Medij za kulturu micelija Ceriporia Lacerata kao novi mikrobni materijal protiv starenja za kozmetičku primjenu
Mar 27, 2023
Ključne riječi:Cistanchelacerata; protiv starenja; anti-inflammation; antioksidacija; anti-kolagenaza; regulacija filagrina;izbjeljivanje; zarastanje rana
Kliknite ovdje da saznate kako Cistanche djeluje za njegu kože
1. Uvod
Između ostalih organa, ljudska koža je avangardno sučelje koje je stalno izloženo štetnim vanjskim podražajima, kao što su opće metaboličke reakcije, kozmetika i ultraljubičasto (UV) zračenje. Ovi faktori dovode do neželjenih biohemijskih nusproizvoda, uključujući reaktivne vrste kiseonika (ROS), matriks metaloproteinaze (MMP) i napredne krajnje proizvode glikacije (AGE), koji mogu izazvati starenje kože, uključujući bore, pigmentaciju i gubitak tonusa kože [1,2]. ROS, opasne molekule kisika kao pleiotropni fiziološki prijenosnik signala, uglavnom induciraju umrežavanje kolagena i elastina kako bi izazvali bore i niži oporavak kože, za koje se smatra da su glavni pokretač starenja uzrokovanog UV zrakama i zagađenjem [3]. MMP su enzimi aktivirani izlaganjem UV zračenju ili upalom, koji doprinose razgradnji kolagena dok inhibiraju stvaranje novog kolagena [1]. Stvaranje AGE je rezultat reakcije glukoze s proteinima, uključujući kolagen kože, što može doprinijeti gubitku elastičnosti, borama, upalama, inhibiciji rasta stanica kože i ubrzanom starenju [2]. Budući da je oksidativni stres jedan od metaboličkih faktora i puteva koji su najviše povezani sa starenjem stanica, potrošnja funkcionalne hrane i funkcionalne kozmetike s antioksidativnim djelovanjem značajno raste. Stoga, antioksidansi mogu biti korisni za ljudsko tijelo direktno ili indirektno neutralizirajući ROS, putem regulacije metaboličkih puteva i ekspresije gena kao glavnih mehanizama stanične aktivacije. Prirodni metaboliti dobiveni iz mikrobnih izvora korišteni su u raznim primjenama kao izvor ishrane i kao sredstvo za njegu kože [4]. Među njima, metaboliti dobiveni iz gljiva sadrže biološki aktivne sastojke značajne komercijalne vrijednosti uključujući oligosaharide, egzopolisaharide (EPS), enzime, peptide, vitamine i biosurfaktante. Ovi metaboliti se široko koriste kao glavne sirovine za farmaceutske proizvode, funkcionalnu hranu i kozmetičke proizvode (5-9). Prepuni hiljada antioksidanata i protuupalnih svojstava, naširoko se koriste u borbi protiv starenja poboljšavajući stanje kože. prirodnu odbranu, vraćanje elastičnosti kože, povećanje vlažnosti, podsticanje sinteze kolagena i ispoljavanje efekata izbeljivanja kože (4,5) Osim toga, ova jedinjenja koja zamenjuju tradicionalne hemijske sastojke, primenjuju se u raznim kozmetičkim proizvodima koji se koriste za poboljšanje zdravlja i lepote kože. čovječanstvo na siguran i detoksikacijski način. Posebno, jedinstvena biokompatibilnost, netoksičnost i funkcionalnost gljivičnog EPS-a su široko korišteni u kozmetičkoj industriji (4). Na primjer, metabolička jedinjenja kao što je Schizophyllan, polisaharid p{ {7}},3 P-glukan sa p-1,6 grananjem, ekstrahovan iz Schizophyllum commune, poznato je da pomaže kod antiinflamatornih efekata kože i zaštite od UV zračenja (101. Izolovan je fermentni filtrat Galactomyces (GFF) od Galactomycescandidum za proučavanje kozmetičkih učinaka na smanjenje pora kože lica, pigmentaciju kože i ublažavanje oksidativnog stresa, dok su mehanizmi djelovanja koji su u osnovi EPS-a GFF-a zajedno s informacijama o njegovim spojevima još uvijek neidentificirani (11). Cistanche lacerat je vrsta bijele gljivične filamentne gljive koja igra važnu ulogu u bioremedijaciji razgradnjom celuloze i lignina (12,13). Bioaktivna efikasnost micelija C. lacerata (kultura CLM je proučavana za kontrolu nivoa hiperglikemije (14)) , lučenje insulina kroz citoprotektivne efekte (15) i signalizacija insulina kroz aktivaciju protein kinaze aktivirane AMP (AMPK) i transportera glukoze tipa 4 (GLUT4) (16,17. Međutim, farmakološki efekat CLM na antioksidaciju i antioksidaciju -starenje još nije poznato.
KulturniC. laceratasastoji se od mikroskopskih polipora; tako, izgleda kao bijela mahovina (Sl1a). Tokom procesa tečne kulture, različiti sekundarni metaboliti, npr. egzometaboliti, nastaju u zavisnosti od uslova okoline (Slika1b). Međutim, ne postoje izvještaji o C. lacerate ili CLM o efektima vezanim za njegu kože. Stoga je ova studija imala za cilj istražiti antioksidativne, zacjeljivanje rana, poboljšanje bora, hidrataciju i izbjeljivanje efekata CLM-a na mehanizam protiv starenja ćelija kože. Koliko nam je poznato, ova studija je prvi izvještaj koji predlaže novi put za njegu kože na ćelijskom nivou zasnovan na mehanizmu protiv starenja koristeći antidijabetičke sastojke dobivene iz kulture CLM-a, mikroorganizma u nastajanju [14–17].
Slika 1. Zelena metoda proizvodnjeCistanche lacerataegzofarmaceutske supstance (CLEPS), uključujući čvrstu kulturu
(a) i nizvodni procesi (b) kao što su predkultura (i), glavna kultura (i) i filtracija (i).
2.2. Mjerenje antioksidativne aktivnosti2.2.1. 2,2-difenil-1-pikril-hidrazil-hidrat (DPPH)
Ispitivanje aktivnosti čišćenja Sposobnost CLEPS-a za uklanjanje slobodnih radikala testirana je fotometrijskim testom uklanjanja radikala DPPH prema metodologiji koju su opisali Choi et al. (18] i Kedare et al. (19. CLEPS je pomiješan sa 90 mM metanolnog DPPH da bi se formirale konačne koncentracije otopine 0,5, 1 i 5 mg/mL u {{7} }ploče sa bunarima, koje su inkubirane 30 min na 25 stepeni i očitana je apsorbancija (OD) u čitaču mikroploča (Multiskan GOTermofisher Scientific, Waltham, MA, USA) na talasnoj dužini od 517 nm. Tri nezavisna eksperimenta Kao pozitivna kontrola korišćena je askorbinska kiselina (AA, 1 mg/mL). Procenat inhibicije DPPH je izračunat prema sledećoj formuli: procenat uklanjanja DPPH=kontrola A0 - uzorak A1/kontrola A0] x 100, pri čemu A1 označava apsorbanciju uzorka, dok A0 označava apsorbanciju kontrole (metanolni rastvor DPPH).
2.2.2. 2,2-Azinobis-(3-etilbenzotiazolin-sulfonska kiselina) (ABTS)
Aktivnost uklanjanja radikala Određivanje aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala CLEPS rastvora postignuto je ABTS testom dekolorizacije kationskih radikala prema metodologiji opisanoj bKedare et al. (19). Generisanje ABTS kationskih radikala je postignuto kombinovanjem 10mg ABTS-a i 2 mg kalijum persulfata u vodi. Rastvor je stavljen u mrak na 25 stepeni oko 12 h pre upotrebe. ABTS rastvor (1 mL) je razrijeđen sa 60 mL metanola, zatim je CLEPS pomiješan sa 90 uM metanolnog ABTS-a da bi se formirale konačne koncentracije rastvora od 0,5, 1 i 5 mg/ml u 96-pločama. Ploče su inkubirane na25 ◦C tokom 30 minuta i OD je mjeren na talasnoj dužini od 734 nm pomoću MultiskanGO instrument. Izvedena su tri nezavisna eksperimenta. askorbinska kiselina (AA,1 mg/mL) je korištena kao pozitivna kontrola. Procenat inhibicije ABTS je izračunat poslijedeći formulu ispod:ABTS postotak čišćenja {{0}} [kontrola A0− uzorak A1/kontrola A0]× 100 gdje A1 označavaapsorbanciju uzorka, dok A0 označava apsorbanciju kontrole (metanolni rastvorod ABTS).
2.3. Ispitivanje vitalnosti ćelija
montiran sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) (WelGENE, Gyeongsan, Koreja) i 1 posto penijacillin/streptomicin (WelGENE, Gyeongsan, Koreja) na 37◦C u 5 posto CO2 inkubator (UP50H,Forma Scientific, Marietta, OH, SAD). Ćelije su inkubirane na 7× 104ćelije / bunar u12-bunarploča. Nakon potvrde adhezije ćelije, prebačen je u bezserummedija i rastvori su tretirani radnom koncentracijom u svakoj jažici 72 h. Rastvor tiazolil plavog tetrazolijum bromida (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, SAD) nakoncentracijaod 100µg/mL je dodat u svaku jažicu i inkubiran na 37◦C, 5 posto CO2 za2 h. Zatim je sav medij kulture uklonjen i 500µL DMSO (Duchefa Biochemicals, Harlem, Holandija) je dodan u svaki bunar. Apsorbancija na 570 nm je bilamjereno ELISA čitačem (Epoch, Bio-tek INC, Winooski, VT, SAD). Ćelijska kulturamedij je korišten kao negativna kontrola (kontrola (-)).
2.4. Nivo ekspresije Filagrina
Kako bi se prikazalo kako CLEPS utječe na funkciju barijere kože, nivo ekspresije mRNA filagrina je izmjeren RT-PCR. HaCaT ćelija je kultivisana na 2× 104 ćelije/jažicu u 24-jažici na ploči koristeći DMEM medijum koji sadrži 10 procenata FBS, 1 procenat penicilina i 1 procenat streptomicina, a zatim kultivisan na 37◦C, 5 posto CO2 inkubator 24h. Nakon uklanjanja supernatanta, svaki uzorak je dodan u DMEM medijum isključujući FBS tokom 24 h na 37◦C, 5 posto CO2 inkubator. Nakon inkubacije, supernatant je uklonjen i RNA je sakupljena prema priručniku uz pomoć Easy Blue reagensa za lizu (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Koreja). RT PreMix (BIONEER, Daejeon, Koreja) je korišten na 42◦C 60 min i 95◦C tokom 5 minuta da se sintetiše cDNK. PCR prajmeri (Macrogen, Daejeon, Korea) su dizajnirani kako je prikazano u tabeli1 i Western blotting je izveden da bi se odredila količina ekspresije filagrina.
Lum G (Aplegen, Pleasanton, Kalifornija, SAD). Kao standardni interni protein, -aktin (Sigma,St. Louis, MO, SAD).
2.5. Test inhibicije melanogeneze B16 ćelija melanoma
Da bi se pronašle sigurne doze za test inhibicije melanina i promatrala aktivnost inhibicije melanina pomoću tretmana uzorkom CLEPS, B16 ćelije melanoma (ATCC) na 1× 105 ćelije/jažicu su uzgajane u 6-pločici za kulturu jažica koja je sadržavala DMEM medijum s 10 posto FBS i 1 posto penicilin-streptomicina dodanim na 37◦C i 5 posto CO2 stanje. Induktor sinteze melanina, - hormon koji stimuliše melanocite ( -MSH), pripremljen je otapanjem u 10 posto DMSO u koncentraciji od 50µM. Nakon inkubacije od 24 h, dodani su CLEPS rastvori i odmah tretirani sa -MSH (50 nM), praćeno dodatnom inkubacijom od 72 h. Zatim su ćelijske ploče isprane dva puta sa PBS-om i tripsinizirane, a zatim su obnovljene ćelije centrifugirane na 5000 rpm tokom 10 minuta kako bi se uklonio supernatant, nakon čega je dobivena ćelijska peleta. Sadržaj intracelularnog melanina određen je prema prethodno navedenoj metodi uz manje modifikacije [20]: melanin je sakupljen otapanjem u 2 N NaOH koji sadrži 10 posto DMSO na 60°C◦C tokom 4 h, koji je prebačen na ploču sa 96-bunarićima. DMSO (0,1 postov/v) je rastvarač za kontrolne i ispitne uzorke sa -MSH. Apsorbancija je izmjerena na 475 nm pomoću ELISA čitača.
2.6. Anti-inflamatorni test dušikovog oksida (NO)
Kao negativna kontrola korištena je podloga bez LPS (normalna grupa).
2.7. Anti-inflamatorni test inducibilne sintaze dušikovog oksida (iNOS), ciklooksigenaze-2 (COX2) i faktora tumorske nekroze (TNF )
2.8. Sinteza kolagena i inhibicija kolagenaze
NHDF ćelije su kultivisane i prethodno tretirane sa CLEPS da bi se ispitala efikasnostCLEPS na stvaranje kolagena i inhibiciju kolagenaze uzimanjem prokolagena tipa IC-peptid EIA komplet (Takara, Kusatsu, Japan) i humani pro-MMP-1 kvantikin ELISAkomplet (R&D sistem, Minneapolis, MN, SAD). Kao metoda mjerenja nivoa aktivnosti kolagenaze, enzima koji razgrađuje kolagen, antitijela protivkorištena je kolagenaza (MMP-1), dok je forbol 12-miristat 13-acetat (PMA) (Sigma)koristi se za aktiviranje izraza MMP-1. 10 ng/mL TGF-a (Sigma) je raspuštenau mediju kulture i korišten je kao pozitivna kontrola, dok je medij kulture bionegativnu kontrolu.
2.9. In vitro test zarastanja rana
Da bi se ispitao efekat CLEPS-a na zarastanje rana, HaCaT ćelije (1× 104ćelije/bunarić)stavljeni su u ploče sa 12-bunarićima 48 h i narasli su do ~100 posto konfluencije. Jednosloj je bioranjen vrhom sterilne 200µL pipeta. Ostaci ćelija su uklonjeni pranjemdva puta sa PBS-om. Ove ćelije su zatim zamenjene svežim 1% serumskim medijumom sa ilibez CLEPS-a (100, 500 i 1000µg/mL), nakon čega slijedi stimulacija u trajanju od 0–48 h. Kontrolagrupa je korištena za poređenje svojstava zacjeljivanja rana u prisustvu i odsustvuod CLEPS. Mikrofotografije zatvaranja rane (migracija ćelija) snimljene su u 0–48 histih ranjenih područja pomoću invertnog mikroskopa (Zeiss, Jena, Njemačka). Theprocentualna promjena površine rane u pikselima je kvantificirana ručno za svaku sliku pomoću ImageJSoftver (v1.52a, Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, MD, SAD).
2.10. Statistička analiza
Biofunkcionalni testovi CLEPS-a na svakoj platformi izvedeni su u tri primjerka. Therezultati su izraženi kao srednja vrednost± standardna devijacija. Izvršene su statističke analizevan koristeći ANOVA, nakon čega slijedi Tukey HSD posthoc test ili Studentovt-test. Ovi testoviobavljeni su korištenjem SPSS softvera (v25, International Business Machines, Armonk, NY,SAD) i Microsoft Excel (v1905, Microsoft, SAD). Ap-vrijednostof<0.05 was considered statistički značajno.
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950
