Suplementacija gvožđa odgađa starenje i produžava ćelijski životni vek kroz potenciranje mitohondrijske funkcije Ⅱ
Mar 23, 2023
3.2. Suplementacija gvožđem povećava otpornost na oksidativni stres
Ćelijsko starenje je povezano sapovećan oksidativni streskoji oštećuje biološke sisteme i ublažava bolesti povezane sa starenjem [34]. Budući da je suplementacija gvožđa odložila starenje, istražili smo njen uticaj naoksidativni stres. Koristili smo anoksidativni stresspoj induktora, vodikov peroksid (H2O2), za testiranje oksidativne otpornosti ćelija. Ćelije su prvo uzgajane u prisustvu gvožđa do stacionarne faze (72 h) u SD medijumu. Nakon toga, stanice su isprane i inkubirane s različitim koncentracijama H2O2 u YPD mediju i rastao je 24 h.OksidativnoOtpornost na stres analizirana je poređenjem rasta ćelija ćelija tretiranih H2O2- sa netretiranom kontrolom. Otkrili smo da su ćelije koje su suplementirane gvožđem otporne na oksidativni stres u poređenju sa kontrolom (Slike2a i S3). Da bi se potvrdilo da suplementacija gvožđa pruža otpornost na oksidativni stres, BPS je dodat gvožđu i rastu ćelija sa H.2O2 je analiziran. Dodavanje BPS-a smanjilo je otpornost na oksidativni stres ćelija obogaćenih gvožđem (Slika2b). Ovi rezultati su u korelaciji s ulogom suplementacije gvožđem u odlaganju starenja i produženju životnog veka ćelije.
3.3. Suplementacija gvožđa pojačava mitohondrijalne funkcije
Mitohondrije su glavno ćelijsko čvorište za korištenje i metabolizam željeza [35–38]. Smanjenje mitohondrijalnih funkcija povezano je sa starenjem [39–43]. Gvožđe služi kao kofaktor nekoliko mitohondrijalnih proteina, uključujući klastere gvožđa i sumpora i proteine koji sadrže hem [44–46]. Ovi proteini koji sadrže gvožđe uključeni su u ciklus mitohondrijalne trikarboksilne kiseline (TCA) i lanac transporta elektrona (ETC) (slika 3a). Istražili smo da li je za produžavanje životnog vijeka stanica uz dodatak željeza potrebne mitohondrijalne funkcije. Da bismo ovo testirali, analizirali smo ekspresiju gena mitohondrijalnog TCA ciklusa. Otkrili smo da suplementacija gvožđa značajno indukuje ekspresiju nekoliko gena TCA ciklusa (Slike 3b i S4a). Metaboliti TCA ciklusa - ketoglutarat i oksaloacetat mogu proizvesti glutamat i aspartat kataplerotskim reakcijama u mitohondrijima (slika 3a). Ove aminokiseline se koriste u biosintezi proteina, lipida i nukleotida [47-49]. Zanimljivo je da je ekspresija biosintetskih gena glutamata (GDH1 i GDH3) i aspartata (AAT1 i AAT2) smanjena u ćelijama sa suplementom gvožđa (slika 3c). Ovaj profil ekspresije sugeriše da suplementacija gvožđa promoviše očuvanje umesto konzumacije intermedijara TCA ciklusa. U skladu sa ovom idejom, ekspresija gena gena mitohondrijalnog anaplerotskog puta (PYC1, PYC2 i GDH2) je značajno povećana u ćelijama sa suplementom gvožđa (slika 3c). PYC1 i PYC2 kodiraju piruvat karboksilazu koja pretvara piruvat u oksaloacetat. GDH2 kodira glutamat dehidrogenazu koja sintetiše -ketoglutarat iz glutamata. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da suplementacija gvožđa konfiguriše ćelije u metaboličkom stanju koje favorizuje anaplerozu i sprečava kataplerozu kako bi se pojačale metabolite TCA ciklusa.
Slika 3.Suplementacija gvožđa poboljšava mitohondrijalne funkcije. (a) Pregled mitohondrijaTCA (trikarboksilna kiselina) ciklus i ETC (lanac transporta elektrona) sa glavnim kataplerotikom iilustrovane su anaplerotične reakcije. (b) Prototrofni soj kvasca je inkubiran sa 100µM FeSO4 i uzgajana u SD mediju 8 h na 30◦C. RNK je ekstrahirana iz kultura iekspresija naznačenih gena TCA ciklusa je analizirana kvantitativnom RT-PCR. (c) Izrazanaliza kataplerotičnih gena (GDH1, GDH3, AAT1,iAAT2) i anaplerotični geni (PYC1, PYC2,iGDH2) urađen je kvantitativnim RT-PCR. (d) Analizu ekspresije ETC gena uradili sukvantitativni RT-PCR. Statistički značaj (*p < 0.05) was determined by Student's t-test.
Reakcije TCA ciklusa stvaraju NADH i FADH2 koji su oksidirani ETC kompleksima I i II i potrebni za funkcionalnost TCA ciklusa (Slika3a). IakoS. cerevisiaenedostaje kompleks I, redukcioni ekvivalenti se prenose u respiratorni lanac preko NADH dehidrogenaze. Sukcinat dehidrogenaza igra centralnu ulogu i učestvuje u TCA ciklusu i ETC kompleksu II (Slika3a). Zapanjujuće, ekspresija sukcinat dehidrogenaze (SDH1iSDH2) bio je visoko reguliran među svim analiziranim genima TCA ciklusa (Slika3b,d). Ovi rezultati pokazuju da se tok TCA ciklusa nastavlja prema ETC umjesto da akumulira određeni međuprodukt. Isto tako, ekspresija svih drugih gena ETC kompleksa bila je visoko regulirana u stanicama obogaćenim željezom (Slika3d). ETC je povezan sa stvaranjem reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), koje regulišu ekspresijuSOD2gen [50]. On kodira mangan-superoksid dismutazu (MnSOD) koja je glavni čistač mitohondrijalnog superoksida.SOD2ekspresija gena je povećana u ćelijama sa suplementom gvožđa (dopunska slika S4a) što je u skladu sa ekspresijom ETC gena. Dalje smo analizirali potencijal mitohondrijalne membrane (MMP) koji generišu protonske pumpe ETC kompleksa I, III i IV. Otkrili smo da suplementacija gvožđa povećava MMP ćelija (dodatna slika S4b). Zatim smo ispitali strukturu mitohondrija pomoću fluorescentne mikroskopije. Otkrili smo da suplementacija gvožđa sprečava fragmentaciju mitohondrija (dodatna slika S4c). Sve u svemu, ovi rezultati ukazuju na to da suplementacija gvožđa pojačava mitohondrijalne funkcije ćelija.
3.4. Suplementacija gvožđem povećava nivo ATP-a potreban za produženje ćelijskog životnog veka
Reakcije mitohondrijalnog TCA ciklusa proizvode redukcijske ekvivalente NADH i FADH2 koji prenose elektrone na ETC i stvaraju adenozin trifosfat (ATP) kroz oksidativnu fosforilaciju (OXPHOS) (Slika3a). Pošto je ekspresija TCA ciklusa i ETC gena pojačana suplementacijom gvožđa, testirali smo njen efekat na sintezu ATP-a. U skladu sa profilom ekspresije mitohondrijalnog TCA ciklusa, ekspresija ETC gena i nivoi ATP-a bili su visoki u ćelijama sa dodatkom gvožđa (Slika4a). Zatim smo pitali da li je ATP neophodan za produženje životnog veka ćelija koje su zasićene gvožđem. Inhibirali smo sintezu ATP-a i izmjerili CLS kvasca. Antimicin A (AMA) je inhibitor sinteze ATP-a koji se vezuje za kompleks III i blokira prijenos elektrona u mitohondrijskom ETC [51]. Prvo smo ispitali nivo ATP-a i otkrili da tretman AMA inhibira sintezu ATP-a (Slika4b). Dalje smo testirali efekat AMA na ćelijski životni vek ćelija obogaćenih gvožđem. Ćelije kvasca su inkubirane sa gvožđem i AMA u SD medijumu. Rast ćelija dostigao je zasićenje nakon 24 h (dodatna slika S5). Nakon toga, izmjerili smo preživljavanje i otkrili da tretman AMA inhibira produženje životnog vijeka posredovano suplementacijom željeza (Slika4c). Zajedno, ovi nalazi otkrivaju da suplementacija gvožđem povećava nivo ATP-a koji je neophodan za produženje životnog veka ćelije. Također smo primijetili da je životni vijek ćelija tretiranih AMA bio kraći od kontrolnog (Slika4c), dodatno potvrđujući da je nemogućnost sinteze ATP-a ugrozila životni vijek.
3.5. Suplementacija gvožđa sprečava ubrzano starenje AMPK Knockout mutanta
AMPK je glavni regulator homeostaze stanične energije [20,21]. Visoko konzervirani ljudski analog AMPK u kvascuS. cerevisiaeje protein Snf1 [52]. AMPK aktivira mitohondrijalne funkcije za proizvodnju ATP-a u energetski ograničenim uvjetima. Nedavni izvještaji su pokazali da se smanjenje mitohondrijalnih funkcija s godinama događa dijelom zbog narušene aktivnosti AMPK u različitim starim organizmima [53,54]. Dakle, odsustvo AMPK aktivnosti utječe na mitohondrijalne funkcije i ugrožava brojne ćelijske funkcije uključujući metabolizam, otpornost na stres i preživljavanje stanica koje su najkritičnije determinante starenja i životnog vijeka. U skladu sa prethodnim studijama, miutvrdio da jesnf1nokaut mutacija je ugrozila nivo ATP-a, otpornost na oksidativni stres i životni vijek (Slika5a–c).
Slika 5.Dodatak gvožđu spašava ubrzano starenje AMPK nokaut mutanta. Thekvasac prototrofni divlji tip i AMPK knockout mutant (snf1∆) sojevi su uzgajani do stacionarnihfaza u SD mediju 72 h na 30◦C. (a) ATP analiza divljeg tipa isnf1∆ sojeva. (b) Oksidativnoanaliza stresa divljeg tipa isnf1∆ sojevi sa različitim H2O2 koncentracije. (c) Hronološkianaliza životnog vijeka (CLS) divljeg tipa isnf1∆ sojeva. (d) ATP analiza divljeg tipa isnf1∆ sojevainkubirani s različitim koncentracijama FeSO4. (e) Analiza oksidativnog stresa divljeg tipa isnf1∆ sojevi inkubirani s različitim koncentracijama FeSO4. (f) CLS analiza divljeg tipa isnf1∆ sojevi inkubirani s različitim koncentracijama FeSO4. Statistički značaj (*p < 0.05) was determinedod Student'st-test.
Od kadasnf1mutant je defektan u mitohondrijskim funkcijama, testirali smo može li suplementacija željeza spasiti fenotipove ubrzanog starenja. Stoga smo dopunili gvožđesnf1mutanta i analizirao nivo ATP-a, oksidativni stres i životni vijek. Otkrili smo da suplementacija željezom povećava razinu ATP-a, otpornost na oksidativni stres i životni vijek (Slika5d–f). Sveukupno, ovi nalazi su potvrdili da suplementacija gvožđa odgađa starenje i produžava životni vijek ćelija povećanjem funkcija mitohondrija.
4. Diskusija
Nutrijenti određuju funkcionalni status ćelija, a nedostatak esencijalnih nutrijenata ugrožava ljudsko zdravlje [55,56]. Nadalje, hranjive tvari su glavni regulatori ćelijskog metabolizma koji kontrolira nekoliko bioloških procesa, uključujućistarenje, glavni faktor rizika od nekolikohronične bolesti. Pad umetabolička aktivnostje jedan od obeležjastarenje [10]. Nedavna istraživanja na različitim organizmima, uključujući sisare, pokazala su da je odlaganje starenja i povećanje zdravlja izvodljivo intervencijama protiv starenja uključujući primjenu lijekova rapamicina i metformina [11,16]. Ovi lijekovi ciljaju na komplekse TORC1 i AMPK koji osjete nutrijente koji su važni metabolički regulatori stanica [11,16].
Gvožđe je esencijalni nutrijent uključen u nekoliko ključnih metaboličkih reakcija u ćelijama [23–26]. Nedostatak gvožđa narušava metaboličku aktivnost što dovodi do ugroženih ćelijskih funkcija, što dovodi do mnogih bolesti, uključujući anemiju, kognitivno oštećenje i gubitakmišićna snaga [26,57–59]. Nedostatak gvožđa je široko rasprostranjen u starijoj populacijiVeće ili jednako65 godina [60–62].
Budući da željezo regulira metaboličke procese, istražili smo njegovu ulogu u starenju. Koristili smo kvasac kao model organizma da ispitamo ulogu željeza u hronološkom starenju. Istraživali smo efekat dodatka gvožđa na CLS kvasca. Otkrili smo da oba FeSO4 i FeCl3 produžava životni vijek ćelije. Koristeći različite soli sulfata, klorida i kelatora željeza, potvrdili smo da se željezo produžava životni vijek ćelije. Starenje je povezano s postupnim nakupljanjem oksidativnog stresa, koji je štetan za ćelijske funkcije i smanjuje opstanak stanica [34]. Pošto smo otkrili da suplementacija gvožđa odgađa starenje, testirali smo da li može da pruži otpornost na oksidativni stres. Da bismo ispitali fenotip oksidativnog stresa, tretirali smo stanice oksidativnim induktorom H.2O2 i mjerio preživljavanje ćelija. Otkrili smo da suplementacija gvožđa povećava otpornost na oksidativni stres u poređenju sa kontrolom. Ovi nalazi su u korelaciji sa ulogom suplementacije gvožđem u produžetku životnog veka.
Dalje smo razotkrili mehanizam suplementacije gvožđem protiv starenja. Mitohondrije su glavni stanični potrošači iskorišćavanja i metabolizma željeza [35–38]. Prvo smo analizirali ekspresiju gena mitohondrijalnog TCA ciklusa. Otkrili smo da je ekspresija gotovo svih gena TCA ciklusa povećana suplementacijom gvožđa. Važno je da je suplementacija gvožđa smanjila ekspresiju mitohondrijalne anapleroze i povećala kataplerotične metaboličke gene. Ovi rezultati otkrivaju da suplementacija gvožđa pojačava sintezu intermedijara TCA ciklusa i sprečava njihovu ćelijsku upotrebu. Ovi nalazi su podržali aktivnost suplementacije gvožđem protiv starenja, jer redovni izvoz intermedijara TCA ciklusa utiče na integritet mitohondrija [47]. Štaviše, popunjavanje mitohondrijalnog bazena ugljika je od suštinskog značaja za održavanje mitohondrijalnih funkcija potrebnih za preživljavanje tokom ćelijskog starenja.
Intermedijer TCA ciklusa - pokazalo se da ketoglutarat produžava životni vijek različitih organizama [63]. Međutim, otkrili smo da suplementacija željezom povećava ekspresiju -ketoglutarat dehidrogenaza (KGD1iKGD2) koji pretvara - ketoglutarat za formiranje sukcinil-CoA. Štaviše, uočili smo da ekspresija gena sukcinat dehidrogenaze (SDH1iSDH2) je bio visoko regulisan među ostalim testiranim genima TCA ciklusa. Važno je da sukcinat dehidrogenaza učestvuje i u TCA ciklusu i u ETC kompleksu II. Ovi rezultati sugeriraju da umjesto akumulacije određenog intermedijara TCA ciklusa, aktivnost protiv starenja dodatka gvožđa može uključiti ETC put.
Budući da je TCA ciklus funkcionalno povezan sa ETC, analizirali smo ekspresiju ETC gena. Otkrili smo da suplementacija gvožđem visoko regulira ekspresiju ETC gena. Proizvodi TCA ciklusa NADH i FADH2 se oksidiraju ETC kompleksima i stvaraju ATP kroz OXPHOS. Otkrili smo da suplementacija gvožđem povećava ćelijski nivo ATP-a, što je u korelaciji sa regulacijom TCA ciklusa i ETC gena. Zatim smo razjasnili da li je povećanje nivoa ATP-a suplementacijom gvožđa potrebno za produženje ćelijskog životnog veka. Otkrili smo da je produženje životnog vijeka suplementacijom željeza ukinuto inhibicijom sinteze ATP-a. Stoga, ovi nalazi sugeriraju da suplementacija gvožđem povećava nivo ATP-a koji je neophodan za produženje ćelijskog životnog veka. Naši rezultati su u skladu s prethodnim izvještajima koji pokazuju ulogu ATP-a u ćelijskom životnom vijeku [51,64,65]. Nadalje, koristili smo suplementaciju gvožđa za poboljšanje mitohondrijalnih funkcija i spasili kratak životni vijek i fenotip AMPK mutanta osjetljiv na oksidativni stres. Sveukupno, ovi rezultati su otkrili da suplementacija željezom pojačava mitohondrijalne funkcije koje odgađaju starenje i produžuju životni vijek stanica.
Nedavne studije su pokazale da suplementacija gvožđem obnavlja mitohondrijski defekt mutanata oštećenih lizozoma i sprečava pad mitohondrija tokom starenja [66,67]. Dakle, naši rezultati podržavaju prethodne nalaze da suplementacija željezom poboljšava mitohondrijalne funkcije. Zanimljivo je da je jedna od ranijih studija pokazala da suplementacija željezom spasila ubrzano replikacijsko starenje mutanata oštećenih lizozomima; međutim, theučinak na ćelije divljeg tipa nije uključen u izvještaj [67]. Ipak, naši rezultati su u korelaciji sa prethodnim nalazima, i uprkos različitim modelima starenja (hronološko starenje), otkrili smo da suplementacija gvožđem odlaže starenje i produžava životni vek ćelija. Stoga, zajedno, naši rezultati i prethodni izvještaji jasno sugeriraju da bi suplementacija gvožđem mogla biti potencijalno terapeutsko sredstvo za ciljanje starenja i produženje zdravlja.
Dodatni materijali:Slika S1: Analiza rasta i hronološkog životnog vijeka ćelija kvasca obogaćenih željezom; Slika S2: Analiza rasta različitih ćelija kvasca koje sadrže željezo, sulfat i hlorid; Slika S3: Analiza otpornosti na oksidativni stres ćelija kvasca obogaćenih gvožđem. Slika S4: Ekspresija mitohondrijalnog gena, membranski potencijal i analiza strukture ćelija kvasca obogaćenih gvožđem; Slika S5: Analiza rasta ćelija kvasca dodatog gvožđem i antimicinom A; Tabela S1: Lista prajmera korišćenih za RT-PCR u ovoj studiji.
Doprinosi autora:JLJ: Metodologija, formalna analiza, istraživanje i pregled; TCYN: Metodologija, formalna analiza, istraživanje i pregled; FN: Validacija, formalna analiza i pregled; FE: Pregled, uređivanje i nadzor; MA: Konceptualizacija, kuriranje podataka, metodologija, pisanje, recenziranje, uređivanje i nadzor. Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.
finansiranje:Ovaj rad su podržali Institut za bioinformatiku (BII), A*STAR fond za razvoj karijere (C210112008) i grant Global Healthy Longevity Catalyst Awards (MOH-000758-00).
Priznanja:Zahvaljujemo Maurer-Stroh Sebastianu, Lee Hwee Kuanu, Loo Lit Hsinu, Chiam Keng Hweeu i Prakash Arumugamu na podršci ovom istraživanju.
Sukobi interesa:Autori izjavljuju da nema suprotstavljenih finansijskih i nefinansijskih interesa.
Reference
1. Bloom, DE; Canning, D.; Lubet, A. Globalno starenje stanovništva: činjenice, izazovi, rješenja i perspektive.Chall. Solut. Perspect. Daedalus2015, 144, 80–92.
2. Odjel Ujedinjenih nacija za ekonomske i socijalne poslove, Odsjek za stanovništvo.Izgledi svjetske populacije za 2019; Najvažnije (ST/ESA/SERA/423); UN: Njujork, Njujork, SAD, 2019.
3. Robine, J.Starija populacija: Živimo duže, ali jesmo li zdraviji?Ujedinjene nacije, Odjel za ekonomiju i socijalna pitanja, Odsjek za stanovništvo: New York, NY, SAD, 2021; UN DESA/POP/2021/TP/BR.
4. Niccoli, T.; Partridge, L. Starenje kao faktor rizika za bolesti.Curr. Biol.2012, 22, R741–R752. [CrossRef] [PubMed]
5. Hou, Y.; Dan, X.; Babbar, M.; Wei, Y.; Hasselbalch, SG; Croteau, DL; Bohr, VA Starenje kao faktor rizika za neurodegenerativne bolesti.Nat. Rev. Neurol.2019, 15, 565–581. [CrossRef] [PubMed]
6. Harman, D. Proces starenja: glavni faktor rizika za bolest i smrt.Proc. Natl. Akad. Sci. SAD1991, 88, 5360–5363. [CrossRef] [PubMed]
7. Partridge, L.; Deelen, J.; Slagboom, PE Suočavanje sa globalnim izazovima starenja.Priroda2018, 561, 45–56. [CrossRef] [PubMed] 8. Fontana, L.; Kennedy,
BK; Longo, VD; Seals, D.; Melov, S. Medicinska istraživanja: Liječenje starenja.Priroda2014, 511, 405–407. [CrossRef] [PubMed]
9. Fontana, L.; Partridge, L.; Longo, VD Produženje zdravog životnog vijeka - od kvasca do ljudi.Nauka2010, 328, 321–326. [CrossRef] [PubMed]
10. López-Otín, C.; Blasco, MA; Partridge, L.; Serrano, M.; Kroemer, G. Obilježja starenja.Cell2013, 153, 1194–1217. [CrossRef]
11. Partridge, L.; Fuentealba, M.; Kennedy, BK Potraga za usporavanjem starenja kroz otkrivanje lijekova.Nat. Rev. Drug Discov.2020, 19, 513–532. [CrossRef]
12. Zimmermann, A.; Hofer, S.; Pendl, T.; Kainz, K.; Napravljeno od.; Carmona-Gutierrez, D. Kvasac kao alat za identifikaciju jedinjenja protiv starenja.FEMS Yeast Res.2018, 18, foy020. [CrossRef]
13. Kaeberlein, M.; Burtner, CR; Kennedy, BK Najnovija dostignuća u starenju kvasca.PLoS Genet.2007, 3, e84. [CrossRef]
14. Longo, VD; Shadel, GS; Kaeberlein, M.; Kennedy, B. Replikativno i hronološko starenje uSaccharomyces cerevisiae. Cell Metab.2012, 16, 18–31. [CrossRef] 15. Longo, VD; Fabrizio, P. Kronološko starenje u Saccharomyces cerevisiae.Aging Res. Kvasac2011, 57, 101–121. [CrossRef]
16. Kulkarni, AS; Gubbi, S.; Barzilai, N. Prednosti metformina u ublažavanju znakova starenja.Cell Metab.2020, 32, 15–30. [CrossRef]
17. Alfatah, M.; Wong, JH; Krishnan, VG; Lee, YC; Sin, QF; Goh, CJH; Kong, KW; Lee, WT; Lewis, J.; Hoon, S.; et al. TORC1 reguliše transkripcijski odgovor na glukozu i razvojni ciklus putem Tap42-Sit4-Rrd1/2 puta u Saccharomyces cerevisiae.BMC Biol.2021, 19, 1–22. [CrossRef]
18. Saxton, RA; Sabatini, DM mTOR signalizacija u rastu, metabolizmu i bolesti.Cell2017, 168, 960–976. [CrossRef]
