​Zasnovano na mrežnoj farmakologiji i eksperimentima na životinjama kako bi se istražio učinak feniletanoidnog glikozida Cistanche Tubulosa na učinak dijabetičke nefropatije

Sažetak: Cilj Istražiti učinakCistanchefeniletanol glikozidi(CPhGs) uključenodijabetička bolest bubrega(DKD) zasnovan na mrežnoj farmakologiji i eksperimentima na životinjama. Metode Za analizu je korištena UHPLC-QE-MS metodahemijske komponente CPhG-a. TCMSP i Swiss Target Prediction baze podataka korištene su za pregled ključnih komponenti. OMIM i GeneCards baze podataka korištene su za dobivanje ciljeva vezanih za DKD. Nakon dobivanja zajedničkih ciljeva, STRING web stranica je korištena za izgradnju mreže interakcije proteina. DAVID baza podataka je korištena za GO, analizu KEGG puta, a softver Cytoscape je korišten za izgradnju mreže "CPhGs core komponenta-cilja-puta". Deset pacova je nasumično odabrano kao normalna grupa, a preostali pacovi su hranjeni hranom s visokim sadržajem šećera i masti i dobili su jednu intraperitonealnu injekciju STZ-a kako bi se uspostavio DKD model. Podijeljeni su u modelsku grupu, grupu dapagliflozina (1 mg/kg) i CPhG visoke i srednje i niske doze (500, 25{{40}}, 125 mg/kg) grupe, 10 životinja u svakoj grupi, intervencija lijeka 6 sedmica, opća stanja su praćena, tjelesna težina određivana i glukoza u krvi svake sedmice; 24 h urin je sakupljen nakon posljednje doze. Otkrivanje 24-satnog ukupnog proteina u urinu (24-UTP); prikupiti krv iz abdominalne aorte i žrtvovati je, odvojiti serum i otkriti dušik uree (BUN), mokraćnu kiselinu (UA), ukupni holesterol (TC), trigliceride (TG) i visok krvni pritisak. Nivoi lipoproteina visoke gustine (HDL) i lipoproteina niske gustine (LDL), HE bojenje i Massonovo bojenje korišteni su za uočavanje patoloških promjena u bubrežnom tkivu, ELISA je korištena za otkrivanje serumskih IL-1 , IL{{17} }, i nivoi TNF-a, a Western blot je korišten za otkrivanje bubrežnog tkiva. Ekspresija proteina JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3. Rezultati Ukupno 699 komponenti je detektovano UHPLC-QE-MS tehnologijom. Nakon skrininga, dobijeno je 16 ključnih komponenti CPhG i 323 povezana cilja. CPhG i DKD su dijelili 99 meta. Ključni ciljevi su bili STAT3, SRC, EGFR, itd. Analiza KEGG puta je pregledala 151 signalni put, pokazujući da signalni put IL-17, signalni put PI3K/Akt, signalni put TNF, itd. mogu igrati ključnu ulogu u tretman DKD od strane CPhG. CPhG mogu povećati tjelesnu težinu DKD štakora (P<0,01), smanjiti potrošnju vode (P<0,01), regulisati metabolizam glukoze i lipida, smanjiti 24-UTP i BUN nivoe (P＜0,01) i poboljšati bubrežno tkivo . Patološko oštećenje smanjilo je ekspresiju proteina p-JAK2/JAK2 i p-STAT3/STAT3 u bubrežnom tkivu (P<0,01) i povećalo ekspresiju proteina SOCS3 (P<0,01). Zaključak CPhG intervenišu u DKD kroz više komponenti, više meta i višestrukih puteva, moguće inhibicijom JAK2/

STAT3 signalni put.

Ključne riječi: Cistanche feniletanol glikozid; dijabetička nefropatija; UHPLC-QE-MS; mrežna farmakologija; eksperiment na životinjama; JAK2 /STAT3 signalni put

KOLIKO JE TREBA DA CISTANCHE proradi KOD BUBREŽNIH BOLESNIKA?

Dijabetička bolest bubrega (DKD), kao jedna od najvažnijih mikrovaskularnih komplikacija dijabetesa, nije samo primarni faktor koji dovodi dohronična bolest bubregaali i glavni uzrok završnog stadijuma bubrežne bolesti (ESRD) širom svijeta. Razlog [1-2]. Klinički tretman DKD-a uglavnom uključuje prvo kontrolu šećera u krvi, krvnog pritiska i lipida u krvi, i drugo, zaštitu bubrežne funkcije, izbjegavanje upotrebe nefrotoksičnih lijekova i poboljšanje načina života [3-4]. Međutim, zbog složene patogeneze DKD i nedostatka specifičnih ciljeva intervencije, trenutne mogućnosti liječenja imaju ograničenja i nisu efikasne. Incidencija DKD u završnoj fazi još uvijek raste. Stoga je od velikog značaja pronaći efikasne prirodne lijekove.

Cistanche Deserticola Y. C． Ma orCistanche C.Osušene mesnate stabljikeCistanche tubulosa (Schenk) Wightsa ljuskavim listovima [5] prvi put su zabilježeni u "Shen Nong's Materia Medica" i navedeni su kao vrhunski. Poznati su kao "pustinjski ginseng" [6]. Slatke su, slane i tople. , vraća se u meridijane bubrega i debelog crijeva, te djeluje na hranjenje bubrežnog janga, obnavljanje esencije i krvi, vlaženje crijeva i laksativ. Istraživanja pokazuju da su feniletanoidni glikozidi (CPhG) jedan od njegovih glavnih aktivnih sastojaka i odgovorni za njegov razvoj.

Materijalna osnova za ispoljavanje farmakoloških efekata; Ekstrakt cistanche ima antidijabetičko [7-8], rak jetre [9], zaštitu bubrega [10-11], neuroprotektivno [12-13] i druge farmakološke efekte, ali trenutno CPhGs nisu efikasni u liječenju DKD. Njegovi efekti i mehanizmi nisu jasni.

Ova studija koristila je mrežnu farmakologiju i metode molekularnog spajanja [14], uzimajući CPhGs kao objekt istraživanja, predviđajući i analizirajući njegove glavne aktivne sastojke i potencijalne ciljeve za liječenje DKD, a zatim uspostavljajući kombinaciju visokih vrijednosti izazvanih streptozocinom (STZ). DKD model pacova hranjen lipidnom hranom korišćen je kao predmet istraživanja in vivo, kako bi se pružila referenca za kliničku ekspanziju i primjenu srodnih tretmana i daljnja istraživanja o mehanizmu djelovanja.

1 materijal

1.1 Životinje

70-sedmično stari mužjaci SD štakora sa SPF nivoom, tjelesne težine (240±20) g, kupljeni su od Centra za eksperimente na životinjama Medicinskog univerziteta Xinjiang [licenca za eksperimentalnu upotrebu na životinjama br. SYXK (nova) {{4} }], na Životinje su adaptivno uzgajane 1 sedmicu na temperaturi od (22 ±2) stepena, relativnoj vlažnosti od 50% do 70%, i ciklusu naizmjeničnog svjetla i tame od 12 h/12 ​​h. Eksperiment je odobrio Komitet za etiku životinja Medicinskog eksperimentalnog centra za životinje Medicinskog univerziteta Xinjiang (etički broj IACUC-20220127-19).

1.2 Reagensi i lijekovi

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) je osigurao Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozin (broj serije NB2248) je kupljen od AstraZeneca, UK. Hrana sa visokim sadržajem šećera i masti (kat. br. Boaigang-B1135DM) i STZ (serija br. 2021110307) kupljeni su od Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; mikroalbumin u urinu (serija br. 20220611), azot uree (serija br. 20220626), mokraćna kiselina (serija br. 20220613), ukupni holesterol (serija br. 20220615), trigliceridi (broj serije 20220615), lipo2220616 high-tecpro1616 ), a lipoprotein niske gustine (broj serije 20220615) kupljen je od Nanjing Jiancheng Bioinženjering instituta; interleukin-6 (IL-6, serija broj JL20896), interleukin{19}} (IL-1, serija broj JL20884) i faktor nekroze tumora- (TNF-, serija broj 13202 ) kupljeni su od Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; JAK2 zečje poliklonsko antitijelo (serija broj 22v9316), p-JAK2 zečje poliklonsko antitijelo (serija broj 78g9360), STAT3 zečje poliklonsko antitijelo (serija broj 15x8824), p-STAT3 zečje poliklonsko antitijelo zeca 74m3 (polyclon polyclon antibody 74m3) puno broj 31d4841) svi su kupljeni od Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; HRP-obilježeno kozje anti-zečje IgG poliklonsko antitijelo (serijski broj 20000758) kupljeno je od Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -aktinsko zečje monoklonsko antitijelo (broj serije AC230205001), RIPA pufer za lizu (broj serije 20220416), kompleti za određivanje koncentracije proteina BCA (broj serije 20230401) kupljeni su od Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Instrumenti

Vanquish tečna hromatografija ultra visokih performansi, Q Exactive Focus maseni spektrometar visoke rezolucije, Heraeus Fresco17 centrifuga, FC automatski čitač mikroploče (Thermo Fisher Scientific, SAD); JXFSTPRP-24 mlin (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV mjerač čiste vode (Njemačka Merck Millipore Company); ACQUITY UPLC BEH C18 kolona (1,7 μm, 2,1 mm×100 mm) (American Waters Company); Accu Chek Performa mjerač glukoze u krvi (švicarska kompanija Roche); CM1850UV kriostat, DM300 uspravni fluorescentni mikroskop (kompanija Leica, Njemačka); GL-88B vortex metar (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektronska analitička vaga (Bio-Rad Company, SAD).

2 metode

2. 1 UHPLC-QE-MS analiza

2.1.1 Priprema testnog rastvora

Izvagati 100 mg CPhGs, dodati 500 μL 80% metanola, vorteksirati 30 s, ultrazvukom u kupatilu s ledenom vodom 1 h, ostaviti da stoji na -40 stepenu 1 h, centrifugirati na 4 stepena , 12 000 r/min 15 min, aspirirajte supernatant, 0. Filtrirajte kroz mikroporoznu membranu od 22 μm i čuvajte u frižideru na -80 stepeni.

2.1.2 Uslovi hromatografije

ACQUITY UPLC BEH C18 kolona (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); mobilna faza acetonitrila (A) -1% mravlje kiseline (B), gradijent eluiranja (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 do 12 min, 75% do 98% A; 12 do 14 min, 98% A; 14 do 14,1 min, 98% do 15% A; Zapreminski protok 0 . 5 mL/min; temperatura kolone 35 stepeni; zapremina injekcije 5 μL.

2.1.3 Uslovi masene spektrometrije

full-scan ddMS2 full scan mod; zapreminski protok gasa omotača 45 arb; zapreminski protok pomoćnog gasa 15 arb; temperatura kapilara 400 stepeni ; energija sudara u NCE modu 15% ~ 30% ~ 45% ciklus; napon raspršivanja ± 4,0 kV.

2.2 Mrežna farmakološka istraživanja

2. 2. 1 CPhGs

Skrining ciljnih komponenti: Sortirajte hemijske komponente analizirane pomoću UHPLC-QE-MS prema relativnom sadržaju i izbrišite one čije hemijske strukture još nisu određene. Unesite InChIKey serijski broj pregledanih sastojaka u TCMSP bazu podataka da biste dobili farmakokinetičke parametre svakog sastojka. Na osnovu uslova oralne bioraspoloživosti (OB) > 30% i sličnosti s lijekom (DL) > 0,18, kandidati koji ispunjavaju uslove će biti pregledani. Unesite SMILES broj svake komponente u bazi podataka Swiss Target Prediction da predvidite cilj i dobijete cilj hemijske komponente CPhG.

2. 2. 2 DKD

Ciljni skrining bolesti Koristite "dijabetička nefropatija" kao termin za pretragu za traženje ciljeva bolesti u bazama podataka OMIM, GeneCards i NCBI.

2. 2. 3 Izgradnja mreže komponente-cilja-bolest

Unakrsni ciljevi komponenti i bolesti CPhG-a su dobijeni putem R softverskog mapiranja, a softver Cytoscape 3.7.2 je korišten za konstruiranje komponentno-ciljnog mrežnog sistema, u kojem je dodatak za analizu detektirao ključne ciljeve.

2. 2. 4 Izgradnja mreže protein-protein interakcije (PPI)

Uvezite ciljne proteine ​​ukrštanja komponenti i bolesti u bazu podataka STRING, konstruirajte mrežu interakcije proteina i proteina (PPI), obrišite proteine ​​bez povezanih čvorova u mreži i postavite nivo pouzdanosti najniže ocjene interakcije proteina na {{1} }.700. Konstruirajte PPI mrežu, preuzmite rezultate u TSV formatu, uvezite ih u softver Cytoscape 3.7.2 i koristite dodatak za analizu za dalje ekraniziranje ključnih ciljeva.

2. 2. 5 GO, KEGG analiza

Koristite odjeljak Funkcionalne napomene u DAVID bazi podataka da izvršite analizu obogaćivanja na metama ukrštanja komponentnih bolesti. Prvo postavite parametre analize, unesite cilj ukrštanja u polje Gene List, odaberite službeni-gen-simbol kao identifikator cilja, odaberite Gene List kao tip podataka (Vrsta liste) i odaberite "Homo Sapiens (Vrste)" kao ciljni izvor (vrsta). Race)", započnite analizu nakon potvrde parametara analize, dobijete rezultate GO i KEGG analize, a zatim koristite ImageGP online platformu za crtanje da nacrtate balon dijagram rezultata KEGG i GO analize. Softver Cytoscape 3.7.2 konstruiše komponentu -taget-pathway mrežna slika.

2. 2. 6 Molekularno spajanje

Prvo preuzmite 3D strukturni dijagram aktivnog sastojka u SDF formatu iz baze podataka PubChem, zatim preuzmite 3D strukturni dijagram mete raskrsnice u PDB formatu iz američke Globalne baze podataka o proteinima (PDB) i na kraju ga prenesite na CB-Dock web stranica za molekularno spajanje. Pregledajte dominantne konformacije pristajanja i vizualizirajte ih pomoću Pymola.

2.3 Eksperimenti na životinjama

2.3.1 Modeliranje, grupisanje i primjena lijekova

10 pacova je nasumično odabrano kao normalna grupa i hranjeno običnom hranom, a preostali pacovi hranjeni su hranom sa visokim sadržajem šećera i masti. Nakon 6 sedmica, dobili su jednokratnu intraperitonealnu injekciju od 30 mg/kg STZ (0,1 mmol/L STZ otopljenog u pH 4,5 natrijum citratnog pufera), a 72 sata kasnije uzeta je krv iz repne vene. za otkrivanje glukoze u krvi natašte (FBG). Ako je FBG veći ili jednak 16,7 mmol/L, model dijabetesa je uspješno uspostavljen [15]; nastaviti Hranili su se hranom sa visokim sadržajem šećera i masti 2 sedmice. DKD modeliranje je utvrđeno kao uspješno na osnovu pozitivnog nivoa glukoze u urinu i 24-satnog ukupnog proteina u urinu (24-UTP) većeg ili jednakog 20 mg. Među njima, 3 su umrla tokom procesa modeliranja, a 7 je bilo neuspješno. , ukupno 50 je bilo uspješnih. Pacovi koji su uspješno modelirani su nasumično podijeljeni u modelsku grupu, grupu dapagliflozina (1 mg/kg) i grupe sa visokim, srednjim i niskim dozama CPhG (500, 250, 125 mg/kg). Svaka grupa davana je intragastrično. Pacovima u normalnoj grupi i modelnoj grupi davani su odgovarajući lijekovi, a pacovima u normalnoj grupi i modelnoj grupi davana je ista količina normalnog fiziološkog rastvora putem sonde, jednom dnevno tokom ukupno 6 sedmica. Tokom perioda davanja, pacovi u svakoj grupi osim normalne grupe su nastavili da dobijaju hranu sa visokim sadržajem masti.

2.3.2 Detekcija biohemijskih indikatora

Nakon 6 sedmica CPhG intervencije, pacovima je sakupljen 24-satni urin i mjeren je 24-satni ukupni protein u urinu (24-UTP); krv je uzeta iz vene repa natašte da bi se otkrili nivoi FBG; krv je uzeta iz abdominalne aorte, 4 stepena, 1500 o/min. Centrifugirajte 10 minuta da biste odvojili serum i otkrili dušik uree u serumu.

BUN), mokraćne kiseline (UA), ukupnog holesterola (TC), triglicerida (TG), lipoproteina visoke gustine (HDL), lipoproteina niske gustine (lipoproteina niske gustine LDL).

2.3.3 Promatranje patološke morfologije bubrežnog tkiva

Pacovi su anestezirani natrijum pentobarbitalom i žrtvovani. Bubrezi su oguljeni, izvagani, fiksirani sa 4% paraformaldehida, dehidrirani, providni, umočeni u vosak, ugrađeni i izrezani za bojenje hematoksilin-eozinom (HE).

Nakon bojenja po Massonu, morfologija tkiva je promatrana pod mikroskopom, a softver Image-Pro Plus 6.0 je korišten za analizu integrirane optičke gustine i kvantifikaciju relativne površine kolagenih vlakana.

2. 3. 4 ELISA

Metoda je korištena za otkrivanje nivoa serumskih inflamatornih faktora kod pacova. Nivoi IL-6, IL-1 i TNF- su detektovani prema uputstvima kompleta.

2. 3. 5 Western blot metoda za detekciju srodne ekspresije proteina

Uzeto je tkivo bubrega pacova, dodat je RIPA lizat za ekstrakciju ukupnog proteina, a koncentracija je određena BCA metodom.

Nakon elektroforeze natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel, transfer na PVDF membranu, i nakon blokiranja, JAK2 (1:2000), p-JAK2 (1:1000), STAT3 (1:2000), p -STAT3 (1:2000), SOCS3 (1:2000), -aktin (1:2000) antitela, inkubirati na 4 stepena preko noći, dodati HRP-obeleženo IgG sekundarno antitelo (1:5000) i inkubirati na sobnoj temperaturi 1 h, razvijeno sa kompletom za elektroluminiscenciju, izložiti pomoću proteinskog gela, koristeći softver Image J

Kvantitativna analiza komada. Koristeći -aktin kao internu referencu, odnos sive vrijednosti ciljne trake i interne referentne trake je relativna ekspresija proteina.

2.4 Statistička analiza

Podaci su obrađeni softverom SPSS 25.0, a podaci su izraženi kao (x±s). Za poređenje između grupa korištena je jednosmjerna analiza varijanse. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.