Karakteriziran je opadanjem fizioloških funkcija u pojedinačnim sistemima organa

Za više informacija kontaktirajte oscar.xiao@wecistanche.com

SAŽETAK

Crni čaj je najčešće konzumirano čajno piće na svijetu i stalno se navodi da ima prednosti protiv starenja. Međutim, ostaje uglavnom nepoznato da li su teaflavini, jedna vrsta karakterističnih fitokemikalija u ekstraktima crnog čaja, uključeni u reguliranje starenja i životnog vijeka potrošača. U ovoj studiji, pokazali smo da teaflavini imaju korisnu ulogu u prevenciji crijevnog curenja i disbioze, odgađajući starenje kod drozofile. Mehanički, teaflavini regulišu kondenzatni sklop Imd kako bi negativno upravljali prekomjernom aktivacijom Imd signala u crijevima voćne mušice. Osim toga, teaflavini sprječavaju DSS-inducirani kolitis kod miševa, što sugerira da teaflavini igraju ulogu u moduliranju integriteta crijeva. Sve u svemu, naša studija otkriva molekularni mehanizam pomoću kojeg teaflavini reguliraju homeostazu crijeva vjerovatno kroz kontrolu Imd koalescencije.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

UVOD

Starenje, koje karakteriše pad fizioloških funkcija u pojedinačnim sistemima organa i rastući rizik od bolesti i smrti, uključuje nakupljanje oštećenja na molekulima, ćelijama i tkivima (Alavez et al., 2011; Bartke et al., 2019; Engeet al., 2017). Identifikacija funkcionalnih materijala ili kemikalija koje sprječavaju biološko propadanje kako bi se odgodio proces starenja i produžio životni vijek nesumnjivo je ključna (Bar-ardo et al., 2017; Kapahi et al., 2017). Prethodne studije su izvijestile da crni čaj, najčešće konzumiran čaj na svijetu, posjeduje značajne aktivnosti koje odlažu starenje (Cameron et al., 2008.; Fei et al., 2017.; Kumar i Rizvi, 2017.; Naumovski et al., 2019. Peng et al., 2009., Xiao et al., 2020.). Dodatak ishrani sa ekstraktima crnog čaja efikasno produžava životni vek eksperimentalnih životinja kao što su crvi (Feet al.,2017), voćne mušice (Peng et al.,2009; Site al.,2011), miševi (Site al.,2011 ; Xiao et al., 2020.) i štakori (Kumar i Rizvi, 2017.).

Dobro je poznato da ekstrakti crnog čaja uglavnom sadrže dvije vrste fitokemikalija, naime, katehine i teaflavine (TF) (Cameron et al., 2008; Kondo et al., 2019; Li et al., 2013), od kojih je potonji proizvode se iz katehina endogenom polifenol oksidazom i peroksidazom tokom procesa oksidacije u proizvodnji crnog čaja (Li et al., 2013). Niz studija je identifikovao ulogu katehina protiv starenja kroz poboljšanje oksidativnog stresa i upale povezane sa starenjem i smanjenje oštećenja tkiva (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Si et al. .2011; Waaner et al., 2015). Međutim, funkcionalne studije o doprinosu TF-a starenju uvelike su zaostajale za onima o katehinima, jer je teško izdvojiti dovoljne količine TF-a iz listova crnog čaja za medicinske studije (Takemoto i Takemoto, 2018). Nedavno je razvijeno nekoliko biosintetskih metoda za masovnu proizvodnju TF-a (Takemoto i Takemoto, 2018), što je omogućilo istraživanje tačnih bioloških efekata TF-a i temeljnih regulatornih mehanizama.

Nedavno je sve veći skup podataka naglasio ključnu ulogu crijeva u starenju i modulaciji životnog vijeka (Guo et al., 2014; Jji et al., 2019; Maynard i Weinkove, 2018; Rothenberg i Zhang, 2019; Salazar et al. ,2018). Intestinalni epitel, koji djeluje kao selektivna barijera, omogućava apsorpciju hranjivih tvari, iona i vode i ograničava kontakt domaćina sa štetnim entitetima, uključujući mikroorganizme, antigene u ishrani i toksine iz okoliša (Capo et al., 2019; Nicholson et al. , 2012; Ryu et al., 2010). Kao tkivo s velikim prometom kod pojedinaca, crijevni trakt pruža najbolje životno okruženje za simbiotske mikroorganizme, uključujući prirodne anaerobne uslove, obilje nutrijenata i odgovarajuću temperaturu i pH

Slika 1. Theaflavini produžavaju životni vijek Drosophile i poboljšavaju sposobnost penjanja

(A i B) Ženke voćnih mušica uzgajane su sa standardnom hranom kojoj je dodato 1 mg/ml ili 2,5 mg/mL teaflavina (TFs) ili bez TF kao baza. Muhe su prebačene u svježe bočice koje su sadržavale nove podloge svaki drugi dan, a mrtve muhe su se bilježile kroz cijeli životni vijek odrasle osobe, analizirane su i prikazane krive preživljavanja (A) i srednja dugovječnost (B) ženki muha.

(Cand D) Ženke w18 hranjene su standardnom hranom za Drosophila (preporučena Basal) ili hranom sa dodatkom 1 mg/ml ili 2,5 mg/ETF, respektivno. Šest nezavisnih grupa muva u naznačenom uzrastu (10 dana, 30 dana, 40 dana, odnosno 50 dana) podvrgnuto je testovima cafe(C) i hranjenja fluoresceinom (D). vrijednosti, formirajući niše koje zauzimaju specifične bakterijske vrste u tijelu (Bonfini et al., 2016; Buchon et al., 2013; Nicholson et al., 2012). U međuvremenu, ovi simbiotski mikroorganizmi i njihovi metaboliti takođe direktno ili indirektno utiču na obradu hranljivih materija; probavu i apsorpciju; energetski bilans; imunološka funkcija; gastrointestinalni razvoj i sazrijevanje; i mnoge druge važne fiziološke aktivnosti (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Maynard i VVeinkove, 2018; Nicholson et al., 2012). Obostrano koristan odnos između dva simbionta može održati stabilnost i dinamičku ravnotežu crijevnog mikro-ekosistema (Bonfini et al., 2016; Brodeerick, 2016; Broderick et al., 2014; Guo et., 2014; May-nard i Weinkove, 2018; Nicholson et al., 2012).

cistanche može protiv starenja

Niz studija je pokazao da je urođeni imunološki odgovor kritičan za održavanje homeostaze crijevne mikrobiote i da se čuva od beskičmenjaka do kralježnjaka (Guillouet al., 2016; Guo et al., 2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay- Kumar et al., 2010). Kod Drosophile, dva glavna signalna puta, odnosno putevi Toll i imunodeficijencije (Imd), uključeni su u urođene imune odgovore (Lu et al., 2020; Myllymakiet al., 2014; Valanne et al., 2011). Značajno je da put Drosophila Toll dijeli sličnosti sa putevima receptora interleukina-1 sisara (IL-1R) i MyD88-zavisnih Toll-like receptor (TLR), dok je put Imd sličan na put receptora faktora tumorske nekroze (TNFR) i TRIF-ovisni TLR put kod sisara (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011). Ova dva puta kontrolišu ekspresiju antimikrobnih peptida (AMP) kroz aktivaciju NF-KB transkripcionih faktora (Imler,2014; Myllymaki et al.,2014; Valanne et al.,2011).bioflavonoidiImd signalni put se normalno aktivira Gram-negativnom bakterijskom infekcijom i rezultira ekspresijom drugog skupa AMP-ova, kao što su Attacin, Cecropin i Diptericin (Kleino i Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Ekspresija ovih AMP-ova zahtijeva protein za prepoznavanje peptidoglikana (PGRP)-LC receptor na putu Imd i cijepanje ovisno o signalu i nuklearnu translokaciju Relisha, transkripcionog faktora porodice NF-kB (Kleino i Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Nedavna studija je pokazala da je formiranje amiloida potrebno za aktivaciju Drosophila Imd puta nakon prepoznavanja bakterijskih peptidoglikana (Kleino et al., 2017). Međutim, ostaje uglavnom nepoznato da li je ovaj Imd kondenzat uključen u druge biološke procese, kao što je održavanje crijevne homeostaze i regulacija starenja.

U ovoj studiji koristili smo voćne mušice i miševe kao životinjske modele da bismo istražili ulogu TF-a u kontroli crijevnog integriteta i starenja. Pokazali smo da TF odgađaju prekomjernu proliferaciju crijevnih matičnih stanica u dobi, štite od disbioze crijevnog mikrobioma i sprječavaju aktivaciju Imd signalnog puta, čime se produžava životni vijek Drosophile. Dalja mehanička istraživanja su pokazala da TF-ovi negativno doprinose Imd signalizaciji mogu biti kroz blokiranje kondenzacije Imd-a, a ne njegove sveprisutne. Štaviše, otkrili smo da su TF veoma efikasni u prevenciji DSS-indukovanog kolitisa kod miševa. Uzeti zajedno, naši nalazi otkrivaju potencijalnu ulogu TF-a u modulaciji ponašanja Imd-a, što bi moglo biti ključni faktor u njihovom pozitivnom doprinosu crijevnoj homeostazi i produženju životnog vijeka.

REZULTATI

Dodatak ishrani teaflavina produžava životni vijek Drosophile

Da bismo ispitali da li teaflavini (TF) utiču na starenje i životni vek Drosophile, uzgajali smo ženke w'118 muha sa standardnom hranom za uzgoj kojoj je dodato 1mg/mL ili 2.5mg/ml TF i izvršili testove životnog veka kao što je prethodno opisano (Ji et al. .,2019). Muhe koje su hranjene hranom sa dodatkom jednakog volumena TFs rastvarača (H2O) smatrane su kontrolama. Kao što je prikazano na slici 1A, dodatak ishrani relativno niske koncentracije TF-a (1 mg/mL) blago je produžio životni vek vinske mušice, a visoka koncentracija TF-a (2,5 mg/mL) imala je značajno pozitivan efekat na produženje životnog veka. Značajno je da je dugotrajno uzimanje visokih koncentracija TF-a (2,5 mg/mL) rezultiralo povećanjem prosječnog životnog vijeka ženki mušica za otprilike 8 dana (Slika 1B), što ukazuje na korisnu ulogu TFsin-a u reguliranju dugovječnosti kod Drosophila. Slični rezultati su dobijeni kada smo testirali potencijalne efekte dodatnih TF-ova na životni vijek mužjaka w'*'''8 muva (Slike S1A i S1B).

Slika 2. Teaflavini sprječavaju disfunkciju crijeva koja nastaje starenjem i disbiozu mikrobiote kod Drosophila

(A i B) Gubitak crijevnog integriteta ispitan je Štrumpftestom u dobi od 10 dana, 30 dana, 40 dana i 50 dana kod ženki sa 18 odraslih osoba. Primjeri ne-Štrumpfova i Štrumpfova prikazani su u (A). Procenti Štrumpfa u različitim naznačenim grupama analizirani su i prikazani u (B).

(C) Bakterijske količine sačuvane qPCR gena 16S rRNA u ženskim w18 fajlovima iz različitih naznačenih grupa su analizirane i prikazane.

(DF) Izvršeno je sekvenciranje komenzalnog bakterijskog 16S rRNA gena. Analizirani su i predstavljeni udjeli bakterijskih taksona (D), toplinska mapa glavnih mikrobnih taksona (F) i relativna brojnost gamaproteobakterija (F).

Slika 2. Nastavak

(G i H) Utrobe su secirane od naznačenih ženki muha hranjenih sa 2,5 mg/ml TF ili bez TF kao kontrola u dobi od 10 i 40 dana. Slike dijapozitiva srednjeg crijeva snimljene su fluorescentnom mikroskopijom za GFP signale (G). Statistička analiza koja pokazuje procente GFP-pozitivnih ćelija prikazana je u (H).

(I) Sakupljena su crijeva navedenih ženki muha i podvrgnuta testovima imunološkog bojenja korištenjem antitijela protiv fosforiliranog histona 3(pH3). Statistički rezultati koji kvantifikuju pH3-pozitivne ćelije po crijevu su analizirani i prikazani. U B, C, H i, podaci su analizirani dvostranim Studentovim testom i prikazani su kao srednja vrijednost ± SEM.NS, nije značajno,*p<><0.001. see="" also="" figure="">

Poznato je da ETF-ovi imaju gorak okus, a gorku hranu obično izbjegavaju oba potrošača, uključujući voćne mušice i sisare (Yamazaki et al., 2014; Yang et al., 2018). Zatim smo pokušali da razjasnimo da li TF mogu uticati na unos hrane Drosophile, jer su prethodne studije dokazale da ograničenje u ishrani dovodi do produženog životnog veka i kod kralježnjaka i kod beskičmenjaka (Hudry et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Moger-Reischer et al. ., 2020.). Da bismo to uradili, prvo smo izveli cafe test, široko korišćen pristup za direktno i precizno merenje brzine hranjenja korišćenjem kapilarne hranilice koja sadrži tečni medij, kao što je prethodno opisano (Ja et al., 2007). Kao što je prikazano na slikama 1C i S1C, dodatak ishrani TF-a (1 mg/mL i 2,5 mg/mL, respektivno) jedva da je promijenio potrošnju hrane testiranih muva. Da bismo to dodatno potvrdili, zatim smo upotrijebili fluorescein kao trag za hranu (Rera et al., 2012; Wang et al., 2005) i izveli test prirodnog hranjenja (Danilov et al., 2015). Kao što je prikazano na slikama 1D i S1D, nismo uspjeli uočiti bilo kakvu korelaciju između suplementacije TF i nivoa unosa hrane. Uzeti zajedno, naši rezultati sugeriraju da korisna uloga TF-a u produžavanju životnog vijeka možda nije posljedica ograničenja u ishrani kod Drosophile.

Dodatni TF su neophodni za uticaj na energetsku homeostazu Drosophila

Pretpostavlja se da polifenoli crnog čaja imaju pozitivan učinak na prevenciju pretilosti inhibirajući varenje, apsorpciju i unos lipida i saharida, smanjujući na taj način unos kalorija (Cameron et al., 2008). Zatim smo pokušali da razjasnimo da li je produženje životnog veka LDrosophile regulisano TFs posledica promena u apsorpciji nutrijenata i skladištenju energije. Da bismo to učinili, prvo smo ispitali nivoe triacilglicerida (TAG), jednog od najčešće otkrivenih lipidnih metabolita (Tennessen et al., 2014.), kod ženki mušica tijekom cijelog života, kao što je prethodno opisano (Fan et al., 2017.).buy cistancheKao što je prikazano na Slici 1E, tretman TF nije uticao na ukupnu zastupljenost TAG u različitim starosnim tačkama. Kada smo dodatno otkrili sadržaj glikogena i kvantificirali cirkulirajuće ugljikohidrate (glukozu i trehalozu) pomoću Hexokinase kita (Li et al., 2018; Ten-nessen et al., 2014), rezultati su pokazali da nije bilo očiglednih promjena između uzoraka sa ili bez tretmana TFs (Slike 1F-1H). Treba napomenuti da su konzistentni rezultati dobijeni kada smo ispitali metaboličke fenotipove koristeći mužjake w118 kao životinjske modele (slike S1E-S1H). Zbirno, ovi podaci sugeriraju da je dodatak ishrani TF-a neophodan za regulaciju homeostaze ugljikohidrata i energije tokom cijelog životnog vijeka Drosophile.

Dalje smo istražili kinetiku prirodnog starenja Drosophile pod intervencijom dijetalnih TF izvodeći brze iterativne negativne geotaksijske (RING) testove kao što je prethodno opisano (Dilliane et al., 2017; Staats et al., 2018). Kao što je prikazano na slikama 1l,1J, S1l i S1J, indeksi penjanja u dobi (40 dana) w1118 (i za žene i za muškarce) u grupama koje su uzimale TFs su značajno poboljšane (skoro 12 posto porasta kod žena i skoro 18 posto povišenja kod muškaraca ) u poređenju sa kontrolnim grupama, sugerirajući da TF potencijalno poboljšavaju penjanje i lokomotorne aktivnosti Drosophile.

Teaflavini sprječavaju curenje crijeva u dobi i disbiozu mikrobiote

Prethodne studije su pokazale da su lokomotorne aktivnosti voćne mušice i životni vijek u velikoj mjeri povezani sa zdravstvenim stanjem domaćina, kao što su spol, prehrana, starost i genotip (Caruso et al., 2013; Heintz i Mair, 2014). Nedavno je nekoliko linija dokaza dokazalo da očuvanje intestinalne Imd signalne homeostaze poboljšava integritet crijeva sprečavanjem prekomjerne proliferacije ISC i stanica prekursora i odgađanjem disfunkcije crijevnog epitela starenja, što zauzvrat pozitivno doprinosi zdravlju organizma (Clark et al. , 2015; Guo et al., 2014). Kod Drosophile je skraćeni životni vijek usko povezan s disfunkcijom crijevne epitelne barijere, a razvoj integriteta ove barijere tokom starenja rezultira produžavanjem životnog vijeka (Clark et al.,2015; Guoet al.,2014; Jet al., 2019). Stoga smo pokušali da utvrdimo da li TF mijenjaju integritet crijeva izvođenjem Smurf testa, metode koja je prethodno opisana (Clark et al., 2015; Rera et al., 2011). Kao što je prikazano na slici 2A, testirane vinske mušice kod kojih su plave boje bile ograničene na probavni trakt nazivane su ne-štrumpfovima (lijeva ploča na slici 2A). Ako su uočene plave boje

Slika 3. Nastavak

(EG) Utrobe su izolovane iz ženki w1118 datoteka koje su hranjene sa 2,5 mg/ml TF ili bez TF kao bazalno u dobi od 10 dana, 30 dana, 40 dana, odnosno 50 dana. Ukupna RNK je ekstrahovana i podvrgnuta aRT-PCR analizama. Analizirani su i prikazani nivoi ekspresije mRNA diptericina (F), atacina (F) i cekropina A1(G). U EG, podaci su analizirani dvostranim Studentovim t-testom i prikazani kao srednja vrijednost ± SEM.NS, nije značajno, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

koji su iscurili iz crijeva u abdomen, domaćini su se računali kao Štrumpfovi (desni panel na slici 2A). U skladu sa prethodnim nalazima (Clark et al.,2015), proporcije Štrumpfa se postepeno povećavale tokom starenja (Slika 2B). Zanimljivo je da je udio odraslih Štrumpfova uveliko smanjen u grupama koje su hranjene TF u poređenju sa kontrolama koje odgovaraju dobi kod obje ženke (sa 8,2 posto na 3,7 posto, sa 19,4 posto na 15,6 posto i sa 35,4 posto na 27,1 posto za grupe u dobi od 30 dana, 40 dana, odnosno 50 dana, Slika 2B) i odrasli muškarci (od 2,7 posto do 0,9 posto, od 6,9 posto do 0,9 posto i od 8,3 posto do 2,7 posto u dobi od 30 godina dana, 40 dana, odnosno 50 dana, slika S2A), što ukazuje da TF mogu spriječiti disfunkciju crijevne barijere kod starih voćnih mušica. Treba napomenuti da smo primijetili veće smanjenje procenta Štrumpfova kod muškaraca (smanjen za skoro 65,8 posto, 86,9 posto i 67,4 posto u dobi od 30 dana, 40 dana i 50 dana, respektivno) od onih u dobi -podudarne ženke (smanjeno za skoro 54,1 posto, 19,5 posto i 23,3 posto u dobi od 30 dana, 40 dana i 50 dana, respektivno), što implicira da bi TF mogli igrati bolju ulogu u smanjenju crijevnog curenja kod mužjaka muva.

Prethodne studije su sugerirale da je disfunkcija crijevne barijere koja se javlja u dobi često u korelaciji s disbiozom crijevne mikrobiote (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014). Stoga smo ispitali intestinalni komenzalni bakterijski sastav nakon dodavanja TFs. Prvo smo koristili univerzalne prajmere i izveli kvantitativne PCR eksperimente da kvantifikujemo nivoe bakterijskog 16S rRNA gena. Kao što je prikazano na slici 2C, kod starijih rezova, ukupna bakterijska populacija iz interventnih grupa za TFs pokazala je upadljivo smanjenje (skoro 45 posto -55 posto) u poređenju sa kontrolama, što sugerira da suplementacija TF-ima vjerovatno sprječava širenje mikrobiote tokom starenja . Zatim smo izvršili metagenomiju kako bismo detaljno ispitali promjene u crijevnoj mikrobnoj zajednici uzrokovane suplementacijom ishranom TF. Kao što je prikazano na slikama 2D-2F, udio gamaproteobakterija, za čije je širenje utvrđeno da je usko povezano sa neuspjehom crijevne barijere (Clark et al., 2015.), očigledno je smanjen suplementacijom TF u starim crijevima ( smanjenje od skoro 7 posto), što implicira da TF pozitivno doprinose homeostazi crijevne mikrobiote tokom starenja kod Drosophila.

Teaflavini poboljšavaju intestinalnu proliferativnu homeostazu kod Drosophila

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), u kojem su intestinalne matične ćelije (ISC) i progenitorne ćelije označene GFP-om. Kao što je prikazano na slikama 2G i 2H, broj GFP-pozitivnih ćelija u TFs intervencijskim grupama u dobi od 40 dana (izbrojano je 20 crijeva) bio je mnogo manji (skoro 29,7 posto) od broja u kontrolnoj skupini koja odgovara starosti (skoro 47,6 posto i Izbrojano je 19 crijeva), što sugerira da bi TF mogli inhibirati pretjeranu proliferaciju ISC-a u dobi. Nadalje, izveli smo eksperimente imunološkog bojenja koristeći antitijela protiv fosfo-histona 3 (pH3), specifičnog markera za mitotičke stanice u tkivima crijeva. Uočili smo manje pH3-pozitivnih ćelija u crijevima kod odraslih odraslih osoba koje su uzimale TFs (prosječni broj je bio 20,6) nego kod onih iz kontrole (srednji broj je bio 39,5, Slika 2). Uzeti zajedno, naši rezultati sugeriraju da dodatak ishrani s TF poboljšava intestinalnu proliferativnu homeostazu i sprječava displaziju mikrobiote koja nastaje starenjem, odgađajući tako starenje kod drozofile.

Teaflavini negativno moduliraju intestinalne Imd signale

Da bismo istražili temeljne molekularne mehanizme pomoću kojih TF pozitivno doprinose homeostazi crijeva Drosophila, izvršili smo RNA-seq analizu koristeći uzorke crijeva odgovarajuće dobi od odraslih žena w1118 liječenih sa ili bez TF-a. Analiza fragmenata po kilobazi na milion (FPKM) sugerira da su ukupni obrasci ekspresije gena slični između dvije eksperimentalne grupe (Slika 3A). Dalja analiza diferencijalne ekspresije, međutim, identifikovala je ukupno 229 različito eksprimiranih gena, od kojih je 99 bilo pojačano, a 126 smanjeno (Slika 3B). Zanimljivo je da je analiza genske ontologije ovih gena otkrila da je put imunološkog odgovora bio jako izmijenjen suplementacijom ishranom sa TF (slika 3C).

U Drosophila, dokazano je da urođeni imunološki signalni putevi igraju dominantnu ulogu u regulaciji crijevne homeostaze i dugovječnosti (Clark et al, 2015; Guo et al, 2014). Zatim smo se fokusirali na ispitivanje obrazaca ekspresije antimikrobnih peptida (AMP) nizvodno od urođenih imunoloških signala. Kao što je prikazano

Slika 4. Nastavak

(D) Pročišćeni Imd proteini su inkubirani sa različitim koncentracijama TF (50 uM, 100 uM i 200 uM, respektivno) na sobnoj temperaturi 5 minuta. Uzorci su zatim podvrgnuti analizi spektra fluorescentne emisije koristeći naznačene talasne dužine (ekscitacija na 430 nm, emisija od 450 nm do 550 nm sa širinom proreza od 5 nm). Kao osnovna kontrola korišten je uzorak bez TF.

（E and F）Lysates of guts from NP11>Myc-Imd mušice su pripremljene i inkubirane sa TF (100 μM) na sobnoj temperaturi 30 minuta. SDD-AGE (gornji panel u E) i SDS-PAGE (donji panel u E) testovi su izvedeni za analizu agregata Imd proteina. Tubulin je korišten kao kontrola opterećenja.cistanchDenzitometrijska analiza je izvršena da se kvantifikuju Imd kondenzati u različitim uzorcima, a rezultati su prikazani u (F). (G) Reprezentativni hromatogram uzorka TFs.

(H i I) Pročišćeni Flag-Imd proteini su inkubirani sa TF, TF1, TF2a, TF2b ili TF3 (100 μM za svaki uzorak) ili sa jednakom zapreminom pufera (kontrola) na sobnoj temperaturi 30 minuta kako je naznačeno. Uzorci su zatim podvrgnuti SDD-AGE (gornji panel u H) i SDS-PAGE (donji panel u H) testovima kako bi se odredili obrasci agregacije Imd. Izvršena je denzitometrijska analiza za kvantifikaciju Imd kondenzata u različitim uzorcima i prikazana u (). U C, F i I, podaci se analiziraju dvostranim Studentovim testom i prikazuju kao srednja vrijednost ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">

na slici 3D, AMP geni upravljani putem imunodeficijencije (Imd), uključujući diptericin A (DptA), dip-tericin B(DptB), atacin A(AttA), cekropin A1 (CecA1), cekropin A2(CecA2) i cecropin C (Cece), bili su značajno smanjeni (za 39,4 posto, 72,3 posto, 10,5 posto, 86,5 posto, 99,8 posto, odnosno 36,1 posto) u grupama koje su tretirane TFs u poređenju sa kontrolnim grupama. Da bismo dalje potvrdili rezultate dobijene RNA-seq analizom, izveli smo kvantitativnu reverznu transkripcijsku lančanu reakciju polimeraze (gRT-PCR) kako bismo kvantificirali relativne nivoe ekspresije AMP gena povezanih s Imd u uzorcima crijeva Drosophila dobivenim u četiri različite starosne točke. uključujući 10 dana, 30 dana, 40 dana i 50 dana. Kao što je prikazano na slikama 3E-3G, nivoi ekspresije mRNA određenih gena, uključujući diptericin, attacin i cekropin A1, značajno su smanjeni (za skoro 35,9 posto -66.6 posto) kod tretiranih TFs ostarjela crijeva. Naši podaci su zajedno otkrili da TF potencijalno antagoniziraju aktivaciju Imd signalnog puta u stanicama crijeva Drosophila tijekom starenja.

Teaflavini su neophodni za regulaciju transkripcije Imd puta ili ubikvitinaciju Imd-a

Pokušali smo ispitati povezanost između TF-a i Imd-a i izveli test površinske plazmonske rezonance (SPR) kao što je prethodno opisano (Lan et al., 2020). Kao što je prikazano na slici 4A. TF-ovi su pokazali umjereni afinitet vezivanja sa pročišćenim Imd proteinom pri procijenjenoj Kp konstanti od 8,078 uM. Zatim težimo da odredimo kako TF kontroliraju intestinalni Imd signalni put. Na osnovu rezultata analize transkriptoma iz RNA-seq podataka, otkrili smo da nivoi ekspresije ključnih regulatornih faktora u signalnom putu Imd, kao što su PGRP-LC, Imd i Relish, jedva da su promijenjeni tretmanom TFs (slika S3A ). Nadalje smo prikupili uzorke crijeva od muva koje su bile podvrgnute dodatku ishrani sa ili bez TF-a u različitim dobima i izveli qRT-PCR eksperimente kako bismo specifično otkrili obrasce ekspresije ovih gena. Kao što je prikazano na slici S3B, nivoi mRNA određenih gena, uključujući effete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, bendless, relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny i diap2, bili su slični između kontrolnih grupa i interventne grupe TF-a, što sugerira da TF-ovi nisu uključeni u regulaciju Imd signala na transkripcijskom nivou.

Zatim smo ispitali profile ubikvitinacije Imd jer su prethodne studije sugerirale da je ubiguitinacija Imd ključna za nizvodnu transdukciju signala u Imd putu (Myllymaki et al., 2014; Zhou et al., 2005). Prvo smo izvršili in vitro test promjene E1 i otkrili da tretman s TF nema vidljiv utjecaj na enzimske reakcije E1 i ubikvitina kako bi se formirao konjugirani E1/Ub (Slika S4A). Štaviše, transficirali smo ćelije Drosophile S2 plazmidima koji eksprimiraju Flag-tagged Imd zajedno sa HA-označenim Ub, a zatim tretirali ćelije sa ili bez TF. Daljnji testovi ubikvitinacije sugeriraju da suplementacija TFs jedva utječe na nivoe ubikvitiniranog Imd u kultiviranim ćelijama (Slike S4B i S4C). Za utvrđivanje odnosa između TF-a i ubikvitinacije Imd in vivo, koristili smo transgenu muhu P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd};P{Tub-Gal80*} (nazvanu NP1* s > Myc-Imd), u kojoj je Myc-označeni Imd protein bio visoko eksprimiran u stanicama crijeva (Slika S4D). Naši eksperimenti s ubikvitinacijom pokazali su da je dodatak ishrani sa TF-ima neophodan za modulaciju ubikvitinacije Imd u tkivima crijeva (slike S4D i S4E). Uzeti zajedno, naši rezultati su pokazali da TF negativno upravljaju Drosophila Imd signalima ne utičući na obrazac ubikvitinacije Imd.

Theaflavins sprečavaju sklapanje kondenzata Imd

Nedavna studija je sugerirala da je agregacija Imd ključna za aktivaciju nizvodnih gena u Imd putu (Kleino et al., 2017). Zatim smo pokušali da ispitamo da li TF regulišu proces

Slika 5. Nastavak

(F i G) Ženka w18 (naziva se imd plus / plus), imd' heterozigotni i homozigotni mutanti (koji se nazivaju imd plus /- i imd-/-, respektivno) uzgajani su standardnom hranom za Drosophila (koji se naziva Basal) ili dijetetski suplement sa 2,5 mg/mL (koji se naziva TF), a zatim su podvrgnuti testu životnog vijeka. Krivulja preživljavanja (F) i srednje dugovječnosti (G) su analizirani i prikazani.

U i F, Log Rank test je korišten za statističku analizu. U BE, i, dvostrani Studentov t-test je korišten za statističku analizu, a podaci su sh kao srednja vrijednost ± SEM. NS, nije značajno, *str<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

Imd formiranje agregata. Prvo smo pročistili Myc-označene Imd proteine ​​iz kultiviranih S2 ćelija i inkubirali proteine ​​s različitim koncentracijama TF-a (slika 4B). Zanimljivo je da smo otkrili da TF značajno sprječavaju agregaciju Imd (smanjeno za 81,7 posto -89, 7 posto, slike 4B i 4C), kao što sugeriraju naši testovi elektroforeze u agaroznom gelu poludetergenta (SDD-AGE). Da bismo potvrdili ovaj nalaz, dodatno smo izvršili testove vezivanja tioflavina-T i dobili konzistentne rezultate (Slika 4D). Na kraju, uzgojili smo NP1ts > Myc-Imd transgene muhe koje su bile podvrgnute dodatku ishrani sa ili bez TF-a i sakupili smo uzorke crijeva od starijih odraslih osoba. Eksperimenti SDD-AGE sugerirali su da je agregacija Imd u velikoj mjeri smanjena od strane TF-a u crijevnim ćelijama (smanjena za 16,7 posto -22 posto, slike 4E i 4F).

Da bismo utvrdili kako TF doprinose kontroli montaže Imd kondenzata, podvrgli smo TF-ove HPLCanal-izi i otkrili da uglavnom sadrže četiri vrste monomera (slika 4G), naime, teaflavin (TF1), teaflavin 3-O-galat ( TF2a), teaflavin 3'-O-galat (TF2b) i teaflavin 3,3'-di-O-galat (TF3), koji su bili u skladu s prethodnim izvještajima (Li et al., 2013; Takemoto i Takemoto, 2018) . Zatim smo svaku od ovih hemikalija inkubirali sa pročišćenim Imdproteinom i izveli SDD-AGE eksperimente. Kao što je prikazano na slikama 4H i 4l, tretman svih ovih TF monomera rezultirao je značajnim smanjenjem (za 59,5 posto, 60,9 posto, 58,4 posto, 58,2 posto i 55,8 posto za TF, TF1, TF2a, TF2b i TF3, respektivno) Imd agregatni nivoi. Zajedno, naši rezultati sugeriraju da TF negativno reguliraju signalni put Drosophila Imd vjerovatno kontrolirajući ponašanje Imd kondenzata.

Theaflavini produžavaju životni vijek Drosophile na način ovisan o imd-u

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>plus )muhe. jer je Relish ključni faktor transkripcije odgovoran za ekspresiju gena Imd nizvodno AMP (Myllymaki et al., 2014). Kao što je prikazano na Fiqures S5C i S5D. dodatak ishrani TF-a značajno je produžio životni vek kontrolnih muha, a ovo produženje životnog veka je značajno spriječeno kod Relish RNAi muva. Kolektivno, naši podaci pokazuju da dodatak ishrani TF pozitivno doprinosi životnom vijeku drozofile vjerovatno ovisno o intestinalnim Imd signalima.

Kako bismo vidjeli da li se produženje životnog vijeka od strane TF i dalje događa u aksenskoj pozadini, izvršili smo testove životnog vijeka koristeći w1118 ženki u aksenskim uvjetima. Kao što je prikazano na slikama S5E i S5F, dodavanje različitih koncentracija TF-a (1 mg/mL i 2,5 mg/mL) teško je uticalo na omjer mortaliteta i srednjeg životnog vijeka odraslih osoba w18. Budući da uslovi aksenskog uzgoja mogu u velikoj mjeri spriječiti obilje mikrobiote, ograničavajući na taj način Imd signale u rezovima (Clarke al., 2015), naši podaci sugeriraju da TF produžavaju životni vijek Drosophile možda kroz modulaciju urođenih imunoloških signala reguliranih crijevnom mikrobiotom.

Slika 6. Theaflavini ublažavaju kolitis izazvan DSS-om kod CD-1 miševa

(A) Tretman TF nije utjecao na potrošnju vode u različitim grupama CD-1 miševa.

(BD) Primjena gavaža različitih koncentracija TF-a (1 mg/mL, 2,5 mg/mL, odnosno 5 mg/mL) poboljšala je skraćivanje debelog crijeva i povećanje slezene uzrokovano DSS-om kod CD-1 miševa. Prikazane su reprezentativne slike (B) i statističke analize debelog crijeva (C) i slezene (D). (E) Davanje različitih koncentracija TF-a (1 mg/mL, 2,5 mg/ml, odnosno 5 mg/mL, respektivno) spriječilo je curenje crijeva izazvano DSS-om kod CD-1 miševa. (F i G) Debelo crijevo je sakupljeno od naznačenih grupa miševa. Ukupna RNK je ekstrahirana i podvrgnuta qRT-PCR testovima da bi se otkrili nivoi ekspresije mRNA TNFa(F) i IL-6 (G).

(HL) Koloni iz različitih grupa miševa sakupljeni su uzdužno i podvrgnuti HE testovima bojenja. Uzorci su pregledani mikroskopski, a dobijene su i prikazane reprezentativne slike navedenih uzoraka (HL). Skala trake, 40 μm. (M-Q') SEM slike koje pokazuju mikrotrihome debelog crijeva iz različitih naznačenih uzoraka. Skala trake, 50 um (MQ) i 4 um (M'-Q').

U CG, podaci su analizirani dvostranim Studentovim testom i prikazani kao srednja vrijednost ± SEM.NS, nije značajno, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

Teaflavini ublažavaju kolitis izazvan DSS-om kod CD-1 miševa

Da bi se dalje istražila potencijalna uloga TF-a u održavanju crijevne homeostaze kod sisara, CD-1 miševi su korišteni da induciraju kolitis dekstran sulfat natrijum (DSS). Miševima su intragastrično davane različite koncentracije TF (1 g/L, 2,5 g/L ili 5 a/L) ili vode kao kontrola tokom četiri nedelje, nakon čega je usledio tretman sa 2 procenta DSS u vodi za piće tokom 7 dana. Kako bismo vidjeli da li TF utječu na količinu DSSa u različitim grupama miševa, pratili smo pijenje miševa svaki dan. Kao što je prikazano u Fiqure6A, tretman TFs je neophodan da utiče na konzumaciju pića kod miševa sa kolitisom izazvanim DSS-om, miševi tretirani sa DSS-om su imali sindrom kolitisa sa dijarejom i/ili hematohezijom, koji su spriječeni tretmanom TF-ovima zavisnim od doze (Slike S6A-S6E).cistanche AustraliaŠtaviše, intervencija sa TF je spasila smanjenje dužine debelog crijeva uzrokovano DSS i poboljšala povećanje slezine (Slike 6B-6D).

Zatim smo koristili dekstran-4000-FITC (FITC-DX) da ispitamo funkciju crijevne barijere ovih miševa. Kao što je prikazano na slici 6E, miševi iz grupa tretiranih DSS-om pokazali su visoku koncentraciju FITC-DX u uzorcima krvi, što ukazuje na curenje crijeva kod ovih životinja. Međutim, intervencija s TF značajno je spriječila transport FITC-DX iz organa za varenje u cirkulatorni sistem (smanjen za 56,1 posto -77.5 posto, slika 6E). Primetno je da primena TF nije promenila propusnost creva kod miševa u normalnim uslovima (slika S6F). Budući da upala igra ključnu ulogu u razvoju kolitisa kod mišjeg modela, mi smo dalje izveli qRT-PCR eksperimente, pokazujući da liječenje TFs značajno smanjuje ekspresiju IL-6 i TNF u crijevima miševa tretiranih DSS (Slike 6F i 6G).

Da bismo dalje analizirali patološke promjene u debelom crijevu, izvršili smo testove bojenja hematoksilin-eozinom (HE). Kao što je prikazano na slikama 6H-6L i S6G-S6J, teško oštećenje epitela izazvano DSS-om je značajno poboljšano tretmanom TFs na način ovisan o dozi. Snimanje ovih crijevnih uzoraka skeniranom elektronskom mikroskopom dodatno je dalo konzistentne rezultate (slike 6M-6Q' i S6K-S6N'). Uzeti zajedno, naši nalazi su pokazali da TF igraju korisnu ulogu u zaštiti funkcije crijevne barijere i kod insekata i kod sisara.

DISKUSIJA

U ovoj studiji istraživali smo fiziološke funkcije TF-a u moduliranju crijevne homeostaze i dugovječnosti i temeljnih molekularnih mehanizama. Pokazali smo da dodatak ishrani sa TF pozitivno doprinosi prevenciji starosne disbioze crevne mikrobiote i odgađanju disfunkcije crevnog epitela, čime se produžava životni vek Drosophile. Naše in vitro i in vivo mehaničke studije otkrile su da TF-ovi vjerovatno igraju negativnu ulogu u kontroli signalnog puta Imd blokirajući koalescenciju Imd. Štaviše, otkrili smo da se kolitis izazvan DSS-om može efikasno ublažiti suplementacijom TF kod CD-1 miševa. Naši rezultati podržavaju ideju da TF povoljno doprinose intestinalnoj homeostazi i kod beskičmenjaka i kod kičmenjaka.

Dodatak ishrani teaflavinima produžava životni vijek Drosophile

Konzumacija čaja je popularna širom svijeta i druga je nakon potrošnje vode (Rothenberg i Zhang, 2019). Brojne studije su se fokusirale na fiziološke funkcije često putem eksperimentalnih i kliničkih pristupa (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Rothenberg i Zhang.2019; Spindleret al., 2013; Takemoto i Takemoto, 2018; Unno et al., 2020; Zhou et al., 2020. Opsežno je pokazano da čaj koristi zdravlju smanjenjem nivoa lipida i efektima protiv gojaznosti, a glavna funkcionalna jedinjenja u čaju su katehini, posebno epigalokatehin galat (EGCG) (Abbas i Wink, 2009; Modernelli et al., 2015; Niu et al., 2013; Wagner et al., 2015; Xiong et al., 2018). Prethodne studije su takođe pokazale da zeleni čaj i crni čaj može produžiti zdravstveni i životni vijek voćnih mušica (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), crva (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) i pacova (Imran et al., 2018). .,2018; Niu etal.2013), a glavni regulatorni mehanizam je efikasna prevencija oksidativnog stresa od strane EGCG putem modulacije ROS signala.cistanche pogodnosti,Međutim, ostaje uglavnom nepoznato da li TF, kao karakteristična "zlatna" jedinjenja u crnom čaju, igraju ulogu u regulaciji starenja i životnog vijeka. Ova studija pruža uvjerljive dokaze koji ukazuju na to da je intervencija TF-a neophodna za utjecaj na unos hrane, a dugotrajno uzimanje TF-a putem ishrane značajno produžava životni vijek i muških i ženskih voćnih mušica. Ovi nalazi daju smjernice za daljnje studije o funkcijama TF-a u dugovječnosti sisara.

Theaflavini poboljšavaju disbiozu mikrobiote koja se javlja u dobi i promoviše homeostazu crijeva. Progresivna neravnoteža proliferativne homeostaze i regenerativnog kapaciteta je obilježje starenja i bolesti koje nastaju starenjem (Clark et al., 2015; Heintz i Mair, 2014; Maynard i Weinkove, Re. et al. 2012). Hronična upala je povezana s gubitkom homeostaze i povećanom incidencom raka kod ostarjelih organizama (Bartke et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Xiao et al., 2020). Ovo je posebno značajno kod barijernog epitela kao što je crijevni epitel (Guo et al., 2014; Maynard i Weinkove, 2018). Sa modelom za razvoj displazije povezane sa starenjem u crijevima koja stare, pokazali smo da poboljšanje interakcija domaćina i komenzala u epitelu barijere starenja može unaprijediti zdravlje i životni vijek. Koristili smo niz neinvazivnih pristupa za ispitivanje crijevne funkcije i dinamike mikrobiote tokom starenja. Prvo, Štrumpf test je pokazao pozitivnu ulogu TF-a u regulaciji disfunkcije epitelne barijere tokom starenja. Zatim, imunobojenje pomoću nekoliko transgenih muva otkrilo je da TF odgađaju prekomjernu proliferaciju ISC i promet diferenciranih stanica. Konačno, sekvencioniranje mikrobioma sugerira da TF smanjuju rast crijevne komenzalne mikroflore s početkom starenja. Ovi rezultati snažno ukazuju da TF igraju ključnu ulogu u odlaganju procesa starenja domaćina održavanjem homeostaze crijeva.

Teaflavini ublažavaju pretjerane imunološke reakcije u crijevima tako što negativno reguliraju Imd signalizaciju

Predloženo je da se delikatna ravnoteža između imunološke funkcije crijeva i mikrobiote mora održavati kako bi se osigurala dugoročna homeostaza barijernog epitela (Guo et al., 2014; Maynard i Weinkove, 2018). Prethodne studije su također pokazale da je kronična prekomjerna upala u crijevima povezana s disfunkcijom vezanom za starenje u epitelu barijere i da je obilježje starenja (Clark et al., 2015.; Guo et al., 2014.; Ji et al., 2019.) . Stoga je održavanje zdrave komenzalne populacije očuvanjem urođene imunološke homeostaze u takvom epitelu obećavajući pristup promicanju zdravlja i dugovječnosti (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Clark et al., 2015). Istražiti molekularne mehanizme koji TF odlažu starenje, izvršili smo RNA-seq analizu koristeći secirana crijeva sa ili bez tretmana TF. Naši podaci sugeriraju da je grupa gena koji su visoko eksprimirani u crijevima kontrolnih voćnih mušica u usporedbi s onom kod životinja tretiranih TFs obogaćena genima klasificiranim kao geni "imunog odgovora". Dalja bioinformatička analiza i get-PCR testovi otkrili su da je ekspresija AMP gena povezanih s Imd dramatično inhibirana dodatkom TF u ishrani. Rezultati CD{14}} eksperimenata na miševima koji koriste DSS za izazivanje abnormalnih imunoloških odgovora u crijevima dodatno su potvrdili ideju da TF funkcioniraju kao zaštitnici protiv crijevne upale.

Teaflavini potiskuju signale određujući amiloidni sklop Imd

Kako TF negativno regulišu Imd signalni put? Na osnovu rezultata analize transkriptoma, otkrili smo da su TF-ovi neophodni za regulaciju transkripcije ključnih faktora u Imd signalnom putu. Od interesa, uočili smo očigledan afinitet vezivanja TF-a sa pročišćenim Imd proteinom pomoću SPR testa, što je sugeriralo vjerovatnoću da TF-ovi mogu igrati ulogu u kontroli ponašanja proteina Imd ili njegovog post-translacijskog procesa modifikacije. Prethodne studije su istakle ključnu ulogu ubikvitinacije u transdukciji Imd signala (Kleino i Silverman,2014; Myllymaki et al.,2014), a prevencija ubikvitinacije Imd rezultira dubokim gašenjem Imd signalizacije (Myllymaki et al.,2014; Thevenon et al., 2009). Međutim, naši testovi in ​​vitro i in vivoubikvitinacije pokazali su da TF jedva utječu na obrazac ubikvitinacije Imd. Nedavna studija je pokazala da je stvaranje amiloida potrebno za aktivaciju Drosophila Imd puta nakon prepoznavanja bakterijskih peptidoglikana (Kleino et al., 2017). Zanimljivo je da su naši SDD-AGE i ThTbinding testovi sugerirali da je spajanje Imd spriječeno TF-ovima. Prevencija agregacije Imd uništavanjem ili mutacijom Imd u stanicama crijeva očito je preokrenula korisne efekte TF-a na produženje životnog vijeka. Kako bismo dodatno potvrdili naše otkriće, bilo bi zanimljivo ispitati da li TF-ovi više nisu funkcionalni za produženje životnog vijeka voćnih letača kada je konzervirani kriptični RHIM (cRHIM, aminokiseline od 118. do 121. h) motiv Imd-a specifično uništen, na osnovu nalaza da je zločin u Imd-u bitan za njegovu agregaciju i formiranje amiloida (Kleino et al., 2017). Ipak, naša studija naglašava ključnu ulogu TF-a u kontroli crijevne homeostaze i procesa starenja, možda kroz modulaciju Imd koalescencije. Buduće studije bi se trebale fokusirati na istraživanje koje ostatke ili regije Imd vezuju TF i kako ovo vezivanje rezultira prevencijom kondenzacije Imd. Štaviše, naši nalazi u sistemu sisara ukazuju da TF mogu efikasno zaštititi debelo crevo od upale izazvane egzogenom otrovnom hemikalijom DSS, što sugeriše očuvanu regulatornu ulogu TF u održavanju crevne homeostaze. Vrijedi istražiti da li TF igraju ulogu u upravljanju sastavljanjem proteina u tkivima sisara.

Ovaj članak je preuzet iz zhongwenxie@ahau.edu.cn