-CoV-2 putem više mehanizama. Science 2020, 370, 950–957. [CrossRef]
32. Cia, G.; Pucci, F.; Rooman, M. Analiza neutralizirajuće aktivnosti antitijela koja ciljaju otvorene ili zatvorene konformacije proteina šiljaka SARS-CoV-2. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 2078. [CrossRef]
33. Meng, B.; Datir, R.; Choi, J. SARS-CoV-2 šiljak N-terminalnog domena modulira TMPRSS2-zavisan ulazak virusa i fuzogenost. Cell Rep. 2022, 40, 111220. [CrossRef]
34. Resch, Y.; Weghofer, M.; Seiberler, S. Molekularna karakterizacija Der p 10: dijagnostički marker za široku senzibilizaciju kod alergije na grinje kućne prašine. Clin. Exp. Allergy 2011, 41, 1468–1477. [CrossRef]
35. Byazrova, M.; Yusubalieva, G.; Spiridonova, A. Obrazac cirkulirajućeg SARS-CoV-2-specifičnog izlučivanja antitijela i stvaranja B-ćelija memorije kod pacijenata sa akutnim COVID-om-19. Clin. Transl. Immunol. 2021, 10, e1245. [CrossRef]
36. Gattinger, P.; Borochova, K.; Dorofeeva, Y. Antitijela u serumu rekonvalescentnih pacijenata nakon blagog oblika COVID-19 ne sprječavaju uvijek vezivanje virus-receptor. Allergy 2021, 76, 878–883. [CrossRef]
37. Gattinger, P.; Tulaeva, I.; Borochova, K. Omicron: SARS-CoV-2 varijanta koja izaziva stvarnu zabrinutost. Allergy 2022, 77, 1616–1620. [CrossRef]
38. Gattinger, P.; Ohradanova-Repić, A.; Valenta, R. Važnost, primjena i karakteristike testova za mjerenje SARS-CoV-2 neutralizirajućih antitijela. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 5352. [CrossRef]
39. Gattinger, P.; Kratzer, B.; Tulaeva, I.; Niespodziana, K.; Ohradanova-Repić, A.; Gebetsberger, L.; Borochova, K.; Garner-Spitzer, E.; Trapin, D.; Hofer, G.; et al. Vakcina zasnovana na fuzionom proteinu domene za vezanje savijenog receptora - PreS s potencijalom da izazove sterilizirajući imunitet na varijante SARS-CoV-2. Allergy 2022, 77, 2431–2445. [CrossRef]