BCAT2 oblikuje mikrookruženje neupaljenog tumora i izaziva otpornost na anti-PD-1/PD-L1 imunoterapiju negativno regulišući proinflamatorne hemokine i imunitet protiv raka
Oct 25, 2023
Da bi se poboljšala stopa odgovora monoterapije blokade imunoloških kontrolnih tačaka (ICB), potrebno je pronaći novi cilj u kombinovanoj terapiji. Analizom indikatora koji se odnose na tumorsko mikrookruženje (TME), potvrđeno je da BCAT2 oblikuje neupaljeni TME kod raka mokraćne bešike. Rezultati multiomike pokazuju da BCAT2 ima inhibitorni učinak na regrutaciju citotoksičnih limfocita ograničavanjem aktivnosti proinflamatornih puteva povezanih s citokinom/kemokinima i puta T-ćelija-kemotakse. Imunološki testovi otkrivaju da lučenje hemokina povezanih sa CD8+T-ćelijama održava snažnu negativnu korelaciju sa BCAT2, stvarajući tendenciju smanjenja CD8+T ćelija oko BCAT{11}} tumorskih ćelija od daleko do blizu. Tretman nedostatka BCAT2 i anti-PD-1 antitijela ima sinergistički efekat in vivo, što implicira potencijal BCAT2 u kombinovanoj terapiji. Štaviše, vrijednost BCAT2 u predviđanju efikasnosti imunoterapije potvrđena je u više imunoterapijskih kohorti. Zajedno, kao ključni molekul u TME, BCAT2 je nova meta u kombinaciji sa ICB-om i biomarkerom precizne terapije.
Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor
1. Uvod
Rak mokraćne bešike (BLCA) je jedan od najčešćih malignih oboljenja urinarnog sistema.[1] Procjenjuje se da se svake godine širom svijeta dijagnosticira preko 430,000 pacijenata.[2] Uprkos radikalnom hirurškom liječenju, gotovo polovina pacijenata sa mišićno invazivnim karcinomom mokraćne bešike javlja se metastazama.[3] Stoga sistemska terapija igra važnu ulogu u uznapredovalom karcinomu mokraćne bešike. Sa razvojem imunoterapije, posebno blokade imunološke kontrolne tačke (ICB), akumulirani dokazi su pokazali da ICB ima odlične performanse u eliminaciji tumorskog opterećenja.[4] Međutim, još uvijek postoji veliki broj pacijenata koji ne reagiraju na monoterapiju ICB-a zbog primarne rezistencije ili stečene rezistencije.[5] Za rješavanje nezadovoljene kliničke potrebe, kombinacija drugih racionalnih terapija s ICB-om pruža potpuno novi uvid u otpornost na monoterapiju. Mikrookruženje tumora (TME) je komplikovan sistem i ima dubok uticaj na efikasnost imunoterapije.[6] Sa nedovoljnim nivoom infiltracije citotoksičnih T limfocita (CTL), neupalni TME se smatra kritičnim faktorom u neuspjehu stvaranja snažnog antitumorskog imunološkog odgovora tokom imunoterapije.[7] Stoga je od vitalnog značaja pronaći ključnu molekulu koja može preoblikovati neupaljeni TME u upaljeni TME i koji ima potencijal da bude meta kombinovane terapije. Razgranati lanac aminotransferaze 2 (BCAT2) je ključni enzim u procesu metabolizma sumpornih aminokiselina.[8] Li et al. otkrili su da je BCAT2 neophodan za razvoj raka gušterače posredovanjem u katabolizmu aminokiselina razgranatog lanca (BCAA). Lee et al. pokazalo je da nedostatak BCAT2 inhibira rast tumora duktalnog adenokarcinoma pankreasa (PDAC) regulacijom metabolizma lipida.[10] Iako je bilo nekoliko istraživanja dokumentovanih da BCAT2 direktno utiče na biološki proces tumora regulacijom metaboličkih puteva, njegova uloga u regulaciji imunološkog statusa TME nikada nije istražena. U našoj studiji, kroz sveobuhvatnu analizu indikatora povezanih s TME u Xiangya BLCA kohorti i više javnih BLCA kohorti, pregledali smo da BCAT2 vjerovatno oblikuje imunosupresivni TME u BLCA. Za istraživanje molekularnih mehanizama, dalje smo izveli jednoćelijsko RNA sekvenciranje (siRNA seq) i bulk-RNA seq, otkrivajući da BCAT2 igra represivnu ulogu u regrutovanju CTL-a u TME, inhibirajući aktivnosti signalnih puteva povezanih s citokinom/kemokinima i Signalni putevi Tćelijske hemotakse. In vitro, multiimuno testovi su pokazali da lučenje hemokina povezanih sa CTL ima stabilne negativne korelacije sa ekspresijom BCAT2. Prema panoramskoj analizi mikromreža tkiva (TMA), pronašli smo međusobno isključivu vezu između CTL i BCAT2+ tumorskih ćelija u prostornoj distribuciji. In vivo, kooperativni efekat je otkriven u kombinovanoj terapiji gubitka BCAT2 i ICB. Što je još važnije, njegova uloga u predviđanju kurativnog efekta imunoterapije potvrđena je u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
2. Rezultati
2.1. BCAT2 negativno korelira sa antikancerogenim imunitetom TME u BLCA
U većini tipova karcinoma, ekspresija BCAT2 je veća u tkivima raka nego u normalnim tkivima (slika S1A, prateće informacije) i njegov obrazac ekspresije u BLCA potvrđen je u Xiangya BLCA kohorti (slika S1B, prateće informacije). Osim toga, BCAT2 je široko eksprimiran u različitim ćelijskim linijama raka (slika S1C, prateće informacije). Nadalje, rezultati sveobuhvatne analize pan-kancera na hemokinskom sistemu, MHC, imunostimulatorima i TIIC-ima pokazali su da BCAT2 ima značajne imunosupresivne efekte na nekoliko tipova raka, uključujući rak mokraćne bešike (BLCA), rak dojke (BRCA), bubrežne papilarne ćelije karcinom (KIRP), adenokarcinom pankreasa (PAAD), sarkom (SARC) i karcinom štitnjače (THCA) (slika S2A, B, prateće informacije). Osim toga, pronađene su negativne korelacije između BCAT2 i uobičajenih inhibicijskih imunoloških kontrolnih tačaka (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 i LAG-3) (slika S2C–F, prateće informacije ). Kroz sveobuhvatnu analizu pan-karcinoma, otkrili smo da BCAT2 ima najdublji imunosupresivni efekat u BLCA. Stoga smo dalje istražili njegovu imunološku ulogu u BLCA. Na osnovu vrijednosti medijane ekspresije BCAT2, podijelili smo pojedince u grupu s visokim BCAT2 i grupu sa niskim BCAT2 u TCGA-BLCA kohorti. Očigledno je da je niz hemokina, hemokinskih receptora, molekula povezanih s MHC-om i imunostimulatora smanjeno izraženo u grupi sa visokim BCAT2 i prekomjerno izraženo u grupi sa niskim BCAT2 (Slika 1A). Sličan ishod je pronađen u ciklusu imuniteta protiv raka, koji pokriva višestruke bitne korake u regrutovanju i infiltraciji imunoloških ćelija (slika 1B). Štaviše, pokazali smo snažne negativne veze između nivoa infiltracije imunih ćelija (CD8+T ćelije, CD4+T ćelije, ćelije ubice prirode (NK) i dendritske (DC) ćelije) i BCAT2 u različitim algoritmi (slika 1C). Isto tako, niža ekspresija efektorskih gena imunih ćelija (CD8+T ćelija, NK ćelija, makrofag, T pomoćna 1 (Th1) ćelija i DC ćelija) pronađena je u grupi sa visokim BCAT2 u poređenju sa niskim BCAT2 grupa (slika 1D). Što je još važnije, kada se korelira BCAT2 sa TIS skorom (slika S3, prateće informacije) i kontrolnim tačkama inhibicije imuniteta (slika 1E), otkrivene su očigledne negativne veze između njih. Stoga smo spekulisali da BCAT2 može negativno regulisati imunološki odgovor TME i duboko uticati na efikasnost imunoterapije. Nadalje, gore navedeni rezultati su dobro potvrđeni u devet nezavisnih BLCA kohorti (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 i GSE128704, i GSE128702 podrška, informacija). Konačno smo ponovo potvrdili povezanost između BCAT2 i TME u Xiangya BLCA kohorti. Dosljedno, ekspresija BCAT2 ima negativnu vezu s aktivnošću ciklusa imuniteta protiv raka, nivoima infiltracije TIIC-a, TIS skorom i nivoima ekspresije imunoloških kontrolnih tačaka (Slika 2A-C). Zajedno smo otkrili da visoka ekspresija BCAT2 formira neupaljeni TME u BLCA, a niska ekspresija BCAT2 oblikuje upaljeni TME u BLCA.
2.2. Istraživanje mehanizma BCAT2 u oblikovanju TME pomoću Bulk RNA-seq i siRNA-seq
U kohorti TCGA-BLCA, identifikovani su DEG između grupa sa visokim/niskim BCAT2, grupa sa visokim/niskim imunološkim rezultatom i grupa sa visokim/niskim stromalnim rezultatom (Slika S13A, prateće informacije). Zanimljivo je da BCAT2 pozitivno povezani DEG-ovi nisu imali ukrštanje sa DEG-ovima koji su pozitivno povezani sa imunološkim i stromalnim rezultatom (Slika 2D). U međuvremenu, isti fenomen se desio u negativno povezanim EG-ovima među njima (Slika S13B, prateće informacije). Ovi nalazi su pokazali da BCAT2 vjerovatno negativno reguliše puteve vezane za imunitet. Slučajno, rezultati GO i KEGG analiza su otkrili da su BCAT2-povezani DEG-ovi najznačajnije obogaćeni putevima migracije leukocita, aktivacije T ćelija i interakcije citokin-citokin receptor (Slika 2E, F). Stoga smo spekulisali da BCAT2 oblikuje neupaljeni TME u BLCA inhibirajući aktivnosti puteva povezanih s citokinom/hemokinima. Međutim, karakteristika masovnog NA sekvenciranja određuje njegovo ograničenje, čiji se nivo ekspresije gena izračunava srednjom vrednošću svih ćelija u tkivu. Da bi se prevazišlo ograničenje, siRNA je izvedena na tri BLCA uzorka. Više od 19 000 ćelija je analizirano i klasifikovano u šest kategorija: epitelne ćelije, ćelije fibroblasta, T/NK ćelije, endotelne ćelije, B ćelije i mijeloične ćelije (slika 3A), odnose se na priznate biomarkere (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 i VWF).[11] Zapanjujuće, BCAT2 je uglavnom bio eksprimiran u epitelnim ćelijama (EPCAM+), a ne u endotelnim ćelijama i imunim ćelijama. Na osnovu akumulacije CNV, EPCAM+ epitelne ćelije su smatrane malignim urotelnim ćelijama. Da bi se potvrdio obrazac ekspresije BCAT2, dvije eksterne kohorte siRNA bile su uključene u studiju. U kohorti scRNA GSE135337, više od 36,000 ćelija je obrađeno i podijeljeno u pet klastera. Primarno eksprimirani ćelijski podtip BCAT2 je još uvijek bila maligna urotelna ćelija mokraćne bešike (Slika 3B). Sličan obrazac ekspresije ponovo se pojavio u kohorti siRNA GSE145137 (slika 3C). Stoga je uzorak većinske ekspresije na malignim ćelijama zaključio da BCAT2 djeluje kao imunoregulatorni dio u TME uglavnom pomoću različitih karakteristika ćelija raka. Na osnovu nivoa ekspresije BCAT2, maligne urotelne ćelije su podeljene u grupu sa visokim nivoom BCAT2 i grupu sa niskim nivoom BCAT2. GSEA analiza GO termina u siRNA kohorti GSE135337 i GSE145137 otkrila je da je gomila puteva povezanih s citokinom/kemokinima značajno smanjena u grupi s visokim BCAT2, uključujući proizvodnju hemokina, sekreciju hemokina, regulaciju odgovora hemokina na signalni put posredovanog hemokina, vezivanje hemokinskih receptora, aktivnost citokina, vezivanje citokina i vezivanje receptora citokina (slika 3D–G; slika S14B, prateće informacije). U međuvremenu, hemotaksa leukocita, hemotaksa limfocita, hemotaksa T ćelija i njihovi regulatorni putevi imali su značajno negativnu korelaciju sa BCAT2 (Slika 3E–I; Slika S14A, prateće informacije). GSEA analiza KEGG pojmova je pokazala da su putevi interakcije citokin-citokin receptor i procesiranje i prezentacija antigena očigledno smanjeni u grupi sa visokim BCAT2 (Slika 3F). Zajedno, visoka ekspresija BCAT2 potiskuje aktivnosti proinflamatornih citokina i puteva povezanih s hemokinima, što dovodi do smanjenog nivoa infiltracije TIIC-a, što u konačnici oblikuje neinflamatorni TME.
Slika 1. BCAT2 negativno korelira sa imunitetom protiv raka u TME BLCA. A) Obrazac ekspresije hemokina, hemokinskih receptora, MHC molekula i imunostimulatora u grupama sa visokim i niskim BCAT2. B) Aktivnost ciklusa imuniteta na rak u grupama sa visokim i niskim BCAT2. Sedam boja predstavlja sedam koraka u ciklusu. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0,001. C) Korelacije između BCAT2 i više vrsta imunih ćelija (CD8+T ćelija, CD4+T ćelija, DC ćelija i NK ćelija) u šest nezavisnih algoritama. D) Obrasci ekspresije višestrukih podtipova imunih ćelija (CD8+T ćelije, NK ćelije, makrofagi, Th1 ćelije i DC ćelije) povezani efektorskim genima u grupama sa visokim i niskim BCAT2. E) Korelacije između efektorskih gena povezanih s BCAT2 i ICB. Broj u krugu označava koeficijent korelacije.
Slika 2. Validacija funkcije BCAT2 od strane Xiangya BLCA kohorte. A) Korelacije između BCAT2/ciklusa imuniteta protiv raka (lijevo) i BCAT2/TIIC (desno). Pune i isprekidane linije označavaju pozitivne i negativne odnose, debljine linija označavaju koeficijent korelacije, linije različitih boja predstavljaju p-vrijednost korelacija. B) Korelacije između efektorskih gena povezanih s BCAT2 i ICB. C) Korelacije između efektorskih gena povezanih s BCAT2 i TIS rezultatom. Broj u krugu predstavlja koeficijent korelacije. D) Presjek BCAT2, imuni rezultat i stromalni rezultat pozitivnih gena. E,F) Top 20 signalnih puteva obogaćivanja GO i KEGG analiza u BCAT{10}}srodnim genima.
Slika 3. Istraživanje mehanizma BCAT2 u oblikovanju TME pomoću bulk RNA-seq i scRNA-seq. A, B) tSNE dijagrami jednoćelijskog obrasca ekspresije BCAT2 u Xiangya siRNA kohorti i GSE135337 kohorti. C) Violin dijagram obrasca ekspresije jedne ćelije BCAT2 u kohorti GSE145137. D, E) GSEA analiza GO termina ukazuje na aktivnosti puteva vezanih za citokine/hemokine i puteva povezanih s hemotaksom imunoloških ćelija između različitih BCAT2 grupa u GSE135337 kohorti. F) GSEA analiza KEGG termina ukazuje na aktivnosti prezentacije antigena i interakciju puta citokina i receptora citokina između različitih BCAT2 grupa u GSE145137 kohorti. G–I) GSEA analiza GO termina ukazuje na aktivnosti puteva vezanih za citokine/hemokine, puteva povezanih s hemotaksom imunoloških ćelija i puteva povezanih s migracijom imunoloških ćelija između različitih BCAT2 grupa u GSE145137 kohorti. J, K) GO i KEGG analiza DEG između BCAT2 OE i BCAT2 KD ćelijskih linija.
2.3. BCAT2 varira obrasce ekspresije hemokina povezanih s CD8+T-ćelijama i inhibira citotoksični kapacitet CTL-a
Da bi se potvrdili gore navedeni putevi obogaćivanja, BCAT2 prekomjerna ekspresija (BCAT2 OE) i BCAT2 knockdown (BCAT2 KD) ljudske (T24)/mišje (MB49) ćelijske linije raka mokraćne bešike su uspješno konstruirane (slika S15A-D, prateće informacije) i testirane su sa visokopropusno RNA sekvenciranje. Očekivano, GO analiza T24 ćelijskih linija otkrila je da su DEG značajno obogaćeni putevima signalizacije posredovane hemokinima, odgovorom na hemokine, migracijom leukocita i migracijom leukocita (slika 3J). Analiza KEGG puta T24 ćelijskih linija pokazala je da su signalni put hemokina, put interakcije citokin-citokin receptora i put raka mokraćne bešike značajno obogaćeni (slika 3K). Slično, nekoliko kritičnih puteva vezanih za citokine/hemokine pronađeno je u GO i KEGG analizama MB49 ćelijskih linija (slika S16A, B, prateće informacije). Očigledno je da različiti citokini i hemokini igraju ključnu ulogu u regulaciji TME. Stoga je potrebno izvršiti skrining citokina/hemokina koji su specifično regulirani BCAT2. Stoga su ProcartaPlex višestruki imunološki testovi primijenjeni za identifikaciju varijacija sekrecije citokina/hemokina u ćelijskim linijama raka mokraćne bešike ljudi i miša. Iznenađujuće, nivoi sekrecije CCL3, CCL4, CCL5 i CXCL10 su povećani u ljudskim i mišjim BCAT2-KD ćelijskim linijama i smanjeni u ljudskim i mišjim BCAT2-OE ćelijskim linijama (Slika 4A, B; Slika S16C , D, Popratne informacije). U prethodnim studijama, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10 su smatrani ključnim hemokinima za regrutovanje CD8+T ćelija u TME.[12] Shodno tome, za bolju sveobuhvatnu analizu hemokina vezanih za CD8+T-ćelije, svi su uključeni za dalju validaciju. Zapanjujuće je da su nivoi ekspresije RNK CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10 značajno smanjeni u BCAT2 OE ćelijama i značajno povećani u BCAT2 KD ćelijama (slika 4C). Slično, rezultati ELISA-e su pokazali da nivoi izlučenog proteina takođe imaju negativnu korelaciju sa ekspresijom BCAT2 (Slika 4D). Ovi nalazi su pokazali da prekomjerna ekspresija BCAT2 inhibira nivoe transkriptoma i proteina hemokina povezanih s CD8+T-ćelijama, uključujući CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10. Što je još važnije, test hemotakse je otkrio da BCAT2 OE ćelijska linija značajno inhibira sposobnost hemotakse CD8+T ćelija (Slika 4E, lijevo). Suprotno tome, ćelijski supernatanti ćelijske linije BCAT2 KD su bili sposobni privući više CD8+T ćelija nego njihova negativna kontrola (slika 4E, desno). Ovi nalazi su pokazali da BCAT2 može uticati na kapacitet hemotakse CD8+T ćelija regulacijom nivoa mRNA i proteina srodnih hemokina. Nadalje, test ubijanja stanica raka posredovan T-ćelijama korišten je za istraživanje varijacija citotoksičnosti T-ćelija nakon direktnog kontakta sa tumorskim stanicama koje eksprimiraju različit nivo BCAT2. Kao što je prikazano na slici 4F i slici S17A, B (Informacije za podršku), prekomjerna ekspresija BCAT2 na tumorskim ćelijama direktno je potisnula citotoksičnu funkciju T ćelija, a srušenje BCAT2 na tumorskim ćelijama značajno je preokrenulo tendenciju. Analiza sakupljenih T ćelija protočnom citometrijom pokazala je da su proporcije CD8+TNF-𝛼+ T ćelija i CD8+IFN-𝛾+ T ćelija imale značajne razlike u različitim sistemima kokulture, što je značilo ogromnu promjenu u aktivnost CD8+T ćelija (slika 4G; slika S17C, D, prateće informacije). Zajedno, BCAT2 je sposoban da inhibira sposobnost regrutacije CD8+T ćelija regulacijom nivoa povezanih hemokina, kao i supresijom aktivnosti CTL-a direktnim kontaktom. Dodatno, rezultat testa ubijanja ćelija raka posredovanog T-ćelijama (bez grupe T ćelija) može zaključiti da BCAT2 igra onkogenu ulogu u raku mokraćne bešike. Stoga su za validaciju ove hipoteze korišteni test kolonije na ploči i test migracije/invazije u bušotinu. Kao što se očekivalo, prekomjerna ekspresija BCAT2 značajno je povećala sposobnost proliferacije, migracije i invazije tumorskih ćelija, a nokdaun BCAT2 je značajno potisnuo ova ponašanja (Slika S18A-F, prateće informacije).
2.4. Validacija ekskluzivnog prostornog odnosa između BCAT2+ tumorske ćelije i CD8+T ćelije od strane TMA iz Xiangya BLCA kohorte
Prema rezultatima masovnih RNA-seq, scRNA-seq i vitro eksperimenata, pokazali smo da BCAT2 igra imunosupresivnu ulogu u BLCA tako što potiskuje regrutaciju i citotoksičnost CD8+T ćelija. Međutim, interakcija BCAT2+ tumorskih ćelija i CD8+T ćelija je još uvijek nepoznata na nivou ljudskog tkiva. U Xiangya BLCA kohorti, reprezentativne slike i ukupni rezultat IHC-a otkrili su negativnu korelaciju između BCAT2 i CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Slika 5A, B). Višebojno IF bojenje BCAT2+ tumorskih ćelija (BCAT2+CK19+) i BCAT{{17}CD8+T ćelija je provedeno u TMA i poluautomatski analizirano pomoću TissueFAXS platforma za panoramsku kvantifikaciju. Kao što je prikazano na slici 5C, opseg ekspresije BCAT2 i CK19 se u velikoj meri preklapao. Suprotno tome, opseg ekspresije BCAT2 i CD8 bio je različit i odvojen. Detaljne proporcije koekspresije BCAT2+CK19+ ćelija i BCAT2+CD8+T ćelija bile su 87,29% i 5,09% (Slika 5D, E), što je bilo u skladu sa obrazac ekspresije BCAT2 u scRNA-sekv. U ukupnom TMA, i dalje je postojala značajna razlika u proporciji koekspresije između njih (slika S19A, prateće informacije). Što je još važnije, u multidimenzionalnoj analizi gradijenta udaljenosti (0–25, 25–50, 50–100 i 100–150 μm) oko BCAT2+ tumorskih ćelija, broj CD8+T ćelija se postepeno povećavao od blizu do daleko (slika 5F; slika S19B, prateće informacije). Zajedno smo pokazali da je na nivou ljudskog tkiva BCAT2 također uglavnom eksprimiran u tumorskim ćelijama, a BCAT2+ tumorska ćelija ima isključivi prostorni odnos sa CD{50}}T ćelijom.
Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor
2.5. Gubitak BCAT2 povećava efikasnost anti-PD-1 terapije
Sa izraženim negativnim uticajem na TME i negativnom bliskom korelacijom sa blokadom inhibitorne kontrolne tačke, izaziva veliko interesovanje za istraživanje sinergističkog efekta gubitka BCAT2 i tretmana protiv PD- 1. Uoči imunoterapije, model potkožnog karcinoma mokraćne bešike napravljen je od strane BCAT2 KD i kontrolnih linija mišjih ćelija. Zatim su anti-PD-1 terapija i kontrolna terapija primijenjene na miševe koji nose tumor (slika 6A). U skladu sa svojom onkogenom ulogom i mehanizmom regulacije hemokina in vitro, nedostatak BCAT2 inhibirao je rast tumora i produženo vrijeme preživljavanja in vivo, povećavajući regulaciju hemokina povezanih s CD8+T (slika 6B-E; slika S20A, prateće informacije). Sa aspekta efikasnosti imunoterapije, iako bi monoterapija anti-PD-1 mogla djelomično smanjiti opterećenje tumorom, zajednički tretman BCAT2 KD i anti-PD{16}} monoklonskim antitijelom (mab) je pokazao bolji efekat supresije tumora i dobio više beneficija za preživljavanje. Na zakazani dan, tumori su sakupljeni i pripremljeni za dalju analizu. Jedan dio ih je digestiran u jednoćelijsku suspenziju i urađena je protočna citometrijska analiza. Sa sličnom populacijom leukocita i T ćelija (slika S20B-E, prateće informacije) u tumoru, veći je udio CD8+T ćelija prikazan u grupi sa nedostatkom BCAT2 nego u grupi sa negativnom kontrolom. Slično, grupa na kombinovanoj terapiji imala je masovniju infiltraciju CTL-a od grupe koja je primala monoterapiju (Slika 6F-H). Što je još važnije, indikatori citotoksičnosti (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 i Perforin) CTL-a su također bili pojačani u tumorima miša sa gubitkom BCAT2 i kombinovanim tretmanom u poređenju sa odgovarajućom kontrolom (Slika 6G, I-L). Ostali delovi tumora su napravljeni u zamrznute delove i sprovedeno IF bojenje. Kao što se i očekivalo, gustina CD8+T ćelija u regiji od interesa (ROI) pokazala je istu tendenciju sa analizom protočne citometrije (slika 6M, N). Ovi nalazi su pokazali da nedostatak BCAT2 na tumorskim ćelijama može oblikovati upaljenu TME i imati veliku efikasnost u liječenju imunoterapije. Da bi se shvatila uloga CD8+T ćelija u sinergističkom efektu tretmana, CD8𝛼 mab je primijenjen da ih antagonizira kod imunološki kompetentnih miševa (slika S21A, prateće informacije) i potvrdio njegov efekat iscrpljivanja pomoću protočne citometrije i IF (Slika S21B, C, prateće informacije). Očigledno, nakon iscrpljivanja, opterećenje tumorom i vrijeme preživljavanja su značajno obrnuti (slika S21D-G, prateće informacije). Ovi nalazi su pokazali da CD8+T ćelije igraju nezamjenjivu ulogu u sinergističkom efektu kombinovane terapije.
Slika 4. BCAT2 varira obrasce ekspresije hemokina povezanih s CD8+T-ćelijama i inhibira citotoksični kapacitet CTL-a. A,B) Toplotne mape ProcartaPlex višestrukih imunotestova prikazuju varijacije sekrecije uobičajenih citokina i hemokina u BCAT2 OE, BCAT2 KD i negativnim kontrolnim grupama (n=3 po grupi). C,D) Histogrami pokazuju normalizirane nivoe ekspresije mRNA i koncentracije proteina sekrecije CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10 u BCAT2 OE (lijevo), BCAT2 KD (desno) i negativnim kontrolnim grupama (n {{ 15}} po grupi). *p < 0.{{20}}5; **p < 0.01; ***p < 0,001. E) Test hemotakse ukazuje na različite sposobnosti hemotakse CTL-a u BCAT2 OE, BCAT2 KD i negativnim kontrolnim grupama (n=3 po grupi). *p < 0,05; **p < 0,01. F) Test ubijanja ćelija raka posredovan T-ćelijama ukazuje na različite sposobnosti ubijanja T ćelija koje su kultivisane sa BCAT2 OE, BCAT2 KD i negativnim kontrolnim ćelijskim linijama (n=3 po grupi). G) Analiza protočne citometrije ukazuje na različite aktivnosti CD8+T ćelija u različitim grupama kokulture (n=3 po grupi).
Slika 5. Validacija ekskluzivnih prostornih odnosa BCAT2+ tumorskih ćelija i CD8+T ćelija pomoću TMA Xiangya BLCA kohorte. A) IHC slika BCAT2 i CD8 kod upaljenih i neupaljenih tipova TME. Skalirana traka: 50 μm. B) Korelacija između BCAT2 i CD8 na osnovu njihovih IHC rezultata u ukupnom TMA. C) Višebojna IF slika BCAT2, CK19, CD8 i kombinovani indeks kod upaljenih i neupalnih tipova TME. BCAT2+ ćelija (ružičasta), CK19+ ćelija (cijan), CD8+T ćelija (narandžasta) i jezgro ćelije (plavo). Skala bar: 50 μm. D,E) Detaljne stope koekspresije BCAT2+CK19+ i BCAT2+CD8+ ćelija u tipičnom uzorku. F) Analiza gradijenta udaljenosti (0–25, 25–50, 50–100 i 100–150 μm) CD8+T ćelija oko BCAT2+CK19+ ćelija u tipičnim uzorak.
Slika 6. Gubitak BCAT2 povećava efikasnost anti-PD-1 terapije. A) Dijagram toka plana tretmana. B) Sakupljeni tumori različitih režima terapije (n=5 po grupi). C–E) Kvantifikacija zapremine tumora, tjelesne težine i vremena preživljavanja u različitim režimima terapije (n=5 po grupi). ns: nema značaja; *str< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
Nadalje, pored tumorskih ćelija, mali dio BCAT2 je također eksprimiran u CD8+T ćelijama. Stoga smo dalje istražili da li različiti nivoi ekspresije BCAT2 na CD8+T ćelijama mogu uticati na njihove aktivnosti. Nakon bojenja jednoćelijske suspenzije mišje slezene sa BCAT2 i fluorescentnim antitijelima vezanim za T ćelije, uporedili smo proporcije CD8+ TNF-𝛼+T i CD8+ IFN-𝛾+T ćelija između BCAT 2+CD8+ i BCAT2−CD8+ grupe. Zanimljivo je da smo otkrili da su proporcije bile slične između dvije grupe, otkrivajući da je aktivnost CD8+T ćelije nezavisna od njenog nivoa ekspresije BCAT2 (slika S22A-C, prateće informacije).
2.6. BCAT2 predviđa odgovor na imunoterapiju u nekoliko kohorti imunoterapije u stvarnom svijetu
Gore navedeni nalazi su pokazali imunosupresivnu ulogu BCAT2 u TME i sinergijski efekat kombinovanja gubitka BCAT2 sa anti-PD-1 terapijom. Međutim, njegov prediktivni potencijal za efikasnost imunoterapije nije jasan. Stoga, u kohorti TCGA-BLCA, rezultati obogaćivanja puteva povezanih s imunoterapijom su upoređeni između grupa s visokim i niskim BCAT2. Kao što je prikazano na slici S23A (Informacije za podršku), grupa sa niskim BCAT2 imala je aktivnije gene u putevima povezanim s imunoterapijom, što može zaključiti da niska ekspresija BCAT2 predstavlja osjetljivije stanje na imunoterapiju. Za dalju validaciju, 58 pacijenata sa mišićno-invazivnim karcinomom mokraćne bešike (MIBC) koji su prihvatili neoadjuvantnu anti-PD-1 terapiju u našoj bolnici uključeno je u Xiangya BLCA imunoterapijsku kohortu. Reprezentativne IHC, IF i CT slike ispitanika koji su odgovorili i koji nisu odgovorili su implicirali da nivo ekspresije BCAT2 ima blisku vezu sa efikasnošću imunoterapije – veća je verovatnoća da će pojedinac sa niskim nivoom ekspresije BCAT2 reagovati na imunoterapiju nego pojedinac sa visok nivo ekspresije BCAT2 (Slika 7A-C). Štaviše, IHC rezultat kohorte imunoterapije Xiangya BLCA i matrice ekspresije mRNA IMvigor210 kohorte ukazuju na snažnu negativnu korelaciju između BCAT2 i PD-L1 (R=-{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0.41, p < 0.001) (slika S23B, C, prateće informacije). Stoga smo direktno uporedili efikasnost imunoterapije između grupa sa visokim i niskim BCAT2 u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA i otkrili da grupa sa niskim BCAT2 ima značajno veći udio odgovora od grupe sa visokim BCAT2 (p=0.001) (Slika 7D). Štaviše, procijenili smo prediktivne vrijednosti BCAT2, PD-L1 i kombinovanog indeksa (BCAT2+PD-L1) na patološki odgovor na imunoterapiju i otkrili odlične performanse kombinovanog indeksa (BCAT2+PD- L1) o tačnosti predviđanja (Slika 7E). Inspirativno, u aspektu ishoda preživljavanja, grupa sa niskim BCAT2 imala je duže preživljavanje bez bolesti (DFS) od grupe sa visokim BCAT2 (p=0.032) (Slika 7F), pokazujući prognostičku vrijednost BCAT2 u BLCA imunoterapija. U kliničkom smislu, vjerojatnije je da će osobe s pustinjskim TME imati ograničenu efikasnost imunoterapije nego osobe s upaljenom TME, što dodatno naglašava važnost indikatora predviđanja. Shodno tome, odabrali smo sve osobe sa pustinjskim TME u IMvigor210 kohortu i izvršili sveobuhvatnu procjenu. U direktnom poređenju nivoa ekspresije BCAT2 među različitim odgovornim grupama, CR grupa (odgovarajući) imala je značajno niži nivo ekspresije BCAT2 od SD i PD grupa (neodgovarajući) (slika 7G). Što je još važnije, kombinovani indeks (BCAT2+PD-L1) je također imao sjajne performanse u pogledu tačnosti predviđanja (slika 7H). Iako nije bilo značajne razlike u ukupnom preživljavanju (OS) između grupa sa visokim i niskim BCAT2 u pustinjskom tipu IMvigor210 kohorte, tendencija prognoze je i dalje bila slična ishodu Xiangya BLCA imunoterapijske grupe (slika 7I). Osim PD-L1, mikrosatelitska nestabilnost (MSI) je drugi suštinski prediktor efikasnosti imunoterapije. Status popravke neusklađenosti (MMR)—iskusan MMR (pMMR) i deficitarni MMR (dMMR) održavaju visoku usklađenost sa niskofrekventnim MSI (MSI-L) i visokofrekventnim MSI (MSI-H).[13] Stoga smo sproveli sveobuhvatnu evaluaciju svih pojedinaca u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA na osnovu rezultata bojenja četiri gena markera MMR (MLH1, MSH2, MSH6 i PMS2). Ishod je otkrio značajno veći udio dMMR (MSI-H) u grupi sa niskim BCAT2 u poređenju sa grupom sa visokim BCAT2 (p=0.02) (Slika S23D, E, prateće informacije). Osim toga, procijenili smo prediktivne vrijednosti MMR, BCAT2 i kombiniranog indeksa (MMR+BCAT2) o efikasnosti imunoterapije i otkrili da kombinirani indeks (MMR+BCAT2) ima prihvatljiv učinak u pogledu tačnosti predviđanja (Slika S23F, prateće informacije). Zajedno, ovi nalazi su pokazali da je BCAT2 kvalifikovan da djeluje kao komplementarni prediktor efikasnosti BLCA imunoterapije. Konačno, prediktivna vrijednost BCAT2 kao odgovor na imunoterapiju istražena je kod različitih tipova raka. Otkrili smo da su osobe sa visokom ekspresijom BCAT2 pokazale značajno lošiju stopu odgovora (p=0.04) u kohorti GSE35640 (melanom) (Slika 7J). Iako nije bilo značajnih razlika u stopi odgovora između grupa sa visokim i niskim BCAT2 u GSE173839 (rak dojke), GSE135222 (NSCLC) i Gide 2019 kohorti (melanom), pacijenti sa niskom ekspresijom BCAT2 i dalje su imali veću vjerovatnoću da će imati pozitivan odgovor. na imunoterapiju (Slika 7K–M).
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity
【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.7. Vrijednost BCAT2 u predviđanju molekularnog podtipa i vođenju precizne terapije
Uz veliku heterogenost koja postoji u tradicionalnoj histološkoj klasifikaciji, sve više dokaza je pokazalo da je molekularni podtip u stanju da pruži precizniju klasifikaciju na osnovu profila transkriptoma u BLCA.[14] Nadalje, sa sličnim imunološkim karakteristikama u istom podtipu, molekularna klasifikacija ima veliki potencijal da predvidi TME i usmjeri preciznu terapiju u kliničkoj praksi.[15] Kroz sveobuhvatnu analizu različitih sistema molekularnih podtipova u TCGA-BLCA kohorti, otkrili smo da su pojedinci sa niskom ekspresijom BCAT2 vjerojatnije klasifikovani u bazalni podtip, praćen aktiviranim putevima bazalne diferencijacije, EMT diferencijacije, imunološke diferencijacije, interferonskog odgovora, i tako dalje. Pojedinci sa visokom ekspresijom BCAT2 uglavnom su klasifikovani u luminalne podtipove, praćene aktivnim putevima luminalne diferencijacije, urotelne diferencijacije i Ta (Slika S24A, Popratne informacije). Prema konsenzusu molekularnog podtipa, bazalni podtip ima veći nivo infiltracije efektorskih limfocita i aktivniji IFN-𝛾 signalni put od luminalnog podtipa,[16] što implicira bolju efikasnost imunoterapije. Zatim je AUC korišten za procjenu tačnosti predviđanja. Zapanjujuće, osim Baylorovog podtip sistema (AUC=0.76), većina AUC-a je bila iznad 0.90 u drugim sistemima (Slika S24B, Podržavajuće informacije), što znači robusnu tačnost predviđanja BCAT2 u molekularni podtip. Da bismo dalje istražili njegovu ulogu u predviđanju efikasnosti drugih terapija, uporedili smo aktivnost ciljne terapije receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) i puteva povezanih sa radioterapijom između grupa sa visokim i niskim BCAT2. Uz očigledne pojačano regulirane aktivnosti, vjerojatnije je da će pacijenti u grupi sa niskim BCAT2 imati pozitivan odgovor na EGFR-ciljnu terapiju i radioterapiju (slika S24C, prateće informacije). Za povećanje pouzdanosti predviđanja o molekularnom podtipu i osjetljivosti na tretman, osam BLCA kohorti (Xiangya BLCA kohorta, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329{ i E-282MThor0} i jedan immuterapiju) ) bili prijavljen za eksternu validaciju. Uz odličnu tačnost predviđanja, slični nalazi su pronađeni u ovim kohortama (Slike S25–S27, Popratne informacije). Hiperprogresivna bolest (HPD) je izuzetno neosjetljivo stanje na imunoterapiju. Za istraživanje uticaja BCAT2 na HPD, biomarkeri povezani sa HPD su prikupljeni iz prethodnih studija[17] i CNV biomarkera je upoređen između grupa sa niskim i visokim BCAT2. Osim za EGFR, stope CNV amplifikacije drugih HPD-pozitivnih povezanih biomarkera (crveni simbol) bile su veće u grupi sa visokim BCAT2, posebno MDM2 (p=0.0116). Stope brisanja CNV HPD-negativnih biomarkera (zeleni simbol) bile su niže u grupi sa visokim BCAT2 (slika S24D, prateće informacije). Ishod je pokazao da pacijenti sa visokom ekspresijom BCAT2 imaju potencijalni rizik od HPD-a tokom imunoterapije. Neoadjuvantna kemoterapija (NAC) je ključna terapija u BLCA. Markeri koji predviđaju odgovor na NAC u BLCA prikupljeni su iz pregleda Buttigliera et al.[18] i njihove stope mutacije su upoređene između ove dvije grupe. Na osnovu viših ukupnih stopa mutacija biomarkera i češćih mutacija RB1 u grupi sa niskim nivoom BCAT2, spekulisali smo da pojedinac sa niskom ekspresijom BCAT2 ima bolju efikasnost NAC u kliničkoj praksi (slika S24E, prateće informacije). Stoga je baza podataka Drugbank korištena za upoređivanje efikasnosti nekoliko uobičajenih režima kemoterapije između dvije grupe i otkriveno je da osobe sa niskom ekspresijom BCAT2 imaju veću vjerovatnoću da će odgovoriti na kemoterapiju. Pored toga, grupa sa niskim BCAT2 takođe je pokazala bolju efikasnost u uobičajenim režimima imunoterapije i ERBB terapije. Neočekivano, pacijenti sa visokom ekspresijom BCAT2 verovatno dobijaju bolje kurativne efekte u antiangiogenoj terapiji (slika S24F, prateće informacije). Zajedno, pojedinci sa niskom ekspresijom BCAT2 pripadaju upaljenom molekularnom podtipu, bazalnom podtipu, što znači pozitivniji odgovor na imunoterapiju, kemoterapiju, radioterapiju, terapiju EGFR-ciljom i terapiju ERBB. Nažalost, pacijenti sa visokom ekspresijom BCAT2 imaju slab odgovor na ove tretmane. Međutim, antiangiogena terapija za njih može biti tračak svjetla.
Slika 7. BCAT2 predviđa odgovor na imunoterapiju u nekoliko kohorti imunoterapije u stvarnom svijetu. A) IHC slika BCAT2 i PD-L1 između ispitanika koji su odgovorili i onih koji nisu odgovorili u Xiangya BLCA imunoterapijskoj kohorti. Skalirana traka: 50 μm. B) Višebojna IF slika BCAT2 i PD-L1 između ispitanika koji su odgovorili i onih koji nisu odgovorili u Xiangya BLCA imunoterapijskoj kohorti. Skala bar: 50 μm. BCAT2+ćelija (zelena), PD-L1+ćelija (žuta) i ćelijsko jezgro (plavo). C) CT slika razlike u efikasnosti imunoterapije između osoba sa visokim i niskim nivoom ekspresije BCAT2. Crvena strelica pokazuje na područje tumora. D) Ukupna razlika u stopi odgovora između grupa sa visokim i niskim BCAT2 u Xiangya BLCA imunoterapijskoj kohorti. E) Preciznost predviđanja BCAT2, PD-L1 i kombinovanog indeksa (BCAT2+PD-L1) na odgovor na imunoterapiju u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA. F) Razlika u preživljavanju bez bolesti (DFS) između grupa s visokim i niskim BCAT2 u Xiangya BLCA imunoterapijskoj kohorti. G) Razlike u nivou ekspresije BCAT2 među CR, PR, SD i PD grupama u pustinjskom tipu IMvigor210 kohorte. *p < 0,05; ns: nema značaja. H) Preciznost predviđanja BCAT2, PD-L1 i kombinovanog indeksa (BCAT2+PD-L1) na odgovor na imunoterapiju u pustinjskom tipu IMvigor210 kohorte. I) Razlika u ukupnom preživljavanju (OS) između grupa sa visokim i niskim BCAT2 u pustinjskom tipu IMvigor210 kohorte. J–M) Razlike u odgovoru na imunoterapiju između grupa sa visokim i niskim BCAT2 u kohortama GSE35640, GSE173839, GSE135222 i Gide2019.
3. Diskusija
Kao ključni enzim u procesu katabolizma BCAA, prethodna istraživanja su se uglavnom fokusirala na metaboličku ulogu BCAT2 u bolestima, kao što su gojaznost, dijabetes i aritmija. Ma et al. pokazali su da izbacivanje BCAT2 u masnom tkivu može ubrzati posmeđivanje masnog tkiva i termogenezu, što dovodi do smanjene stope gojaznosti kod miševa.[19] Otkrivanjem uzoraka krvi više od 2000 osoba, Gerszten et al. je prikazao profil metabolita povezan sa dijabetesom i otkrio da BCAT2-transformisani BCAA igraju ključnu ulogu u razvoju bolesti.[20] Portero et al. otkrili su da besmislene mutacije BCAT2p.Q300*/p.Q300* dovode do povišenih nivoa BCAA i izazivaju aritmije kod miševa.[21] Nedavno je nekoliko studija otkrilo da BCAT2 ima blisku vezu sa rakom. Lei et al. otkrili su da degradacija BCAT2 posredovana acetilacijom može usporiti razvoj duktalnog adenokarcinoma pankreasa (PDAC) smanjenjem nivoa metabolizma BCAA.[22] Wang et al. smatraju da ograničeni nivo transkripcije BCAT2 dovodi do smanjenog intracelularnog nivoa glutamata, koji stimuliše feroptozu ćelija hepatoma.[23] Međutim, sva postojeća istraživanja naglašavala su utjecaj BCAT2-posredovanog BCAA katabolizma na biološki proces raka umjesto istraživanja potpuno novog mehanizma. U ovoj studiji smo po prvi put otkrili imunosupresivnu ulogu BCAT2 u TME. Primjena imunoterapije redefinira liječenje raka, uz odličan kvalitet života i produženo vrijeme preživljavanja. Ipak, zbog heterogenosti tumorskog imunološkog ekološkog sistema, samo dio pojedinaca postiže zadovoljavajuću efikasnost. TME je komplikovan sistem, sastavljen od tumorskih ćelija, imunih ćelija, stromalnih ćelija i kapilara.[24] Prema nivou infiltracije CTL-a, TME se generalno može klasifikovati na upaljene i neinflamatorne tipove.[25] Sve veći broj dokaza ukazuje da upaljeni TME igra pozitivnu ulogu u izazivanju efikasnih antitumorskih imunoloških odgovora tokom terapije.[26] Stoga smo sveobuhvatno analizirali više indikatora vezanih za TME i otkrili da visoka ekspresija BCAT2 oblikuje neupaljeni TME, sa otežanim ciklusom imuniteta na rak, represivnim obrascem ekspresije hemokinskog profila, molekula MHC i nedovoljnim nivoom infiltracije TIIC-a. Pored toga, BCAT2 je negativno povezan sa TIS i efektorskim genima ICB-a, što implicira da osobe sa visokom ekspresijom BCAT2 verovatnije neće reagovati na imunoterapiju. Da bismo potvrdili našu hipotezu, uporedili smo stopu odgovora između grupa sa visokim i niskim BCAT2 u kohorti imunoterapije Xiangya BLCA i drugim imunoterapijskim kohortama. Iznenađujuće, postojale su značajne razlike u višestrukim kohortama, što je pokazalo da je BCAT2 sposoban da igra i prediktor efikasnosti imunoterapije, posebno kod BLCA. Nadalje, scRNA-seq je korišten za istraživanje regulacionog mehanizma BCAT2 u TME i pokazao je da aktivnost signalnih puteva povezanih s citokinom/hemokinom, signalnog puta hemotakse T ćelija i signalnog puta migracije T ćelija imaju značajne negativne korelacije sa BCAT2. Kao kritična regulaciona mreža, citokini i hemokini su neophodni za promet različitih imunoloških ćelija u TME. Sistem hemokina ima četiri superfamilije: C, CC, CXC i CX3C, sa značajnom redundantnošću u paru liganada i receptora.[27] Citokin se može podijeliti u Th1, Th2 i Th17 podfamilije na osnovu njihove biološke funkcije.[28] Kroz njihovo lučenje različitih nivoa, borba između tumorskih ćelija i imunih ćelija dovoljna je da se reprogramiraju karakteristike TME.[29] Ipak, među velikim brojem citokina i hemokina, neophodno je izdvojiti najvredniji klaster. Koristeći 34-panel za imunotestiranje citokina i hemokina, otkrili smo da su hemokini, uključujući CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 i CXCL10, u snažnoj negativnoj korelaciji sa ekspresijom BCAT2 u ljudskim i mišjim ćelijama raka mokraćne bešike. Dobro je poznato da su CXCL9 i CXCL10 odgovorni za regrutovanje CD8+T ćelija u TME.[30] Da bismo utvrdili funkciju CCL3, CCL4 i CCL5, pogledali smo prethodna istraživanja. Harlin et al. je koristio nizove proteina i qPCR kako bi otkrio da je povećanje regulacije CCL3, CCL4 i CCL5 sposobno promovirati migraciju CD8+T ćelija u melanom.[31] Noman et al. otkrili su da povećana populacija sekrecije CCL5 pomaže u uspostavljanju proinflamatornog TME tako što prometuje CTL u tkivo kolorektalnog raka.[32] Kroz IHC i RNA-sekve profila hemokina u više kohorti, Romero et al. pokazali su da CCL4 i CCL5 imaju jaku povezanost sa nivoom infiltracije CD8+T ćelija kod raka gušterače.[33] Stoga smo smatrali da su hemokini povezani sa CD8+T-ćelijama glavni hemokini regulisani BCAT2 kod raka mokraćne bešike. Iako smo pokazali snažne negativne korelacije između BCAT2 i CD8+T ćelija povezanih hemokina, osnovni regulatorni mehanizam između njih još uvijek treba dalje istražiti. Studija Petersona et al. pokazao da aktivacija signalnog puta MAP kinaze (MAPK) može inducirati proizvodnju CX3CL1.[34] Xu et al. otkrili su da JAK-STAT signalni put reguliše lučenje Th1-srodnih hemokina, uzrokujući smanjeni nivo infiltracije TIL-a.[35] Nedavno su Peng et al. otkrili su da demetilaza JMJD3 može inhibirati ekspresiju hemokina povezanih s CD4+Tćelijama i smanjiti nivo infiltracije citotoksičnih T ćelija u TME, što predstavlja ključnu ulogu epigenetske modifikacije u regulaciji ekspresije hemokina.[36] Mayo et al. također je otkrio da epigenetski inhibitor, histon deacetilaza 1, ima veliki kapacitet da potisne ekspresiju CXCL8 putem aktivacije signalnog puta nuklearnog faktora-𝜅B (NF-𝜅B).[37] Štaviše, kao simboli metabolizma tumorskih ćelija, aerobne glikolize i reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), što ukazuje na odlične performanse u indukovanju ekspresije CXCL8 i CXCL14 podizanjem aktivnosti signalnih puteva NF-𝜅B i proteina 1 aktivatora transkripcionog faktora (AP{93 }}).[38] Zanimljivo je da su u našoj studiji signalni putevi NF-𝜅B, STAT i MAPK značajno obogaćeni između visokih i niskih BCAT2 ćelijskih linija (slika 3K; slika S16A, B, prateće informacije). Stoga ćemo, u kombinaciji s gore navedenim studijama, dalje istraživati ključni molekul u regulacionom mehanizmu BCAT2 i CD{100}}T-srodnih hemokina. Ograničena objektivna stopa odgovora monoterapije sa ICB-om podstiče pojavu strategije kombinovane terapije. Za pretvaranje neimunološkog TME u imunološki TME, Wolchok et al. primijenio kotretman nivolumabom (anti-PD-1 terapija) i ipilimumabom (anti-CTLA-4 terapija) kod pacijenata sa melanomom i otkrio ohrabrujući kurativni efekat, koji se pripisuje sinhronoj pojačanoj pripremi, aktivaciji i ubijanju CTL-a .[39] Više od kombinacije s drugom vrstom ICB-a, kemoterapija plus imunoterapija je alternativna terapija. Kao režim prve linije liječenja uznapredovalog urotelnog karcinoma, nekoliko studija je otkrilo da je kemoterapija zasnovana na cisplatinu sposobna da oblikuje proinflamatorni TME povećavajući nivo ekspresije MHC I klase na dendritskim ćelijama i oštećujući MDSC i Tregove.[40] Slučajno, Homma et al. otkrili su da drugi uobičajeni lijek za kemoterapiju za rak mokraćne bešike — gemcitabin — može poboljšati infiltracijsku količinu CD{110}}T ćelija i narušiti imunosupresivne imune ćelije u TME.[41] U našem pretkliničkom eksperimentu na životinjama, zajednički tretman gubitka BCAT2 i anti-PD{114}} mab pokazao je izrazitiju antitumorsku efikasnost u poređenju sa monoterapijom anti-PD-1 mab kod imuno-kompetentnih miševa, što pruža inovativni tretman strategija za pacijente s otpornošću na ICB. U međuvremenu, kroz analizu protočne citometrije i IF, pokazali smo da uništavanje BCAT2 ne samo da regrutuje veću populaciju CTL-a u TME, već i povećava aktivnost ubijanja CTL-a. Slično, Peng et al. otkrili su da prekomjerna ekspresija LGALS2 smanjuje količinu infiltrirajućih CTL-ova kao i citotoksičnih biomarkera kod miševa koji nose rak dojke.[42] Yang et al. ilustrovao da je CXCL13 sposoban pojačati odgovor na imunoterapiju kod mišjih modela raka jajnika povećanjem nivoa infiltracije CD8+T ćelija i nivoa sekrecije GZMB, IFN-𝛾 i IL-2.[43] Prateći snažniji antikancerogeni odgovor, kombinovana terapija dodatno remeti postojeću imunološku povratnu petlju, što vjerovatno dovodi do teških nuspojava. Prema obrascu ekspresije BCAT2 na nivou siRNA, specifično izraženom u tumorskim ćelijama, a ne u imunim ćelijama i endotelnim ćelijama, možemo preliminarno zaključiti da je manja verovatnoća da će gubitak BCAT2 ili inhibitor BCAT2 dovesti do strašnih štetnih efekata. Međutim, još uvijek treba istražiti optimalnu dozu i interval intervala BCAT2 inhibitora i anti-PD-1 mab u kombinovanoj terapiji.
Za vođenje precizne terapije kod pojedinaca, povezali smo BCAT2 sa molekularnim podtipom BLCA i kritičnim biomarkerima različitih terapija. Na osnovu vjerodostojnih predviđanja u više skupina, otkrili smo da su imunoterapija, kemoterapija, radioterapija i EFGR-target terapija pogodni za pacijente sa niskom ekspresijom BCAT2. Antiangiogena terapija se preporučuje za pacijente sa visokom ekspresijom BCAT2. Za razliku od komplikovanog procesa detekcije molekularnih podtipova, BCAT2 je prenosivi prediktor za preciznu terapiju. Neizbežno, postoje neka ograničenja u našim studijama. Prvo, veličina uzorka i vrijeme praćenja Xiangya BLCA kohorte i Xiangya BLCA imunoterapijske grupe bili su ograničeni. Moramo dodatno povećati veličinu uzorka i nastaviti standardizirano praćenje. Drugo, kao kohorta u stvarnom svijetu, Xiangya BLCA imunoterapijska kohorta je sadržavala različite opcije operacije koje su vjerovatno uzrokovale potencijalnu pristrasnost. Dalje ćemo povećati našu kohortu i provesti analizu podgrupa na osnovu iste opcije operacije. Treće, kooperativni efekat kombinovane terapije in vivo treba dalje da se potvrdi korišćenjem sistemske primene BCAT2 inhibitora. Ukratko, kao imunosupresivna uloga u TME BLCA, BCAT2 je nova meta u kombinovanoj terapiji ICB-a i precizan biomarker precizne terapije.
Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem
4. Eksperimentalna sekcija
cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1.5 i prilagođena p-vrijednost < 0.05. Gene ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analize su sprovedene na identifikovanim DEG pomoću ClusterProfiler R paketa.[51] Seurat R paket sa Findmarker algoritmom je primijenjen za izračunavanje nivoa ekspresije BCAT2 na epitelnim ćelijama u scRNA-seq. Na osnovu različitog rangiranja ekspresije gena prema vrijednosti puta promjene (FC), implementirana je analiza obogaćivanja genskog skupa (GSEA) za procjenu pozitivnih i negativnih korelacija. Identifikacija imunološki povezanih DEG-a: ESTIMATE R paket je korišten za izračunavanje imunoloških i stromalnih rezultata u TCGA-BLCA kohorti. Prema srednjoj vrijednosti dva rezultata i nivou ekspresije BCAT2, Limma R paket je primijenjen za identifikaciju pozitivnih/negativnih imunoloških i stromalnih DEG-ova. Paket R Vennovog dijagrama je korišten da se uzme sjecište različitih grupa i da se odrede zajednički DEG. Klasifikacija pojedinaca koji koriste molekularne podtipove BLCA: Sedam molekularnih podtipova BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT i Consensus) se široko primjenjivalo u kliničkoj praksi za procjenu karakteristika TME i efikasnosti različitih terapija.[52] Uzimajući u obzir složenu interakciju različitih podtipova, zajednički smo ih podijelili u dvije glavne kategorije – bazalni i luminalni podtip.[16] R paketi Consensus MIBC i BLCAsubtyping su korišteni za klasifikaciju pojedinaca u specifične podtipove. Nakon normalizacije, površina ispod ROC krive (AUC) je korištena za procjenu pouzdanosti BCAT2 u predviđanju klasifikacije. Procjena precizne terapije pacijenata: Kao što je ilustrovano u našoj prethodnoj studiji,[53] niz kritičnih genskih potpisa, koji mogu predvidjeti efikasnost hemoterapije, radioterapije, ciljane terapije i imunoterapije, prikupljen je iz različitih studija i baza podataka.[16, 54] SsGSEA algoritam je korišten za izračunavanje rezultata obogaćivanja genskih potpisa.[55] Ćelijske linije: Ljudske ćelije raka mokraćne bešike (T24) i ćelije raka bešike miša (MB49) kupljene su od Procell Life Science & Technology (Wuhan, Kina) i Meisen CTCC (Jinhua, Kina), respektivno. Održavani su u DMEM mediju (BasalMedia, Kina) sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (BI, Izrael), 1% penicilina i streptomicina (NCM Biotech, Kina) i uzgajani u inkubatoru na 37 stepen temperature koji sadrži 5% CO2. Konstrukcija i RNA-sek stabilnih transfekcionih ćelija: Lentivirusni vektor plenti-BCAT2-flag-puromicin (GV341) je dizajnirao i konstruisao GeneChem (Šangaj, Kina) za stabilnu prekomernu ekspresiju BCAT2-(BCAT2 OE) ćelijska linija i njena negativna kontrola (oe-vektor). Pored toga, BCAT2- kratku ukosnicu RNA (shRNA) je kloniran u GV112-lentivirusni vektor od strane GeneChem-a (Šangaj, Kina) za stabilnu ćelijsku liniju BCAT2-kok-down (BCAT2 KD) . Ciljne sekvence shRNA su navedene u tabeli S3 (Informacije za podršku). Zatim su rekombinantni BCAT2 lentivirusi transficirani u objektivne ćelije prema uputama proizvođača. 2 ug mL-1 puromicina (Amersco, SAD) korišteno je za filtriranje stabilnih transfekcionih ćelija tokom tri dana. Western blot i kvantitativna reverzna transkripcija PCR (qRT-PCR) primijenjeni su da bi se potvrdila efikasnost transfekcije. Na kraju je odabrana stabilna transfekciona ćelija sa najboljom efikasnošću za RNA-seq i dalje eksperimente. Tri duplirana uzorka svake ćelijske linije poslata su na BGI RNA-seq platformu (Šenžen, Kina). Kriterijumi za odabir DEG-a i analizu puteva obogaćivanja bili su isti kao što je prikazano u 2.3 (analize puteva obogaćivanja). ProcartaPlex višestruki imunoeseji za otkrivanje nivoa sekrecije hemokina i citokina ćelijskih linija raka: humani ProcartaPlex imunotest panel (Mačka: EPX340-12167-901) i miš ProcartaPlex imunotest panel (Mačka: EPX{4}}{3}) kupljeni su od ThermoFisher Scientific-a (Masachusetts, SAD) za detekciju nivoa ekspresije proteina od više od 30 ključnih hemokina i citokina u ćelijama raka stabilne transfekcije. Ukratko, supernatanti ćelijske kulture su sakupljeni sa 24-ploče i centrifugirani da bi se uklonile ćelije i ćelijski ostaci. Zatim su supernatanti za bistrenje inkubirani sa kuglicama u panelu prema uputstvima proizvođača. Luminex platforma za detekciju (ThermoFisher Scientific, SAD) korištena je za kvantitativnu analizu svakog uzorka. Neotkriveni indikatori su isključeni iz analize. qRT-PCR: Ukupna RNA je izolovana iz ćelija sa kompletom za izolaciju ukupne RNA ćelije i kompletom za izolaciju ukupne RNA životinja (Foregene, Kina) prema protokolu proizvođača. cDNK je sintetizovan korišćenjem UeIris II RTPCR sistema za prvu lančanu cDNK sintezu (US Everbright, Kina). qRTPCR je izveden korišćenjem SYBR Green qPCR Master Mix-a (US Everbright, Kina) na CFX Connect sistemu (Bio-Rad, SAD). GAPDH je korišten kao interna standardna kontrola. Prajmere je dizajnirao i sintetizovao Sangon Biotech (Šangaj, Kina), a detaljne sekvence prajmera su navedene u Tabeli S4 (Informacije za podršku). ELISA: Koncentracije CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) i CXCL10 (IP10) u supernatantima ćelijske kulture raka mokraćne bešike određene su pomoću humanih ELISA kompleta prema protokolu proizvođača (Proteintech, SAD). Za mjerenje vrijednosti optičke gustoće (OD) korišten je biotehnološki čitač mikroploča (ThermoFisher Scientific, SAD). S obzirom na veliku raznolikost nivoa sekrecije između različitih citokina i hemokina, sproveli smo standardizaciju podataka (log 2 transformacija) prije analize. Western Blot: RIPA pufer (NCM biotech, Kina) dodan sa 1% koktelom inhibitora proteaze (NCM biotech, Kina) korišten je za lizu ćelija. BCA Protein Assay Kit (NCM biotech, Kina) je korišten za određivanje koncentracije proteina. Nakon prenošenja na PVDF membrane, ćelijski proteini su sukcesivno inkubirani sa primarnim antitelima i specifičnim HRP-konjugiranim sekundarnim antitelima. Signale je hvatao XRS sistem za snimanje (Bio-Rad, SAD). Primarna antitijela uključuju anti-BCAT2 antitijela (Cat: ab95976, Abcam, SAD) i anti-GAPDH antitijela (Cat: ab8245, Abcam, SAD). Sekundarna antitijela uključuju HRP kozji anti-zečji IgG (Cat: 7074, Cell Signaling Technology, SAD) i HRP kozji anti-mišji IgG (Cat: 7076, Cell Signaling Technology, SAD). Test ubijanja ćelija raka posredovanim limfocitima T i test kokulture: Uzorci krvi su prikupljeni od 10 zdravih davalaca u našoj bolnici. Prema uputstvima proizvođača, za ekstrakciju mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) korišćeno je gradijentno centrifugiranje od strane Lymphoprep-a (Cat: 07851, StemCell Technologies, SAD). Dodatno, pufer za lizu crvenih krvnih zrnaca (Solarbio, Kina) korišten je za eliminaciju crvenih krvnih zrnaca pomiješanih s PBMC-ima. Da bi se aktivirale T ćelije, PBMC su uzgajane u DMEM mediju (Gibco, SAD), dodajući rekombinantni ljudski IL- 2 (10 ng mL−1, Cat: 202-1L-050, R&D , SAD), i ImmunoCult Human CD3/CD28/CD2 aktivator T ćelija (25 μL mL−1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, SAD) u trajanju od 1 sedmice. U odnosu 1:5, ćelije raka mokraćne bešike (BCAT2-OE, BCAT2-KD i njihove negativne kontrole) su kultivisane sa aktiviranim T ćelijama u DMEM medijumu sa anti-CD3 antitelom (100 ng mL−1, Thermo Scientific, SAD) i IL-2 (10 ng mL−1) od jednog donatora u 12- ploči sa bunarima 72 h. Zatim su T ćelije sakupljene za analizu protočnom citometrijom. Detaljna strategija gejta analize protoka prikazana je na slici S28 (Informacije za podršku). Preostale ćelije raka su obojene kristalno ljubičastom bojom i izmjerena je vrijednost OD na 570 nm čitačem mikroploče. Antitela za analizu protočne citometrije uključuju Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, SAD), APC/ Cy7 anti-humani CD45 (Cat: 368516, Biolegend, SAD), Pacific Blue anti-humano CD3 antitelo (Cat: 300329, Biolegend, SAD), PerCP/Cy5.5 anti-humano CD4 antitijelo (Cat: 317427, Biolegend, SAD), FITC anti-humano CD8a antitijelo (Cat: 301006, Biolegend, SAD), PE/Dazzle 594 anti-humano TNF- 𝛼 Antitijelo (Cat: 502946, Biolegend, SAD) i Brilliant Violet 711 anti-humano IFN- 𝛾 Antitijelo (Cat: 502540, Biolegend, SAD). Test hemotakse: Test hemotakse je implementiran u 24-transwell ploču sa 3 μm prečnika jezgra (Corning, SAD). Ljudski CD8+T Cell Isolation Kit (Cat: 480012, Biolegend, SAD) je korišten za ekstrakciju CD8+T ćelija iz PBMC. 1 × 105 izolovanih ćelija u zapremini od 200 μL je dodano u gornju komoru, a 600 μL supernatanata različitih stabilnih transfekcionih ćelijskih linija je dodato u donju komoru. Nakon inkubacije od 6 h na 37 stepeni, ćelije su migrirale u donju komoru i sakupljene su i izbrojane protočnom citometrijom. Testovi ćelijske proliferacije, migracije i invazije: Test formiranja kolonija ploča je korišten za procjenu sposobnosti ćelijske proliferacije. BCAT2-OE, BCAT2-KD i negativne kontrole ljudske ćelije raka mokraćnog mjehura uzgajane su u 6-pločama za jažice po jažici. Nakon inkubacije u vlažnoj atmosferi od 37 stepeni tokom 2 sedmice, kolonije su fiksirane i obojene paraformaldehidom i kristalno ljubičastom, respektivno. Transwell komore sa polikarbonatnim membranskim umetcima od 8,0 μm (Corning, SAD) korišćene su za procenu kapaciteta migracije ćelija i invazije in vitro. 1 × 105 stabilnih transficiranih ćelija suspendovano je u mediju bez seruma i zasejano u gornju komoru sa ili bez Matrigela (Corning, SAD), za odvojeno ispitivanje invazije i migracije. Nakon inkubacije od 24 h (test migracije) i 48 h (test invazije), ćelije koje su prianjale na donju površinu membrane su fiksirane i obojene. Ćelije koje su ostale u gornjoj komori uklonjene su brisevima. Pet nasumičnih polja je odabrano pod mikroskopom za izračunavanje broja ćelija. Imunofluorescencija (IF) i imunohistohemija (IHC): Višebojni IF na TMA Xiangya BLCA kohorte i Xiangya BLCA imunoterapije kohorte implementiran je višestrukim fluorescentnim imunohistohemijskim kompletom za bojenje (Absin, Kina). Ukratko, nakon deparavanja, rehidracije i renoviranja antigena, TMA je inkubiran sa primarnim antitelima i sekundarnim antitelima što dovodi do vezivanja različitih luciferina pojačavanjem tiramidnog signala (TSA). Nakon brisanja nevezanih antitijela citratnim puferom, proces inkubacije je ponovljen dva puta. DAPI je upotrijebljen za suzbijanje ćelijskih jezgara, a slike su skenirane pomoću Pannoramic MIDI platforme (3DHISTECH, Mađarska). Primarna antitijela na TMA Xiangya BLCA kohorte uključuju anti-BCAT2 (Mačka: ab95976, Abcam, SAD), anti-Cytokeratin 19 (CK19) (Mačka: ab52625, Abcam, SAD), anti-CD8 (Mačka: ab237709, Abcam, SAD ) i DAPI (Invitrogen, SAD). Sekundarna antitijela i fluorohrom na TMA Xiangya BLCA kohorte uključuju HRP kozji anti-zečji/mišji IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Primarna antitijela na TMA imunoterapijske grupe Xiangya BLCA uključuju anti-BCAT2 (Mačka: ab95976, Abcam, SAD), anti-PD-L1 (Mačka: ab213524, Abcam, SAD) i DAPI (Invitrogen, SAD). Sekundarna antitijela i fluorohrom na TMA imunoterapijske grupe Xiangya BLCA uključuju HRP kozji anti-zečji/mišji IgG, Absin 520 TSA Plus i Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). IF na mišjim tumorskim tkivima inkubiran je sa primarnim antitelom—anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, SAD)—i sekundarnim antitelom—anti-mišjim Alexa Fluor 488 konjugatom boje (Invitrogen, SAD). DAPI je primijenjen na vizualizirano ćelijsko jezgro. Pet nasumičnih polja je odabrano pod mikroskopom da bi se izračunali pozitivni brojevi ćelija za bojenje. IHC na TMA Xiangya BLCA kohorte i Xiangya BLCA imunoterapije kohorte je sproveo SP-9000 Kit (ZSGB-BIO, Kina). Nakon preuzimanja i blokiranja antigena, primarna i sekundarna antitijela su inkubirana s tumorskim tkivima. Zatim je diaminobenzidin (DAB) primijenjen na ciljne antigene boje. Smeđi signal se smatra pozitivnim bojenjem. Rezultat intenziteta bojenja (odsutan=0, slab=1, umjeren=2 i jak=3) množenje rezultata pozitivnog procenta (bez bojenja=0, bojenje ćelija manje od 25%=1, 25%–50% ćelija za bojenje=2, 50%–75% ćelija za bojenje=3 i bojenje ćelija više od 75%=4) krajnji IHC rezultat uzoraka. Rezultati BCAT2/CD8/PD-L1 manji od šest poena klasifikovani su kao niska ekspresija, a njihovi rezultati veći ili jednaki šest poena klasifikovani su kao visoka ekspresija. Za procjenu statusa pojedinca na MMR, svi uzorci iz imunoterapijske grupe Xiangya BLCA procijenjeni su na osnovu rezultata bojenja četiri gena markera MMR (MLH1, MSH2, MSH6 i PMS2). Kao što je prikazano u prethodnim studijama,[56] kada su sva četiri markerska gena bila pozitivno obojena, pojedinac je označen kao MMR. Kada je bilo koji od četiri markerska gena imao negativno bojenje, pojedinac je označen kao dMMR. Dva nezavisna patologa su pozvana da izvrše procjenu. Antitijela uključuju: anti-BCAT2 (Mačka: ab95976, Abcam, SAD), anti-CD8 (Mačka: ab4055, Abcam, SAD), anti-PD-L1 (Mačka: ab213524, Abcam, SAD), anti-MLH1 (Mačka: A4858, Abcolonal, Kina), anti-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, Kina), anti-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, Kina), anti-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, Kina) i HRP Goat Anti - IgG zeca/miša (ZSGB-BIO, Kina). TissueFAXS Panoramske analize prostorne interakcije u TME: Za procjenu prostorne interakcije BCAT2+ malignih ćelija i efektorskih T ćelija, TissueFAXS panoramska platforma (Tissue Gnostics, Austrija) korištena je za skeniranje i poluautomatsku analizu objektivnih ćelija obojenih višebojnim IF-om TMA Xiangya BLCA kohorte. TMA je sastavljen od biopsija jezgra od 1,5 mm iz uzoraka tumorskog tkiva ugrađenih u parafin. Detaljno, BCAT2+ ćelije, maligne ćelije i CD{241}}T ćelije su obojene specifičnim primarnim i sekundarnim antitijelima. Za bojenje ćelijskog jezgra korišten je DAPI (Invitrogen, SAD). Detaljni koraci opisani su u studiji Makarevića i dr..[57] Ukratko, prema intenzitetima fluorescencije različitih indikatora i fizičkim svojstvima ćelija, pozitivne ćelije su označene i kvantifikovane. Još važnije, prostorne distribucije CD8+T ćelija oko BCAT2+CK19+ ćelija su prikazane dijagramima raspršenosti na osnovu prostorne udaljenosti (0–25, 25–50, 50– 100 i 100–150 μm). Dva iskusna patologa su pozvana da provjere ishod odluke panoramske platforme TissueFAXS. Eksperimenti na životinjama: Ženke C57BL/6 miševa (6-7 nedelja) su dobijene sa Odeljenja za laboratorijske životinje Univerziteta Central South. Sve operacije na miševima su provjerene i odobrene od strane Komiteta za njegu i korištenje životinja bolnice Xiangya, Central South University (broj artikla: 2021101175). Iznad svega, da bi se istražila uloga BCAT2 na rast tumora in vivo, BCAT2 KD MB49 ćelije (5 × 105) i njegove kontrolne ćelije u volumenu medijuma od 100 μL su supkutano ubrizgane u desni bok miševa. Štaviše, nakon uspješnog konstruiranja modela potkožnog tumora (volumen tumora do 100 mm3), 100 ug InVivomAb anti-mišjeg PD-1 (Cat: BE0146, Bioxcell, USA) i kontrola izotipa IgG2a (Cat: BE0089, Bioxcell, SAD) intraperitonealno su ubrizgane po mišu, za procjenu sinergističkog efekta gubitka BCAT2 i anti-PD-1 terapije. Anti-PD{277}} terapija je primenjivana na miševima svaka 3 dana i trajala je do pet kurseva. Nadalje, za procjenu da li je kooperativni efekat tretmana zavisan od CD8+T ćelija. Prateća kombinovana terapija, 100 ug InVivoPlus anti-mišjeg CD8𝛼 (Mačka: BP0117, Bioxcell, SAD) i kontrola izotipa IgG2b (Mačka: BP0090, Bioxcell, SAD) korišteno je za iscrpljivanje CD8+T ćelija kod miševa. Tjelesne težine miševa su bilježene svaka tri dana. Na zakazani datum, tumori su sakupljeni, izmjereni i pripremljeni za analizu protočne citometrije, IF bojenje i qRT-PCR. Za istraživanje interakcije između nivoa ekspresije BCAT2 na CD8+T ćelijama i aktivnosti CD8+T ćelija, slezine ženki C57BL/6 miševa (6–7 nedelja) bez tumora su bile disociran i pripremljen za jednoćelijsku suspenziju za dalju analizu. Analiza protočne citometrije: Mišji tumori su mljeveni i digestirani u jednoćelijsku suspenziju pomoću kolagenaze IV (Cat: C5138, Sigma, SAD), hijaluronidaze (Cat: H3506, Sigma, SAD) i DNase I (Mačka: DN25, Sigma, SAD) ). 70 μm ćelijska cjedila (BIOFIL, Kina) korištena su za filtriranje nečistoća, a brojač ćelija (Countstar, Kina) je korišten za dobivanje (3–5) × 106 ćelija u svakom uzorku. Nakon identifikacije živih ćelija pomoću Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Mačka: 423101, Biolegend, SAD) i blokiranja Fc receptora anti-mišjim CD16/32 antitelom (Mačka: 156603, Biolegend, SAD), antigeni ćelijske membrane su obojeni APC-Cy7 anti-miš CD45 (Cat: 103116, Biolegend, SAD), BV421 anti-miš CD3 (Cat: 100341, Biolegend, SAD), BV605 anti-miš CD8a (Cat: 100744, Biolegend, SAD) i PerCPCy5.5 anti-miš CD4 (Cat: 100540, Biolegend, SAD). Zatim je bioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Cat: 2400632, Invitrogen, SAD) korišten za fiksiranje i permeabilizaciju ćelijske i nukleusne membrane. Antigeni povezani s citotoksičnim efektom obojeni su PE anti-ljudskim/mišjim Granzimom B (Cat: 372208, Biolegend, SAD), PE-Cy7 anti-mišjim TNF-𝛼 (Mat.: 506324, Biolegend, SAD), PE-Dazzle 594 anti- miš IFN-𝛾 (Cat: 505846, Biolegend, SAD), APC anti-miš Perforin (Cat: 154304, Biolegend, SAD). Strategija gajtinga analize protočne citometrije prikazana je na slici S29 (Informacije za podršku). Antihumani/mišji BCAT2 (Cat: A7426, Abclonal, Kina) inkubiran je sa fleksibilnim kompletom za obeležavanje antitela 488 (Mačka: KFA001, Proteintech, SAD) za sintetizaciju personalizovanog BCAT2 fluorescentnog antitela za analizu protočnom citometrijom. Zatim su BCAT2 antitijela i antitijela povezana s T-ćelijama pomiješana i dodana u jednoćelijsku suspenziju mišje slezene radi istraživanja interakcije između nivoa ekspresije BCAT2 na CD8+T ćelijama i aktivnosti CD{{357} }T ćelija. Strategija gajtinga analize protočne citometrije prikazana je na slici S30 (Informacije za podršku). Obojeni uzorci su detektovani na Cytek DxpAthena Flow citometriji (Cytek Biosciences, SAD), a podaci su analizirani softverom verzije Flowjo (BD Biosciences, SAD). Statistička analiza: Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. t-test sa ili bez Welch korekcije je korišten za poređenje kontinuiranih varijabli između dvije grupe. Jednosmjerna ANOVA analiza sa ili bez Brown-Forsythe i Welch testova korištena je za poređenje kontinuiranih varijabli između više grupa. Hi-kvadrat test ili Fisherov egzaktni test primijenjen je za poređenje dihotomnih varijabli. Za procjenu intenziteta korelacije između različitih varijabli korišten je test koeficijenata korelacije Pearson ili Spearman. Kaplan–Meierova kriva preživljavanja je korištena da pokaže prognostičke analize dihotomnih varijabli, a test log ranga korišten je za procjenu statističkih razlika. Dvostrano p < 0,05 definisano je kao prag značajnosti. R softver (verzija 4.0) i GraphPad Prism8 su primijenjeni za obradu podataka u studiji.
Referenca
[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Cancer J. Clin. 2021, 71, 7.
[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.
[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Cancer Treat. Rev. 2019, 76, 10.
[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Davis, J. Picus, G. Philips, DI Quinn, GK Haines 3., NM Hahn, Q. Zhao, M. Yu, SK Pal, J. Clin. Oncol. 2020, 38, 1797; c) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulović, W. Demey, A. Ullén, Y. Loriot, SS Sridhar, N Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , A. di Pietro, P. Grivas, N. Engl. J. Med. 2020, 383, 1218.
[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Br. J. Cancer 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Cancer Cell 2020, 37, 443.
[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Med. Biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Cancer Res. 2019, 79, 4557.
[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Rak 2018, 6, 157; b) B. Zhang, Q. Wu, B. Li, D. Wang, L. Wang, YL Zhou, Mol. Rak 2020, 19, 53.
[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Science 2016, 353, 1161.
[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Cell Biol. 2020, 22, 167.
[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Med. 2019, 51, 146.
[11] a) H. Lai, X. Cheng, Q. Liu, W. Luo, M. Liu, M. Zhang, J. Miao, Z. Ji, GN Lin, W. Song, L. Zhang, J. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Cancer 2021, 149, 2099; b) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. Med. 2018, 24, 1277.
[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Rev. Immunol. 2017, 17, 559.
[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Visschers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.
