Potencijal protiv starenja tvari Cistanche na bazi P za dugovječnost ljudske kože

2.5. Melanogeni učinak Cistanche gela u sistemu kokulture keratinocita i melanocita

Nakon uspješnog zajedničkog uzgoja melanocita i keratinocita (omjer 1:5), melanogeniefekat odCistanchegel u sistemu ko-kulture. Pokazali smo da akumulacija melanozoma nije povećana zaCistanchegel koji sadrži 1-10 ug/mL Cistanchea (Slika 5A), dok je alfa-melanocit-stimulirajući hormon (MSH), pozitivna kontrola, značajno povećao akumulaciju melanozoma. Za potvrdu efektaCistanchegela na sintezu melanina, ekstracelularni ili intracelularni sadržaj melanina je kvantifikovan u prisustvu Cistanche gela u sistemu ko-kulture. Slika 5B pokazuje da Cistanche gel koji sadrži 1-10 ug/mL Cistanchea nije poboljšao sintezu melanina u odnosu na PBS tretman na ćelije, dok je alfa-MSH snažno povećao sadržaj melanina u sistemu ko-kulture.

Slika 5.Efekat Cistancheagel o melanogenezi u sistemu kokulture keratinocita i melanocita. (A) Za imunofluorescentnu analizu melanozoma, kokultivisane ćelije su tretirane povećanom dozom Cistanche gela (1-10 ug/mL) tokom 72 h, a zatim fiksirane i analizirane imunofluorescentnim obeležavanjem humanim anti- HMB-45 antitijelo, konačno inkubirano sa mišjim lgG konjugiranim fluoresceinom. Jezgra su označena sa DAPI. Traka razmjera=500 um. (B,C) Kvantifikacija efekta Cistanche gela na proizvodnju melanina u sistemu kokulture. Nakon inkubacije sa povećanjem koncentracije Cistanche ge.{11}} ug/mL) tokom 72 h, ekstracelularni (B) i intracelularni (C) nivoi melanina su odvojeno određeni mjerenjem apsorbancije na 405 nm. PBS ili alfa-MSH je korišten kao negativna ili pozitivna kontrola, recistancheektivno. Sve vrijednosti su predstavljene kao srednja vrijednost plus SD iz tri nezavisna eksperimenta HMB, ljudski melanom crni; lgG, imunoglobulin G; DAPI, 4' ,6-diamidino-2-fenilindol; MSH hormon koji stimuliše melanocite.

Ovdje nabavite uzorak ekstrakta Cistanche Sp

3. Diskusija

Cistanche, undekapeptid koji pripada porodici peptida tahikinina, ima preferencijalni afinitet za neurokinin-1 receptor (NK-1R) (21). Nakon vezivanja za NK-1R,Cistanche izaziva mnoge signale zacjeljivanja rana, kao što je rast stanica(15,22), sinteza kolagena (17,23) i regulacija anti-inflamacije (24-26Sposobnost zacjeljivanja rana Cistanchea sugerira njegovu potencijalnu primjenu kao materijala protiv starenja, putem proizvodnje kolagena i inhibicije upale Međutim, upotreba Cistanchea je ograničena zbog njegove niske stabilnosti (19,27). Ranije smo prijavili novu formulaciju Cistanchea, naime Cistanche gel, koji je izazvao jače djelovanje zacjeljivanja rana od samog Cistanchea, uz poboljšanu stabilnost (20 Ovi podaci zajedno sugeriraju da primjena Cistanche gela zaista može poboljšatiefekti protiv starenja samog Cistanchea na ljudsku kožu. Međutim, efekti protiv starenja Cistanche gela još nisu dokazani na ljudskoj koži. Stoga je ova studija imala za cilj utvrditi sposobnost Cistanche gela protiv starenja za upotrebu kao kozmetičkog sastojka. U ovoj studiji, Cistanche gel je značajno povećao ekspresiju prokolagena tipa 1, koji je najzastupljeniji protein u vezivnom tkivu kože ( 28] (Slika 2A) Generalno, prokolagen tipa I uglavnom se razgrađuje MMP, što je porodica endo-proteaza koje zahtijevaju cink, sposobne da razgrađuju sve komponente ECM (29).

Konkretno, MMP-1 inicira degradaciju prokolagena tipa I (30) Nivo MMP-1 je ranije sugerisan da je direktno povezan sa TIMP-1. Kao tkivni inhibitor metaloproteinaze 1, TIMP-1 indirektno utiče na transdukciju signala zavisnu od ECM-a u nekoliko tkiva inhibirajući MM-1 (31). U ovoj studiji, Cistanche gel je značajno inhibirao ekspresiju MMP-1 u HDFs (slika 2B), a uglavnom je pojačao ekspresiju TIMP-1 (slika 2C). Zbirno, rezultati sugeriraju da povećani nivo prokolagena tipa I, uzrokovan Cistanche gelom, može biti pod utjecajem inhibicije MMP-1, što zauzvrat može biti u korelaciji s povećanom regulacijom TIMP{{15 }} u HDF-ovima tretiranim Slgelom. Dodatno, učinak Cistanche gela na sintezu kolagena može se objasniti u smislu protuupalnog djelovanja Cistanche gela, Upala aktivira transkripciju različitih faktora koji razgrađuju metaloproteinaze što dovodi do abnormalne degradacije kolagena i nakupljanja nefunkcionalnih komponenti (6l, Upalni reakcije su obično inducirane proinflamatornim citokinima (npr. IL-1 alfa i IL-6) (32,33], a poznato je da ih inhibiraju protuupalni citokini (npr. IL{{ 26}}, IL-10 i TGF-beta 1) (34,35).Naši sadašnji rezultati ukazuju na značajno smanjenje upalnih reakcija Cistanche gela u SDS-stimuliranim HEKs (Slika 3), što implicira da Protuupalni efekti Cistanche gela mogu pozitivno uticati na sintezu kolagena.Stoga, Cistanche gel, kao atraktivan materijal sa dvostrukom funkcijom sinteze kolagena i antiinflamatornog dejstva, ima potencijal da pokaže bolju efikasnost protiv starenja od konvencionalnih agenasa u klinička praksa. Generalno, sinteza kolagena se dešava u HDF unutar kože (28,36). Stoga, Cistanche gel treba da ima visoku sposobnost prodiranja u kožu kako bi postigao svoj efekat protiv starenja. Stoga smo nastojali ispitati može li Cistanche gelis prodrijeti u rekonstruirani 3D model ljudske kože. Nakon 1 h lokalne primjene, Cistanche gel je prošao kroz SC i akumulirao se u epidermu. Uočeno je i malo akumulacije u dermalnom tkivu, što sugerira da se Cistanche gel može apsorbirati u kožu (Slika 4B) Nakon 24 h, zajedno sa akumulacijom u epidermisu, uočena je i jaka zelena fluorescencija u dermisu, što ukazuje na prisustvo Cistanche gel tamo. Inače, nakon 1 h, uočena je slaba zelena fluorescencija za tretman samo za Cistanche u dermisu, ali ne nakon 6 h (Slika S2). To znači da je degradiran u uslovima kulture keraskin@-FT, što sugeriše da je degradirani Cistanche brzo prodro u keraskin@-FT i pobegao u medijum u roku od 6 h. Iako mehanizam kojim se Cistanche gel internalizira u kožu još nije jasan, čini se da je povezan s njegovom karakterističnom molekularnom strukturom. Mnogi amfipatski peptidi posjeduju sposobnost apsorpcije kože (37-39], što bi moglo značiti da su amfipatske karakteristike peptida glavni faktori za kožnu apsorpciju Zaista, pokazalo se da amfipatske peptide preuzimaju stanice sisara putem neendocitnog mehanizma (40-42). Potonje, putem energetski nezavisnih puteva, inicira se interakcijom između amfipatskih peptida i membrana domaćina, praćeno različitim mehanizmima koji uključuju formiranje invertiranih micela, formiranje pora, model sličan tepihu i membranu model stanjivanja(43).S obzirom da pripada grupi malih amfipatskih peptida, koji se vezuju za G-protein spregnute receptore [44,45) može se apsorbirati u kožu.Osim toga, površinski aktivna komponenta, polisorbat 80, prisutna u Cistanchegelu Kao poznati pojačivač apsorpcije kože, nejonski surfaktant polisorbat 80 sadrži dugi ugljikovodični lanac i etilen oksid, koji daju i lipofilne i hidrofilne karakteristike spoju (46). Stoga, na osnovu prethodnih nalaza iz nekoliko studija, može se predložiti da se Cistanche gel efikasno apsorbuje u sloj kože.

općenito, komponente povezane s rastom stanica kože vjerovatno će uzrokovati pigmentaciju kože. Nekoliko faktora rasta ima potencijal da proizvede pigmentaciju kože (47,48). Cistanche gel, koji ima učinak povećanja rasta stanica kože (20) , može dovesti do pigmentacije kože, slično onoj uzrokovanoj faktorima rasta. Prijavljeno je da Cistanche povećava sadržaj melanina i inducira proces pigmentacije u ljudskim melanocitima [49]. Međutim, Ping i saradnici (50) su pokazali da Cistanche potiskuje melanogenezu u ćelijskoj liniji mišjeg melanoma, B16-F10 stanicama, što ukazuje da njegov potencijalni mehanizam može biti povezan sa inhibicijom puta sinteze melanina, slično p38 mitogenom aktiviranoj protein kinazi (MAPK) i povezanom s mikroftalmijom faktor transkripcije (MITF).Ovi prethodni izvještaji o pigmentaciji izazvanoj Cistancheom su kontroverzni.Različiti rezultati se mogu pripisati nestabilnosti Cistanchea.Da bi se precizno utvrdilo da li Cistanche gel izaziva pigmentaciju u ljudskim suknjama ispitao je njegov učinak na melanogenezu u keratinocitu -sistem kokulture melanocita. Konkretno, sistem kokulture ljudskih keratinocita i melanocita pruža okruženje slično ljudskoj koži (51], a na sistem kokulture smo nanijeli Cistanche gel da vidimo njegov efekat pigmentacije. U uslovima normalne kulture pronađen je Cistanche gel da ne pospešuje nakupljanje melanosoma (slika 5A) i sintezu melanina (slika 5B), što ukazuje na to da Cistanche gel ne izaziva pigmentaciju na ljudskoj koži.Naši rezultati pružaju dokaze u prilog prednostima Cistanche gela kao kozmetičkog sastojka materijala protiv starenja. , bile bi potrebne dodatne studije kako bi se dodatno razjasnili efekti protiv starenja P gela. Ova studija pokazuje da se svojstva protiv starenja stimulirana Cistancheom mogu direktno primijeniti na klinička istraživanja. Shodno tome, sada radimo na potvrđivanju kliničkog učinka Cistanche gela sa svojstvima reCistancheect protiv starenja Osim toga, planiramo istražiti protuupalne efekte i kliničku toksičnost Cistanche gela u keraskin@-FT i ljudskoj koži, reCistancheektivno na osnovu naših sadašnjih rezultata, Cistanche gel se ne čini da izazove oštećenje ćelijske membrane i iritaciju kože u ljudskim ćelijama i na rekonstruisanoj 3D ljudskoj koži (Slika 1). Ipak, u budućnosti ćemo raditi primarni test iritacije, koristeći Cistanche gel na ljudskoj koži.

U zaključku, naša intro studija je pokazala da tretman Cistanche gelom može povećati nivoe prokolagena tipa, u korelaciji sa regulacijom MMP-1 i TIMP-1, kao i antiinflamatornim efektom. Osim toga, pokazali smo povećanu sposobnost upijanja kože Cistanche gela, bez izazivanja pigmentacije kože. Kolektivno, naši nalazi sugeriraju da bi se gel Cistanche mogao koristiti kao efikasan i siguran kozmetički sastojak sa funkcijama protiv starenja.

4. Materijali i metode

4.1. Materijali

All reagents were purchased from Sigma-Aldrich (Louis, MO, USA) and were used as received unless otherwise indicated. Antibodies against DAPI and melanoma marker (HMB45) were purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) and DAKO (Carpinteria, CA, USA) reCistancheectivelySynthetic Cistanche (RPKPOOFFGLM-NH2) and FITC-labeled Cistanche (FITC-Cistanche) were synthesized and purified to>95 posto Anygen (Gwangju, Koreja). Kompleti za enzimski imunosorbentni test (ELISA) kupljeni su od R&D Systems (Minneapolis, MN, SAD). Ljudski epidermalni keratinociti (HEK i humani melanociti (HMs, SK-MEL-28; ATCC, VA, USA) uzgajani su u mediju za rast keratinocita (KGM: Lonza, Walkersville, MD, USA) i ljudski dermalni fibroblasti (HDFs) uzgajane u mediju za rast fibroblasta (FGM: Lonza).

4.2. Cistanche gel tretmani

Cistanche gel je proizveden prema prethodnom izvještaju [52]. To (20 µg/mL Cistanchea u Cistanche gelu) je razrijeđeno u PBS prije nego što se koristi za tretman uzoraka. Da bi se odredila toksičnost izazvana Cistanche gelom, vitalnost, efekti povećanja kolagena i melanogeneza, različite koncentracije Cistanche gela (1-10 µg/mL Cistanche u Cistanche gelu) su primijenjene na ove eksperimente. Osim toga, Cistanche gel koji sadrži 5 µg/mL Cistanche ili FITC-Cistanche je korišten za detekciju protuupalnih ili apsorpcijskih efekata Cistanche gela, reCistancheectively.

4.3. Izolacija i kultura HEK-a i HDF-ova

Izolirali smo primarne HEK i HDF ćelije iz biopsija prepucijuma, koje je obezbijedio Chung-Ang University HoCistancheital u Koreji [IRB br. C2014234(1431)]. Biopsijski uzorci su tri puta isprani rastvorom PBS, a krvni sudovi i potkožno masno tkivo su izrezani oštrim nožem. Dobijeni listovi tkiva su zatim isečeni na male delove i prebačeni u 0.5% rastvor DiCistanchease II, nakon čega je usledila inkubacija na 37 ◦C tokom 2 h. Epidermis i dermis su uklonjeni pincetom, nakon čega je uslijedila inkubacija sa 0.05 posto tripsina razrijeđenog u PBS-u u trajanju od 30 minuta. Uzorci su zatim prebačeni u 0,2% rastvor kolagenaze i inkubirani na 37 ◦C tokom 2 h. Aktivnost tripsina i kolagenaze je zatim zaustavljena dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma, a fragmenti tkiva su filtrirani kroz ćelijsko cjedilo i isprani u PBS. Rezultirajuće HEK i HDF ćelije su posađene na plastične posude i kultivisane u KGM i FGM, reCistancheektivno.

4.4. Analiza oštećenja ćelijske membrane

Za analizuštetno dejstvo Cistancheagela na ćelijskoj membrani, HDF-ovi su uzgajani u 96-pločama (3 × 103 ćelije/jažici) u FGM. Nakon 24-h inkubacije, ćelije su tretirane Cistanche gelom (1-10 µg/mL Cistanche u Cistanche gelu) i inkubirane još 24 h. Testovi zasnovani na LDH (Roche Applied Science, Mannheim, Njemačka) su izvedeni, prema uputama proizvođača, kako bi se dalje testirali efekti Cistanchea na oštećenje ćelijske membrane. Pozitivne kontrole smo tretirali sa 1 posto Triton X-100 i postavili oslobađanje LDH na 100 posto. Relativno oslobađanje LDH izračunato je, koristeći intaktne ćelije, iz omjera oslobođenog LDH u odnosu na ukupni LDH. LDH oslobađanje<10% was considered to be non-toxic. Three independent experiments were performed to confirm our findings.

4.5. In-vitro test iritacije kože

Rekonstruisana ljudska epidermalna tkiva (Keraskin®-FT) su kupljena od Biosolution Co., Ltd. (Seul, Koreja). U skladu sa prethodnim studijama [53], tkiva su kondicionirana inkubacijom preko noći na dan prijema. Nakon predinkubacije u trajanju od 24 h, prebačeni su u ploču sa šest jažica napunjenu svježim podlogom i lokalno tretirani sa 100 µL negativne kontrole (PBS), pozitivne kontrole (5 posto SDS) i Cistanche gel (1–10 µg/mL Cistanche u Cistanche gelu) 24 h na 37 ◦C. Tkiva su nakon toga temeljito isprana PBS-om i prebačena u svježu podlogu. Nakon kultivacije u trajanju od 48 h, provedena je analiza vitalnosti ćelija prijenosom tkiva u 24-ploču koja sadrži MTT medijum (0,3 mg/mL), nakon čega je uslijedila 3-h inkubacija. Plavi formazan je ekstrahovan izopropanolom, a njegova optimalna gustina je potvrđena na 570 nm pomoću VersaMax podesivog čitača mikroploča (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornija, SAD). Relativna vijabilnost ćelije izračunata je za svako tkivo, kao procenat srednje vrednosti tkiva negativne kontrole. Za histološku evaluaciju, tkiva su fiksirana u 4 posto formaldehida i obrađena za ugradnju u parafin. Nakon toga, 5-µm vertikalni preseci su izrezani i obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) za pregled pod BX41 svjetlosnim mikroskopom (Olympus, Tokyo, Japan). Izvedena su najmanje tri nezavisna eksperimenta.

4.6. Mjerenje prokolagena tipa 1, MMP-1 i TIMP-1

Nivoi prokolagena tipa I, MMP-1 i TIMP-1u HDF-ima su kvantificirani pomoću EIA kompleta za prokolagen tipa I C-peptida (P1P) (Takara Bio, Inc., Otsu, Japan) i ljudski MMP-1 i TIMP-1 ELISA kompleti (R&D sistemi), reCistancheectively. HDF-ovi su zasijani pri gustini od 3 × 103 ćelija/jažici. Nakon 48 h, ćelije su tretirane PBS-om (negativna kontrola) ili različitim koncentracijama Cistanche gela (1-10 µg/mL) tokom 24 h. Nivoi prokolagena tipa I, MMP-1 i TIMP-1 u podlozi za kulturu su izmjereni prema uputama proizvođača. Rezultati za svaku grupu su izraženi kao procenat srednje vrednosti negativne kontrolne grupe.

4.7. Mjerenje IL-1 Alpha, -6, -10 i TGF-Beta 1

HEK-ovi su zasijani u gustini od 3 × 104 ćelije/jažici. Nakon 48 h, ćelije su tretirane sa PBS (negativna kontrola), 15 ng/mL SDS-a ili Cistanche gelom (5 µg/mL Cistanche u Cistanche gelu) tokom 24 h. Stanični supernatanti su sakupljeni za detekciju inflamatornih citokina kao što su IL-1 alfa, -6, -10 i TGF-beta 1. Koncentracija citokina u supernatantima određena je ELISA-om komplete, prema uputama proizvođača. Koncentracije u uzorcima su izračunate u odnosu na odgovarajuće standardne krive i izražene su za svaku grupu kao procenat srednje vrijednosti negativne kontrolne grupe. Izvedena su najmanje tri nezavisna eksperimenta.

4.8. Kožna apsorpcija Cistanche gela u rekonstruisanim ljudskim epidermalnim tkivima

Lokalna kožna apsorpcija Cistanche gela (5 µg/mL Cistanche u Cistanche gelu) procijenjena je korištenjem rekonstruirane ljudske epiderme, keraskin®-FT. Šema tretmana Cistanche gelom prikazana je na slici 4A. Ukratko, 100 µL Cistanche gela, koji sadrži FITC-Cistanche, naneseno je lokalno na keraskin®-FT, a dijelovi tkiva su fiksirani preko noći u ledeno hladnom 4 posto formaldehida. Nakon toga, uzorci tkiva su isprani u PBS-u, a zatim uronjeni u 4,5 postotni rastvor saharoze tokom 24 sata. Nakon toga uslijedila je dehidracija uzoraka u 30 posto saharoze dok nije došlo do taloženja. Koristili smo mikrotom za zamrzavanje (Leica, Wetzlar, Njemačka) za proizvodnju krio-sekcija debljine pet mikrona, koji su zatim snimljeni pomoću fluorescentnog mikroskopa (Nikon, Tokio, Japan).

4.9. Kokultura i imunofluorescencija