Antioksidativni i antikoagulantni efekti fenilpropanoidnih glikozida

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a, Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,

SAŽETAK

Holoparazitske biljke Orobanchaceae, uključujući Cistanche, Orobanche i Phelipanche spp, poznate su po svom bogatstvu fenilpropanoidnih glikozida (PPG). Utvrđeno je da mnoga PPG jedinjenja posjeduju širok spektar aktivnosti, kao što su antimikrobna, protuupalna, antioksidativna i poboljšavaju pamćenje. Kako bismo bolje istražili potencijal bioaktivnosti europske biljčice (O Caryophyllaceae – OC, P Arenaria – PA, P Ramos – PR) i deset pojedinačnih izolovanih fenilpropanoidnih sastojaka, istražili smo njihovo antiradikalno djelovanje, zaštitni učinak od oksidacije u plazmi in vitro sistemu i utjecaj na parametre koagulacije. Testirani ekstrakti su pokazali aktivnost čišćenja od 50-70 posto snage Troloxa. Ekstrakt OC, bogat akteozidom, imao je preko 20 posto bolji antiradikalni potencijal od PR ekstrakta koji je jedini sadržavao PPG bez B-prstena kateholnog dijela u acilnoj jedinici. Štaviše, otkriveno je da je samo osam testiranih PPG-a pokazalo antioksidativni potencijal u ljudskoj plazmi tretiranoj sa H2O2/Fe; međutim, tri testirana PPG-a posedovala su i antikoagulantni potencijal pored antioksidativnih svojstava. Čini se da je struktura PPG-a, posebno prisustvo acilnih i kateholnih dijelova, uglavnom povezana s njihovim antioksidativnim svojstvima. Antikoagulantni potencijal ovih jedinjenja je takođe povezan sa njihovom hemijskom strukturom. Odabrani PPG pokazuju potencijal za liječenje kardiovaskularnih bolesti povezanih s oksidativnim stresom.

Fenilpropanoidni glikozidi iz Cistanchea: antioksidativni stres

1. Uvod

Oksidativni stres je nadaleko poznat po svom negativnom utjecaju na zdravlje živih organizama, uključujući ubrzano starenje i neke vrste raka. Pojava oksidativnog stresa povezana je s poremećenom ravnotežom između oksidativnih i antioksidativnih mehanizama (uključujući enzimsku (katalaza, glutation peroksidaza) i neenzimsku (glutation) odbranu) u stanicama organizma [1]. Prekomjerna proizvodnja reaktivnih vrsta kisika (ROS), uključujući oksidirajuće radikale i vrste zatvorene ljuske, jedan je od glavnih mehanizama za stvaranje oksidativnog stresa. Međutim, biološki efekat izazvan ROS u velikoj meri zavisi od koncentracije, vremena izlaganja i lokacije. U normalnim uvjetima (niska koncentracija), kisik/dušik radikali mogu igrati ulogu sekundarnih glasnika, ali na višem nivou mogu početi reagirati s biološkim strukturama, poput ćelijske membrane [2]. Među svim vrstama ROS, hidroksilni radikal (HO.) uzrokuje jednu od najvećih oštećenja bio-makromolekula: proteina, lipida i DNK. Poznato je da oksidativni stres igra važnu ulogu u nizu bolesti, uključujući kardiovaskularne. Poremećaji krvnog sistema su u korelaciji i/ili prethodili promenama različitih parametara hemostaze i biomarkera u plazmi [1,3].

S druge strane, mnoge prirodne tvari, kao što su polifenoli i polinezasićene masne kiseline, identificirane su kao moćni antioksidansi koji mogu spriječiti stvaranje i/ili smanjenje reaktivnih vrsta kisika. Jedinjenja s takvim svojstvima nalaze se u mnogim prehrambenim proizvodima i farmaceutskim preparatima biljnog porijekla. Prehrana obogaćena svježim povrćem i voćem, te antioksidativne terapije zasnovane na prirodnim antioksidansima, stoga se široko preporučuju jer mogu smanjiti razinu oksidativnog stresa i spriječiti različite patofiziološke procese [4,5]. Biljni polifenoli su raznolika grupa sekundarnih metabolita, među kojima značajno mjesto zauzimaju fenolne kiseline, koje su široko rasprostranjene i ispoljavaju različite biološke efekte, kao što su antimikrobno, antioksidativno i protuupalno. Fenilpropanoidni glikozidi (PPG) su esterski derivati ​​hidroksicimetne kiseline i oni su glavna/jedina klasa sekundarnih metabolita prisutnih u holoparazitskim biljkama Orobanchaceae, uključujući Cistanche, Orobanche i Phelipanche spp. Nekoliko vrsta ove porodice su ozbiljne štetočine usjeva kojih se farmeri žele riješiti na poljima (primjer Phelipanche ramosa), nekoliko se koristi u farmakologiji, dok je većina od malog značaja za ljude. Herba Cistanche se intenzivno koristi u azijskoj tradicionalnoj medicini u liječenju nedostatka bubrega i kao sredstvo za poboljšanje imuniteta i pamćenja, protiv starenja i umora [6]. Fitokemijske analize različitih istraživačkih grupa pokazale su da su fenilpropanoidni glikozidi, kao što su akteozid, ehinakozid i poliumozid, jedan od glavnih aktivnih sastojaka Herba Cistanche [7]. Nedavna studija o nekoliko vrsta metličke repice pronađene u Poljskoj od strane Jedrejek et al. [8] pokazalo je da ovaj biljni materijal ima sličan kvalitativni sastav (dominacija PPG-a), štoviše, jednak je ili čak prevazilazi Cistanche spp. u pogledu sadržaja aktivnih supstanci [8].

Ovo istraživanje je imalo za cilj procjenu antiradikalnog i antioksidativnog potencijala, kao i utjecaj na parametre hemostaze tri ekstrakta metličke repice (Orobanche caryophyllacea – OC, Phelipanche arenaria – PA i P. ramosa – PR) bogata različitim fenilpropanoidima, kao npr. kao i njihovi pojedinačni PPG sastojci. Antiradikalni kapacitet je mjeren upotrebom 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sulfonske kiseline/Trolox ekvivalenta (ABTS/TE) i 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH ) testovi. Oksidativni stres u plazma test sistemu indukovan je hidroksilnim radikalom (H2O2/Fe), zatim peroksidacijom lipida (testom reaktivnih vrsta tiobarbiturne kiseline (TBARS)) i meren je nivo proteinskih karbonilnih i tiolnih grupa. Među utvrđenim parametrima hemostaze bili su: aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTT), protrombinsko vrijeme (PT) i trombinsko vrijeme (TT).

ekstrakt cistanche: antioksidativno

2. Materijali i metode

2.1. Hemikalije

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal (DPPH), 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina (ABTS), kalijum persulfat, 6- Nabavljene su hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina (Trolox), dimetilsulfoksid (DMSO), tiobarbiturna kiselina (TBA), mravlja kiselina (LCMS kvaliteta) i H2O2 iz Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Metanol (HPLC gradijent grade) i acetonitril (LC-MS grade) su nabavljeni od Merck (Darmstadt, Njemačka). Deset fenilpropanoidnih jedinjenja testiranih u ovom radu, uključujući 2′-O-acetilakteozid (97 procenata), 2′-O-acetilpoliumozid (98 procenata), 3-O-metilpoliumozid (96 procenata), akteozid (99 procenata), arenariozid (97 posto), krenatozid (98 posto), felipozid (99 posto), poliumozid (99 posto), tubulozid A (96 posto) i wiedemannioside D (96 posto) smo prethodno izolovali iz niže navedenog biljnog materijala [ 8]. Čistoća jedinjenja je procenjena upotrebom UHPLC-PDA-MS analize. Ultračista voda je pripremljena u kući koristeći Milli-Q sistem za prečišćavanje vode (Millipore Co.). Ostali reagensi su bili analitičkog kvaliteta i obezbijeđeni su od domaćih komercijalnih dobavljača.

2.2. Biljni materijal

Cvjetnice tri vrste brusne repice, uključujući Orobanche caryophyllacea Sm., Phelipanche arenaria Pomel i P. ramosa (L.) Pomel, identificirao je prof. Renata Piwowarczyk (Univerzitet Jan Kochanowski, Kielce, Poljska) i prikupljeno iz prirodnog izvora u Poljskoj. Vaučerski primjerci (O. caryophyllacea – Chomentowek ´ (50.3349◦N, 20.4000◦E), kserotermni travnjak, parazitira Galium boreale, maj 2014; P. arenaria – Zwierzyniec, 50.3349◦N, 20.4000◦E, 50.3349◦N, 20.4000◦E Artemisia campestris, jun 2014, P. ramosa – Szewce (50,3553◦N, 22,3038◦E), polje, paraziti Solanum lycopersicum, septembar 2014) deponovani su u Herbarijumu Univerziteta Jan Kochanowski u Kielceu (KTC). Biljni materijal je liofiliziran i fino samljeven prije ekstrakcije.

cistanche ekstrakt u prahu

2.3. Priprema ekstrakta ogrlice

Biljni materijal u prahu (O. caryophyllacea (OC) – 2 g, P. arenaria (PA) – 3 g i P. ramosa (PR) – 3 g) ekstrahovan je sa 80 posto MeOH na 40 ◦C i 1500 psi (pritisak rastvarača ) koristeći ASE 200 ubrzani ekstraktor rastvarača (Dionex, Sunnyvale, CA, SAD). Ekstrakti su upareni i osušeni zamrzavanjem (Gamma 2–16 LSC zamrzivač za sušenje, Christ, Njemačka). Efikasnost ekstrakcije za OC, PA i PR bila je 55 procenata, 37 procenata i 43 procenta po težini biljnog materijala, respektivno. Zbog visokog sadržaja ugljikohidrata (podaci nisu prikazani), sirovi ekstrakti su dalje prečišćeni ekstrakcijom u čvrstoj fazi (SPE) na Oasis HLB mikro koloni (500 mg; Waters, Milford, MA, SAD). Šećeri su uklonjeni sa 1% MeOH, a zatim su jedinjenja od interesa eluirana sa 80% MeOH. Nakon uklanjanja rastvarača, ekstrakti OC, PA i PR su liofilizirani (Gamma 2–16 LSC zamrzivač za sušenje), a prinosi prečišćavanja SPE bili su 53 posto (OC), 67 posto (PA) i 51 posto (PR) .

2.4. Fitokemijske karakteristike ekstrakta metličke repice

Kvalitativne i kvantitativne analize ekstrakta metličke repice vršene su korištenjem ACQUITY UPLC sistema (Waters) spojenog na fotodiodni niz detektora (PDA) i tandem kvadrupolni maseni spektrometar (TQD-MS/MS). Liofilizirani ekstrakti OC, PA i PR otopljeni su u 50 posto metanola u koncentraciji od 0.50 mg/mL i zatim hromatografirani na BEH C18 koloni (1{ {21}}0 × 2,1 mm, 1,7 µm, vode). Kromatografski uslovi su bili sljedeći: temperatura pećnice – 25 ◦C, linearni gradijent 10→25 posto mobilne faze B (0,1 posto mravlje kiseline u acetonitrilu) u mobilnoj fazi A (0,1 posto mravlje kiseline u H2O) tokom 12 minuta, brzina protoka – 0,4 mL/min, volumen ubrizgavanja – 2 μL, UV opseg – 190–490 nm (rezolucija 3,6 nm). MS analiza je izvedena u režimu negativnih jona sa elektrosprej jonizacijom (ESI), uz korišćenje sledećih podešavanja: opseg skeniranja 100–1200 m/z; kapilarni napon 2,8 kV; konusni napon 35 V; temperatura izvora 150 ◦C; temperatura desolvatacije 450 ◦C; protok desolvatacionog gasa 900 L/h, a protok konusnog gasa 100 L/h. Prikupljanje i obrada podataka obavljeni su pomoću softvera Waters MassLynx 4.1.

Pikovi fenilpropanoidnog glikozida (PPG) identifikovani su poređenjem dobijenih LC-MS podataka sa prethodno izolovanim jedinjenjima [8]. Kvantifikacija PPG-ova u ekstraktima ogrlice bazirana je na UPLC-UV metodi sa detekcijom na 330 nm, i eksternom standardnom kalibracijom korištenjem akteozida (Sigma-Aldrich, veći ili jednak 99 posto, HPLC) kao grupnog standarda . Linearna kalibraciona kriva pripremljena je u šest koncentracija u rasponu od 1-200 ug/mL i pokazala je dobru linearnost (R2 veći ili jednak 0,999). Kvantitativni rezultati predstavljaju srednju vrijednost ± SD za tri injekcije i izraženi su u miligrama akteozidnih ekvivalenata (eq) po gramu ekstrakta (mg akteozid eq/g).

2.5. Antiradikalna aktivnost in vitro

2.5.1. ABTS test uklanjanja radikala

ABTS antiradikalni test izveden je metodom koju su opisali Kontek et al. [9], sa malim modifikacijama kako slijedi: 20 posto MeOH je korišteno za pripremu reagensa (7 mM ABTS i 4,9 mM kalijum persulfata); pripremljeni su rastvori ekstrakta OC, PA i PR, u četiri nivoa koncentracije u rasponu od 100−400 ug/mL, i Trolox rastvori, u šest koncentracija u rasponu od 10−250 ug/mL, sa 50% MeOH. Odnos uzorka prema ABTS plus radnom rastvoru bio je 1:25 (v/v). Apsorbancija na 734 nm je izmjerena nakon 30 min inkubacije u mraku pomoću UV-vis spektrofotometra (Evolution 260 Bio, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD).

Inhibicija apsorpcije (procenti) je izračunata na sljedeći način: [(Abscontrol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Trolox ekvivalenti (TE) ekstrakata brusne repice izračunati su korištenjem formule TE {{0}} M uzorak/Mstandard, gdje je m nagib pravolinijskih krivulja (inhibicija apsorpcije u odnosu na koncentraciju). TE vrijednost uzorka opisuje njegovu normaliziranu aktivnost protiv Troloxa (TEstandard =1.0). Vrijednosti IC50 za OC, PA i PR ekstrakte i Trolox postignute su eksperimentalno, zatim su izračunate iz njihovih pravolinijskih krivulja (inhibicija apsorpcije u odnosu na koncentraciju) i izražene su u ug/mL.

Analiza je izvedena u tri primjerka, a rezultati su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± standardne devijacije (SD).

Slika 1. Hemijske strukture fenilpropanoidnih glikozida pronađenih u proučavanim vrstama ogrlice. Označeni fenoli (*) korišćeni su za biološka ispitivanja u sistemu plazme.

2.5.2. DPPH test uklanjanja radikala

DPPH antiradikalni test izveden je metodom koju su opisali Jedrejek i sar. [8] i Brand-Williams et al. [10], sa malim modifikacijama i to: rastvori ekstrakata OC, PA i PR, u četiri nivoa koncentracije u rasponu od 50−250 ug/mL, i Trolox rastvori, na šest nivoa koncentracija u rasponu od 10− 250 ug/mL, pripremljeni su sa 50 posto MeOH. Omjer uzorka prema DPPH bio je 1:19 (v/v). Apsorbancija na 517 nm izmjerena je nakon 30 min inkubacije u mraku pomoću UV-vis spektrofotometra (Evolution 260 Bio).

Inhibicija apsorpcije (procenti) je izračunata na sljedeći način: [(Abscontrol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Vrijednosti Trolox ekvivalenta (TE) i IC50 testnih uzoraka izračunate su na isti način kao u ABTS testu (odjeljak 2.5.1). Test je izveden u tri primjerka, a rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD.

2.6. Osnovni rastvori testiranih biljnih jedinjenja i ekstrakata za eksperimente sa ljudskom plazmom

Osnovni rastvori testiranih jedinjenja i biljnih ekstrakata pripremljeni su u 50 posto DMSO. Konačna koncentracija DMSO u ispitivanim uzorcima bila je niža od 0,05 posto i njeni efekti su utvrđeni u svim eksperimentima.

Slika 2. UPLC-PDA hromatogrami ekstrakata brusne repice, Orobanche caryophyllacea, Phelipanche arenaria i P. ramosa.

2.7. Izolacija ljudske plazme

Ljudska krv, odnosno plazma, dobijena je od šest redovnih davalaca (muškaraca i žena nepušača) u banci krvi (Lođ, Poljska) i medicinskom centru (Lođ, Poljska). Krv je sakupljena kao rastvor CPD (citrat/fosfat/dekstroza; 9:1; v/v krv/CPDA) ili rastvor CPDA (citrat/fosfat/dekstroza/adenin; 8,5:1; v/v; krv/CPDA). Donatori nisu uzimali nikakve lijekove ili supstance koje izazivaju ovisnost (uključujući duvan, alkohol i antioksidanse) najmanje dvije sedmice prije donacije. Naša analiza uzoraka krvi obavljena je u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije za ljudska istraživanja i odobrena od strane Komiteta za etiku istraživanja u eksperimentiranju na ljudima na Univerzitetu u Lođu. Plazma je pripremljena centrifugiranjem svježe ljudske krvi na 4500x g tokom 25 minuta na sobnoj temperaturi. Koncentracija proteina je izračunata mjerenjem apsorbancije ispitivanih uzoraka na 280 nm, prema proceduri Whitaker i Granum [11].

2.8. Markeri oksidativnog stresa u ljudskoj plazmi

2.8.1. Merenje lipidne peroksidacije

Peroksidacija lipida u plazmi je kvantificirana mjerenjem koncentracije reaktivnih supstanci tiobarbiturne kiseline (TBARS). Koncentracija TBARS je izračunata pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije (ε =156,000 M− 1cm− 1). Metoda je detaljnije opisana na drugom mjestu [12,13].

2.8.2. Merenje karbonilnih grupa

Nivo karbonilnih grupa izračunat je korišćenjem koeficijenta molarne ekstinkcije (ε=22,000 M− 1 cm− 1) i izražen je kao nmol karbonil grupa/mg proteina plazme, prema Bartoszu [13 ] i Levine et al. [14].

2.8.3. Određivanje tiolne grupe

Sadržaj tiolne grupe u proteinima plazme mjeren je spektrofotometrijski pomoću SPECTROstar Nano Microplate Reader-a (BMG LABTECH, Njemačka) apsorbancijom na 412 nm sa 5,5′-ditio-bis-(2- nitrobenzojevom kiselinom). Metoda je detaljnije opisana na drugom mjestu [15–17].

2.9. Parametri hemostaze

2.9.1. Mjerenje protrombinskog vremenae (PT)

PT je određen koagulometrijski pomoću optičkog analizatora koagulacije (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Poljska) prema Malinowska et al. [18].

Tabela 1. Sadržaj fenilpropanoidnih glikozida u tri proučavana ekstrakta brumrape, Orobanche caryophyllacea (OC), Phelipanche arenaria (PA) i P. ramosa (PR).

2.9.2. Merenje trombinskog vremena (TT)

TT je određen koagulometrijski pomoću optičkog analizatora koagulacije (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Poljska), prema metodi koju su opisali Malinowska et al. [18].

2.9.3. Mjerenje aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (APTT)

APTT je određen koagulometrijski koristeći K-3002 optički koagulacijski analizator (Kselmed, Grudziadz, Poljska) prema Malinowska et al. [18].

2.10. Analiza podataka

Q-Dixon test je izveden kako bi se eliminisali nesigurni podaci. Podaci su testirani na normalnu distribuciju Shapiro-Wilkovim testom i jednakost varijanse sa Levenovim testom. Statistički značajne razlike su identificirane korištenjem ANOVA, nakon čega je uslijedio Tukeyjev test višestrukih poređenja ili Kruskal-Wallisov test. Poređenja su smatrana značajnim na p < 0.05.="" vrijednosti="" su="" predstavljene="" kao="" srednje="" vrijednosti="">

desertliving cistanche: Antioksidacija

3. Rezultati i diskusija

Deset prethodno izolovanih od nas fenilpropanoidnih glikozida [8], uključujući 2′-O-acetilakteozid, 2′-O-acetil-podijumsku stranu, 3-O-metil-podijumsku stranu, akteozid, unutrašnju arenu, krenatozid, ponos, podijumska strana, tubulozid A i tenipozid D, zajedno sa tri ekstrakta ogrlice (Orobanche Caryophyllaceae (OC), Phelipanche Arenaria (PA) i P. Ramos (PR)) trenutno su proučavani za ublažavanje oksidativnog stresa i antikoagulantna svojstva u ljudskoj plazmi sistem. Hemijske strukture testiranih fenilpropanoida prikazane su na slici 1, i, kao što se može vidjeti, svi su građeni po sličnom obrascu, sa istim/sličnim podjedinicama: hidroksitirozol, monosaharidi (glukoza, ramnoza i/ili ksiloza) i hidroksicimetna kiselina. Većina ispitivanih PPG jedinjenja zamenjena je kafeinskom kiselinom, ali se ona može zameniti kumarinskom ili ferulinskom kiselinom.

Osim pojedinačnih PPG jedinjenja, u biološku studiju su uključena i tri ekstrakta brumrape – OC, PA i PR, koji su mješavine nekoliko PPG-a i koji su ranije služili kao polazni materijal za izolaciju jedinjenja. Drugi razlog za odabir tri različite vrste bila je velika razlika u fitokemijskom profilu među njima, kao što se može vidjeti na slici 2. Detaljnije poređenje ekstrakata OC, PA i PR, uključujući kvantitativne podatke, prikazano je u tabeli. 1. Akteozid je bio glavni sastojak ekstrakta O. caryophyllacea (690 mg/g), felipozid i arenariozid su dominirali u P. arenaria (zajedno 550 mg/g), dok su poliumozid i njegov acetilirani derivat bili najvažniji metaboliti u P. Ekstrakt ramoze (zajedno 640 mg/g). Ispitani ekstrakti su se razlikovali i po ukupnom sadržaju fenilpropanoida, najveća količina je pronađena u OC (810 mg/g), nešto niža u PR (795 mg/g), a manja u PA (685 mg/g). Osim toga, vrijedno je napomenuti da je prisustvo PPG-ova s ​​drugim dijelovima osim kofeoila, kao što su kumaroil ili feruloil, otkriveno samo u ekstraktu P. ramosa, gdje su ovi spojevi činili oko jedne šestine ukupnih PPG-ova (oko 120 mg/ g) (Tabela 1).

Prethodne studije o antiradikalnoj aktivnosti fenilpropanoidnih glikozida od strane Heilmanna et al. [19] i Jedrejek et al. [8], uključujući oko 30 različita PPG kao što su akteozid, izoakteozid i krenatozid, otkrili su njegovu snažnu vezu sa strukturom acilnih dijelova (fenolna kiselina i tirozol). Općenito, modifikacija ili supstitucija kateholnog dijela acilne jedinice rezultirala je značajnim smanjenjem aktivnosti uklanjanja reaktivnih vrsta kisika (ROS) i DPPH radikala. U trenutnoj studiji, antiradikalni in vitro potencijal tri ekstrakta brumrape (OC, PA i PR) ispitan je ABTS i DPPH testovima, a rezultati su upoređivani kako međusobno, tako i sa aktivnošću pojedinačnih fenilpropanoidnih komponenti izmjerenih u naša prethodna studija [8]. Rezultati su izraženi kao Trolox ekvivalenti (TE) i IC50 vrijednosti (Tabela 2). Općenito, sva tri ekstrakta su bila dobri čistači i ABTS i DPPH radikala, ali su također uočene razlike među testiranim uzorcima (procijenjeni TE je bio u rasponu od 0.5–0.7; 1.0 je bio ekvivalent Troloxu). Aktivnost antiradikalnog čišćenja uzoraka bila je u sljedećem redoslijedu: Trolox > OC > PA > PR. Ekstrakt Orobanche caryophyllacea (IC50=155–275 µg/mL) imao je preko 20 posto veću aktivnost od ekstrakta Phelipanche ramosa (IC50=200–320 µg/mL).

Tabela 2 Antiradikalna aktivnost in vitro tri proučavana ekstrakta metličke repice (Orobanche caryophyllacea (OC), Phelipanche arenaria (PA) i P. ramosa (PR)) korištenjem ABTS i DPPH radikalnih testova

Prijavljena najveća aktivnost uklanjanja radikala ekstrakta OC može se objasniti najvećim sadržajem PPG u ovom uzorku, kao i unosom akteozida, njegovog dominantnog sastojka, koji je prema prethodnim istraživanjima [8,19] jedan od najjači hvatači slobodnih radikala među metabolitima iz ove grupe (TEDPPH=0.87; [4]). Međutim, s obzirom na međusobni odnos antiradikalne aktivnosti i sadržaja fenilpropanoida u ekstraktima OC, PA i PR, nije pronađena jednostavna korelacija između ova dva faktora (r < 0.5),="" što="" ukazuje="" na="" značajan="" unos="" kvalitativni="" profil.="" ovo="" se="" uglavnom="" odnosi="" na="" ekstrakt="" p.="" ramosa,="" koji="" se="" i="" pored="" visokog="" nivoa="" ppg="" (0.8="" g/g)="" karakterizira="" najnižom="" biološkom="" aktivnošću="" među="" ispitivanim="" uzorcima="" (te="" ~="" 0.="" 5).="" ekstrakt="" pr,="" kao="" što="" je="" gore="" spomenuto,="" bio="" je="" jedini="" uzorak="" koji="" je="" posjedovao="" fenilpropanoide="" s="" kumarinskom="" ili="" ferulskom="" kiselinom,="" tvarima="" koje="" nemaju="" dio="" katehola="" b-prstena,="" za="" koje="" se="" navodi="" da="" imaju="" smanjen="" antioksidativni="" potencijal.="" četiri="" ppg="" jedinjenja="" koja="" imaju="" modifikovanu="" kafeinsku="" kiselinu,="" uključujući="" 3-o-metilpoliumozid,="" ramozid="" a="" i="" videmaniozid="" d,="" koja="" smo="" prethodno="" testirali,="" imala="" su="" tedpph="" od="" oko="" 0.3="" [8].="" dakle,="" dosadašnji="" rezultati="" su="" u="" skladu="" i="" potvrđuju="" nalaze="" prethodnih="" antiradikalnih="" in="" vitro="" eksperimenata="" na="">

Kako Chen et al. [20] opisano je povezano sa većom sposobnošću doniranja H-a ili stabilizacijom radikala različitim funkcionalnim grupama mješavine spojeva. Identificirano je nekoliko strukturnih elemenata koji pojačavaju direktnu antioksidativnu aktivnost polifenola, posebno onih povezanih s brojem i položajem hidroksilnih grupa. Vjeruje se da aktivnost uklanjanja slobodnih radikala raste sa povećanjem broja –OH grupa. Međutim, položaj ovih grupa, u molekulu, ima još veći uticaj na ispoljenu aktivnost. Relativno stabilna potentna jedinjenja su ona koja posjeduju 3,4-dihidroksi dio u svojim strukturama, kao i ona koja posjeduju više od dvije hidroksilne grupe [21]. Hemijska struktura antioksidativne supstance omogućava razumijevanje mehanizma reakcije antioksidansa. Lopez-Munguía ´ et al. [22] zasnovano na proračunima teorije funkcionalne gustine (DFT) utvrdilo je da se antioksidativni mehanizam PPG odvija kroz sekvencijalni gubitak protona prijenosom jednog elektrona (SPLET). Međutim, Li et al. [23] pokušavaju istražiti mehanizme fenolnih fenilpropanoidnih antioksidansa, zaključili su da PPG (akteozid, forzitozid B i poliumozid) mogu biti uključeni u više puteva za ispoljavanje antioksidativnog djelovanja, pojačavajući ulogu ostataka šećera.

Istraživanja su pokazala da su antioksidansi biljnog porijekla efikasni modulatori hemostaze kod kardiovaskularnih bolesti [24–26]. Različite biljke koje se koriste u tradicionalnoj medicini sadrže značajne količine PPG-a [27,28]. Osim toga, poznato je da PPG imaju niz bioloških aktivnosti, uključujući protuupalna, antinefritska i antihepatoksična svojstva [29–33].

U svojoj nedavnoj studiji, Jedrejek et al. [8] opisao je izolaciju PPG-a iz tri poljske repice i procijenio njihovu antioksidativnu aktivnost DPPH testom. Na osnovu toga, ova studija procjenjuje da li deset odabranih PPG-ova izoliranih iz ovih biljaka može smanjiti oksidativni stres u ljudskoj plazmi tretiranoj jakim biološkim oksidansom, tj. donorom hidroksilnih radikala H2O2/Fe, i modulirati svojstva koagulacije plazme in vitro. Antioksidativna svojstva deset izolovanih PPG-a određena su prema odabranim parametrima oksidativnog stresa: nivo TBARS kao marker peroksidacije lipida, zajedno sa nivoima karbonilne grupe i tiol grupe, kao markera oksidativnog oštećenja proteina.

I nivoi peroksidacije lipida u plazmi i nivoi karbonilacije proteina u plazmi izazvani H2O2/Fe su značajno smanjeni u prisustvu osam testiranih jedinjenja, tj. akteozid, krenatozid, 2′-O-acetilakteozid, felipozid, arenariozid, tubulozid A, poliumozid i 3- O-metilpolimuozid, u svim ispitivanim koncentracijama (1, 5 i 50 µg/mL); međutim, nijedan efekat nije uočen za dva testirana jedinjenja, tj. 2′-O-acetilpoliumozid i videmaniozid D, ili bilo koji od testiranih ekstrakata u bilo kojoj koncentraciji (1, 5 i 50 µg/mL). Osim toga, nije pronađeno da nijedan od testiranih jedinjenja ili testiranih ekstrakata štiti plazmu od H2O2/Fe – izazvane oksidacije tiolnih grupa u proteinima (slike 3-5). Međutim, ispitani ekstrakti mogu biti izvor spojeva s različitim biološkim svojstvima.

cistanche stem

Po prvi put, rezultati ove studije pokazuju da osam testiranih PPG-a pokazuje antioksidativni potencijal u ljudskoj plazmi u prisustvu egzogenih reaktivnih vrsta kiseonika inhibirajući peroksidaciju lipida i karbonilaciju proteina u plazmi tretiranoj sa H2O2/Fe. Osim toga, 2′-O-acetilpoliumozid i videmaniozid D nisu pokazali takav učinak. Općenito, naši nalazi su u skladu s prethodnim in vitro eksperimentima na PPG-ovima. Heilmann et al. [19] i Jedrejek et al. [8] navode korelaciju između hemijske strukture PPG i njihovih aktivnosti. Čini se da su antioksidativna svojstva PPG-a prvenstveno povezana sa strukturom njihovih acilnih dijelova, tj. jedinice fenolne kiseline i fenilpropanoida, uključujući prisustvo i/ili modifikaciju kateholnog dijela. Na primjer, otkriveno je da videmaniozid D gubi svoj antioksidativni potencijal prema plazmi tretiranoj sa H2O2/Fe nakon zamjene svog kofeoilnog dijela feruloilnom.

Promjene u procesu koagulacije često su rezultat oksidativnog stresa; ove promjene mogu modulirati funkcije kardiovaskularnog sistema i dovesti do razvoja kardiovaskularnih bolesti [1]. Od deset biljnih jedinjenja i tri biljnih ekstrakta testiranih u ovoj studiji, tubulozid, poliumozid i 3-O-metilpoliumozid i svi testirani ekstrakti pokazali su da značajno produžavaju trombinsko vrijeme pri svim testiranim koncentracijama, tj. 1, 5 i 50 µg/mL (slika 6B). Međutim, nijedan od ovih ekstrakata, niti bilo koje od testiranih jedinjenja, nije promenio PT ili APTT (sl. 6A i C).

Tabela 3 upoređuje efekte PPG (5 µg/mL) na biomarkere oksidativnog stresa u plazmi tretiranoj sa H2O2/Fe i njihov uticaj na koagulaciju. Osam testiranih PPG-a pokazalo je antioksidativni potencijal samo u tretiranoj ljudskoj plazmi; međutim, utvrđeno je da tri testirana PPG-a posjeduju i antioksidativna svojstva i antikoagulantni potencijal. Zanimljivo je da se rezultati DPPH testa ne poklapaju sa onima dobijenim u biološkom modelu pomoću ljudske plazme tretirane sa H2O2/Fe: antioksidativni potencijal testiranih ekstrakata može biti blokiran određenim spojevima prisutnim u plazmi.

Zaključno, naši sadašnji nalazi bacaju novo svjetlo na antioksidativni potencijal i antikoagulantna svojstva PPG-a. Čini se da je struktura PPG-a, posebno prisustvo acilnih i kateholnih dijelova, uglavnom povezana s njihovim antioksidativnim i antikoagulansnim svojstvima. Odabrani PPG mogu imati potencijal za liječenje kardiovaskularnih bolesti povezanih s oksidativnim stresom. Međutim, potrebni su daljnji eksperimenti kako bi se odredile koncentracije ovih spojeva potrebnih za in vivo modele.

Cistanche biljka: antioksidans