Foto-zaštitna i antimelanogena svojstva različitih ekstrakata Kadsura Coccinea

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Sunčevo ultraljubičasto (UV) zračenje, koje karakteriziraju UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) i UVC (100-280 nm), je najkritičniji faktor okoliša koji uzrokuje rak kože i fotostarenje kao rezultat citotoksičnosti, genotoksičnosti i fototoksičnost. Konkretno, UVA i UVB zračenje čine preko 95 posto i 3 posto dnevnog UV zračenja [8]. UVA i UVB zračenje može indukovati reaktivne vrste kiseonika (ROS) indirektno ili direktno prodiranjem u epidermalne i/ili dermalne slojeve kože, što dovodi do oksidativnog oštećenja i smrti ćelija. Posljednjih desetljeća UV zračenje je postalo ozbiljna briga za zdravlje kože i još uvijek se opasno širi svijetom [9-11]. UV zračenje je direktan i dosljedan stimulans keratinocita, koji čine približno 95 posto ćelijske mase kože epidermisa. Keratinociti djeluju kao prva barijera protiv mikrobnih, kemijskih i fizičkih opasnosti i pomažu u obrani od UVA i UVB zračenja. Kada su keratinociti izloženi UVA i UVB zračenju, stvaraju se intracelularni ROS, čime se pokreće apoptoza [12-14].

Melanociti su odgovorni za proizvodnju i količinu pigmenata melanina, koji su važni igrači u biološkoj odbrani epiderme kože; njihova disregulacija može uzrokovati poremećaje hiperpigmentacije ili hipopigmentacije [15,16]. Melanociti su raspoređeni u bazalnom sloju epiderme kože, na koji takođe utiče izlaganje sunčevoj svetlosti, reaktivne vrste kiseonika (ROS) i hormoni koji stimulišu melanocite (-MSH) [17,18]. Tirozinaza, član porodice proteina bakra tipa -3, je evolucijski očuvan metaloprotein koji igra ključnu ulogu u melanogenezi i aktivnostima monofenol monooksigenaze, kateholaze i difenola. Smanjenje regulacije tirozinaze, proteina povezanog s tirozinazom-1 (TRP-1) i proteina povezanog s tirozinazom-2 (TRP-2) ima različite katalitičke efekte. TRP-1 je 5,6-dihidroksiindol-2-oksidaza karboksilne kiseline, a TRP-2 je DOPAhrom tautomeraza [19,20]. Pored toga, faktor transkripcije vezan za mioftalmozu (MITF) i cAMP-responsive element-binding protein (CREB) su faktori transkripcije koji primarno regulišu melanogenezu i kodiraju informacije o načinu i intenzitetu stimulacije [17,21]. Više studija je pokazalo da MITF i CREB putevi regulišu melanogenezu. MITF je ključni faktor u transkripciji enzima povezanih s melanogenezom i centralni regulator melanogeneze. -MSH dovodi do ekspresije MITF-a putem signalnog mehanizma koji uključuje cAMP-vezani vezujući protein (CREB). Zatim, MITF ulazi u jezgro sa M-box sekvencom (AGTCATGTGCT) kako bi promovirao transkripciju specifičnih melanogenih gena i enzima. Takođe je poznato da fosforilisani CREB stimuliše -MSH, koji se vezuje za CRE konsenzus element u Mitf promotoru da bi regulisao Mitf transkripciju [21-24].

U ovoj studiji, ekstrakti korijena KC (KCR), stabljike (KCS), lista (KCL) i ploda (KCF) su sveobuhvatno upoređeni i izvršene su višestruke procjene njihovih fotoprotektivnih i antimelanogenih svojstava.

2. Materijali i metode

2.1. Priprema KC ekstrakta

Trogodišnja biljka KC 15 uzgajana je u plastičnoj posudi od 9 L u kampusu Miryang Nacionalnog univerziteta Pusan. KC je identifikovao profesor Young Whan Choi, autor ove studije. Ovi uzorci su deponovani kao uzorci vaučera (pristupni broj KC-PDRL-1) u herbarijumu Odsjeka za hortikulturnu bionauku, College of Natural Resources and Life Science, Pusan ​​National University. Biljke su dovoljno zalijevane kompletnim hranljivim rastvorom sa nivoom provodljivosti od 1.0 mS·cm−1 i koji sadrži sledeće elemente (u me·L−1): NO3-N, 16; NH{12}}N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; i S, 4. KC haljina u luci ubrana je u decembru 2020. klasifikacijom korijena, stabljika, listova i plodova (Slika 1A). Sakupljeni uzorci su odmah liofilizirani u zamrzivaču i pohranjeni u vinilnim vrećicama na 20 ◦C do analize. Osušeni korijeni, stabljike, listovi i plodovi KC (20 g) su mljeveni u fini prah i ekstrahovani na sobnoj temperaturi etil alkoholom. Ukratko, filtracija i uparavanje EtOH ekstrakta KC izvedeni su pod sniženim pritiskom na 45 ◦C, nakon čega je uslijedila liofilizacija. Konačno, čvrsti ekstrakt (50 mg/mL) je otopljen u dimetil sulfoksidu (DMSO) za dalje eksperimente.

cistancheherba epimedium sagittatumekstrakt

2.2. Ukupni sadržaj polifenola i flavonoida u ekstraktima KC

Kao što je prethodno opisano [25], ukupan sadržaj polifenola i flavonoida u ekstraktima korijena, stabljike, lista i ploda KC mjeren je kolorimetrijskim metodama Folin-Ciocalteu (ukupni polifenol) i aluminij hlorid (flavonoid). Apsorpcija je izmjerena na 700 nm (ukupni polifenol) korištenjem Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK) i na 510 nm (flavonoid) pomoću VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, USA) Waltham, MA .

Standardne krive su konstruirane korištenjem galne kiseline (ukupni polifenol) i kvercetina (flavonoida) kao standarda, a rezultati su izraženi kao ekvivalenti galne kiseline po gramu (GAE/g) KC ekstrakta korijena, stabljike, lista i voća i ekvivalenta kvercetina po gramu (QE/g) ekstrakta korijena, stabljike, lista i voća KC.

2.3. DPPH i ABTS test

Aktivnosti uklanjanja radikala DPPH i ABTS ekstrakta korijena, stabljike, listova i ploda KC ({{0}}.5 mg/mL) mjerene su prema prethodno opisanoj metodi [25] uz male modifikacije. Ekstrakti korijena, stabljike, lista i ploda KC (0.5 mg/mL) pomiješani su sa DPPH rastvorom (60 µM) u mikropločama. Nakon što su uzorci snažno protreseni, držani su u mraku na 25 ◦C 0.5 h. Osnovni rastvori 7 mM ABTS i 2,6 kalijum persulfata pripremljeni su u destilovanoj vodi na sobnoj temperaturi u mraku 18 sati. Ekstrakti korijena, stabljike, lista i ploda KC (0,5 mg/mL) pomiješani su sa radnim rastvorom i ostavljeni da odstoje 0,5 h na sobnoj temperaturi u mraku. Apsorbancija mješavine uzoraka je praćena na 510 nm (DPPH) ili 734 nm (ABTS).

2.4. Cell Culture

Adherirani keratinociti (HaCaT) i adherirani melanociti (B16F10) inokulirani su u DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Kalifornija, SAD) otopinu kulture koja sadrži 10 posto FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) i 1 posto penicilina (Invitrogen penicillin/Invitrogen Corporation). Corporation, Carlsbad, Kalifornija, SAD) i uzgajana na 37 ◦C sa 5 posto CO2. Redovno je primećen rast adheriranih HaCaT i B16F10 ćelija, a podloga je menjana svaka dva do tri dana. Za naknadne eksperimente korištene su ćelije iz logaritamske faze rasta.

2.5. UVA i UVB zračenje

Keratinociti su bili izloženi UVA ili UVB zračenju (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Njemačka) sa 5 8 W cijevima koje emituju većinu svoje energije na vrhuncu emisije na bilo 365 nm ( UVA) ili 312 nm (UVB). Doze UVA zračenja bile su 20 J/cm2, a doze UVB zračenja bile su 50 mJ/cm2.

2.6. Mjerenje vitalnosti ćelije i citotoksičnosti putem CCK-8 i LDH analize

Za analizu vitalnosti ćelija, HaCaT keratinocitima je dodana otopina Cell Counting Kit-8 (CCK-8) iz kompleta za analizu CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i suspenzije ćelija melanoma B16F10 prema uputstvima proizvođača i inkubirane na 37 ◦C 4 h. Ukratko, 2 104 ćelije su posađene u svaku jažicu ploče 24- i inkubirane sa 5 posto CO na 37 ◦C tokom 24 h. Ukratko, 2 104 ćelije su posađene u svaku jažicu ploče sa 24-jažicom i inkubirane sa 5 posto CO na 37 ◦C tokom 24 h. Nakon 24 h inkubacije, CCK-8 reagens je dodat u svaku jažicu, a ćelije su dalje inkubirane 4 h. Komplet za otkrivanje citotoksičnosti (Roche Applied Science, Švicarska) korišten je za određivanje ekstracelularnog oslobađanja laktat dehidrogenaze (LDH) u mediju kulture keratinocita HaCaT. Apsorpcija je analizirana na 450 nm (CCK-8) i 490 nm (LDH) korišćenjem VICTOR Multilabel Plate Reader-a.

2.7. Procjena intracelularne proizvodnje ROS u keratinocitima

Intracelularni nivoi ROS-a su analizirani korišćenjem {{0}}(i-6)-klorometil-2′,7′-dihlorid-hidrofluorescein diacetat acetil estera (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Svi postupci su obavljeni prema uputama proizvođača. Ukratko, nakon tretmana drugim parcijalnim ekstraktima KC (0.5 mg/mL), keratinociti (HaCaT) su isprani fiziološkim rastvorom puferiranim fosfatom (PBS) i inkubirani sa CM-H2DCFDA (5 µM) 0,5 h u mrak. Nakon toga, stvaranje intracelularnog ROS-a vizualizirano je korištenjem Carl Zeiss fluorescentnog mikroskopa; Intenzitet fluorescencije mjeren je na osnovu fluorescentne boje (CM-H2DCFDA) pomoću protočnog citometra (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, Kalifornija, SAD).

2.8. Analiza apoptoze

Nakon izlaganja i tretmana, HaCaT keratinociti su tripsinizirani i centrifugirani. Potom je apoptoza dobijenih ćelija procenjena korišćenjem fluorescein izotiocijanata (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, USA) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, keratinociti su dva puta isprani PBS-om, a keratinociti u puferu za vezivanje aneksina su dobijeni i pomiješani sa FITC/Aneksinom V (komponenta A) i radnim rastvorom propidijum jodida (PI). Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi od 15 minuta u mraku, izmjerena je apoptoza keratinocita i izračunat je postotak apoptotičkih stanica pomoću protočnog citometra (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, Kalifornija, SAD). Signali su detektovani za kanale FL1 (FITC/Nexin V) i FL3 (PI) i ustanovljeno je bojenje markera kvadranta i tačkice obojenih ćelija.

2.9. Analiza intracelularnog sadržaja melanina i aktivnosti tirozinaze

Intracelularni sadržaj melanina i testovi aktivnosti tirozinaze mjereni su objašnjavanjem gdje se malo modificirana procedura razlikuje [24]. Melanociti su tretirani konačnom koncentracijom od 0,5 µM -MSH i 0,5 mg/mL KC drugim parcijalnim ekstraktima tokom 48 h. Pelete melanocita su lizirane sa 1 N NaOH u 10 posto DMSO na 80 ◦C tokom 1 h. Relativni sadržaj melanina određen je mjerenjem apsorbancije na 475 nm korištenjem VICTORMultilabel Plate Reader-a. Intracelularna aktivnost tirozinaze određena je mjerenjem brzine proizvodnje dopahroma korištenjem L-DOPA. Melanociti su isprani ledeno hladnim PBS-om i lizirani u PBS-u koji sadrži 1 posto (w/v) Triton X-100. Supstrat tirozinaze L-DOPA (2 mg/mL) pripremljen je u istom puferu za fosfatnu lizu. Svaki ekstrakt je stavljen u ploču sa 96-jažicom, a enzimska analiza je započeta dodavanjem otopine L-DOPA. Nakon inkubacije od 1 h, apsorbancija je izmjerena na 475 nm pomoću VICTOR Multilabel Plate Reader-a za analizu proizvodnje dopahroma. Vrijednost svakog mjerenja izražena je kao postotak kontrole. Arbutin (A, 0,5 mg/mL) je korišten kao pozitivna kontrola.

Cistancheechinacosideje inhibitor tirozinaze.

2.10. Kvantitativni PCR u realnom vremenu

Ukupna RNK je izolovana iz svake grupe melanocita pomoću RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Njemačka). Reverzna transkripcija je izvedena korištenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK velikog kapaciteta (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA), prema uputama proizvođača, kako bi se dobio prvi lanac cDNK. Nizovi su zatim korišćeni kao šabloni za kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR) koristeći Bio-Rad Chromo4TM instrument i SYBR Green qPCR master mix (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, SAD). PCR je izveden pod preddenaturacijom na 95 ◦C tokom 5 minuta, denaturacijom na 95 ◦C tokom 15 s i žarenjem na 55-58 ◦C tokom 30 s. GAPDH mRNA je korištena kao interna referenca za tirozinazu, TRP-1 i TRP-2 mRNA. Relativna vrijednost ekspresije ciljnog gena=2−∆∆CT. Prajmer sekvence su bile sljedeće: Tirozinaza-sense (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), Tirozinaza-anti-sense (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-sense (5 ′-agccccaactctgtctttttc-3′), TRP-1-anti-sense (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sense (5′- tccagaagtttgacagc ′), TRP-2-anti-sense (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sense (5′-aggtggtctcctctgacttc-3′) i GAPDH-antisense (5′-aggtggtctcctctgacttc-3′) -3′).

2.11. Western blotting

Melanociti su sakupljeni i lizirani pomoću reagensa za ekstrakciju proteina sisara (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Svi postupci su obavljeni prema uputama proizvođača. Sve koncentracije proteina određene su korištenjem Bio-Rad kompleta za analizu proteina (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD). Zatim je u proteinski supernatant dodan pufer za punjenje i pomiješan. Smjesa je kuhana 10 minuta, a proteini su odvojeni korištenjem Mini-PROTEAN Precast gelova (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD) i prebačeni na Hybond poliviniliden difluoridnu membranu (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SAD). Imunodetekcija je obavljena pomoću tirozinaze (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), fosforiliranog CREB(p-CREB 1: 1000), CREB(1:1000) i -tubulin (1:1000) (Tehnologija ćelijske signalizacije, Beverly, MA, SAD) koristeći SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Membrana je inkubirana preko noći sa primarnim antitelima na 4 ◦C. Kozje anti-zečje (IgG) sekundarno antitelo (1:5000, Cell Signaling Technology) je dodato u membranu i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 h. Proteinske trake su opažene upotrebom poboljšanog Pierce ECL western blotting supstrata (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i kvantificirane kao omjer intenziteta trake ciljnog proteina prema intenzitetu trake -tubulina.

2.12. Statistička analiza

Svi testovi su nezavisno ponovljeni najmanje tri puta. Svi statistički parametri su predstavljeni kao srednja standardna greška srednje vrednosti (SEM). Statističke analize su izvršene korištenjem jednosmjerne analize varijanse (ANOVA), nakon čega je uslijedio Dunn-ov post-hoc test. Vrijednost p < 0.01="" ili="" p="">< 0,05="" se="" smatra="">

test na flavonoide

3. Rezultati

3.1. Poređenje antioksidativnih svojstava nekoliko djelomičnih ekstrakata KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 posto) > KCF (8,7 ± 1,1 posto) (Slika 1E).

3.2. Poređenje održivih i oštećenih keratinocita tretiranih s nekoliko djelomičnih ekstrakata KC u prisutnosti UVA, UVB ili ne-zračenja

Proveli smo sljedeće eksperimente kako bismo istražili efekte KCR, KCS, KCL i KCF onkeratinocita. Prvo, svi ekstrakti su aplicirani na HaCaT keratinocite u prisustvu UVA, UVB ili ne-zračenja. CCK-8 analiza je pokazala da ekstrakti nisu značajno promijenili vitalnost keratinocita u koncentracijama od 0,5 mg/mL. Kasnije su keratinociti tretirani KCR, KCS, KCL i KCF uz prisustvo UVA ili UVB zračenja. UVA i UVB zračenje značajno inhibira vitalnost keratinocita, kao što je prikazano analizom CCK-8 na slici 2A. Međutim, otkrili smo da se održivost keratinocita ozračenih UVA i UVB zrakama povećava sljedećim redoslijedom: KCL, KCR, KCS i KCF (slika 2A). Također smo pratili oštećene keratinocite mjerenjem ekstracelularnog oslobađanja LDH. Rezultati su pokazali da UVA ili UVB zračenje značajno olakšava oslobađanje LDH; međutim, KCL, KCR, KCS i KCF značajno su oslabili oslobađanje LDH uz izlaganje UVA ili UVB zrakama tim redoslijedom (slika 2B). Navedeni eksperimentalni rezultati su pokazali da su antiproliferativni i citotoksični efekti UVA ili UVB zračenja na keratinocite ublaženi redom KCL, KCR, KCS i KCF. Značajno je da KCL može vratiti vitalnost ćelija na nivoe kontrole.

Slika 2. Vijabilnost keratinocita i citotoksični efekti KCR, KCS, KCL i KCF ekstrakta u prisustvu UVA, UVB ili ne-zračenja.

3.3. Poređenje unutarćelijske proizvodnje ROS u keratinocitima tretiranim s nekoliko djelomičnih ekstrakata KC u prisutnosti ili odsustvu UVA i UVB zračenja

Kako intracelularna proizvodnja ROS uzrokuje ozbiljno oštećenje keratinocita, oni se smatraju potencijalnim medijatorima oštećenja uzrokovanih UVA ili UVB zračenjem. Nekoliko studija sugerira da UVA ili UVB zračenje izaziva endogenu proizvodnju ROS-a [12,14]. Cilj nam je bio da utvrdimo da li je došlo do povećanja nivoa endogenih ROS u keratinocitima ozračenim UVA ili UVB zracima. Shodno tome, analizirali smo intenzitet intracelularne fluorescencije sonde CM-H2DCFDA pomoću fluorescentne mikroskopije i protočne citometrije. Kao rezultat fluorescentne mikroskopije, slike bojenja CM-H2DCFDA pokazale su blago bojenje u kontrolnim keratinocitima tretiranim KCR, KCS, KCL i KCF i značajno bojenje u keratinocitima ozračenim UVA ili UVB (Slika 3A). Prema kvantificiranim rezultatima protočne citometrije, UVA i UVB zračenje povećalo je intracelularne nivoe ROS u keratinocitima za 27,2 ± 4,5 posto i 34,1 ± 4,2 posto, respektivno, u poređenju sa onim u kontroli (5,7 ±0.2 posto ). Osim toga, slično rezultatima fluorescentne mikroskopije, potvrđeno je da je intracelularni nivo ROS potisnut ekstraktima KC redom KCL > KCR > KCS > KCF u prisustvu UVA ili UVB zračenja (slika 3B). Ovi rezultati pokazuju da nekoliko parcijalnih ekstrakata KC značajno inhibira oštećenje keratinocita smanjujući nivoe endogenih ROS.

Slika 3. Učinak ekstrakta KCR, KCS, KCL i KCF na intracelularnu proizvodnju ROS u UVA, UVB ili neozračenim keratinocitima

3.4. Poređenje apoptoze keratinocita tretiranih s nekoliko djelomičnih ekstrakata KC u prisustvu ili odsustvu UVA i UVB zračenja

Da bi se otkrila apoptoza, koja je pouzdan pokazatelj oštećenja keratinocita, keratinociti su obojeni Aneksinom V u kombinaciji s propidijum jodidom. Komplet fluorescein izotiocijanata (FITC) Annexin V/Apoptoza mrtvih ćelija korišten je za testiranje brzine apoptoze u keratinocitima. UVA i UVB zračenje je olakšalo aktivnost bojenja Aneksinom V, dok su KCR, KCS, KCL i KCF smanjili stopu aktivnosti bojenja Aneksinom V u prisustvu UVA i UVB zračenja. KCR, KCS, KCL i KCF sami (0.5 mg/mL) nisu izazvali aktivnost bojenja na Aneksin V. Kvantifikovani podaci iz protočne citometrije pokazali su da UVA i UVB zračenje povećava nivo apoptoze keratinocita za 46,3± 1,5 posto i 48,7 ± 1.0 posto, respektivno, u poređenju sa kontrolnom (5.0 posto ± 0.7 posto). Važno je da je potvrđeno da je nivo apoptoze potisnut KC ekstraktima redom KCL > KCR > KCS > KCF u prisustvu UVA ili UVB zračenja (slika 4A,B). Sve u svemu, UVA i UVB zračenje izazvalo je oštećenje keratinocita, a nekoliko djelomičnih ekstrakata KC-a oslabili su oštećenja keratinocita izazvana UV zračenjem.

Slika 4. Uticaj ekstrakata KCR, KCS, KCL i KCF na apoptozu u UVA, UVB ili neozračenim keratinocitima.

3.5. Poređenje intracelularnog sadržaja melanina i aktivnosti tirozinaze melanocita tretiranih s nekoliko djelomičnih ekstrakata KC u prisustvu ili odsustvu tretmana -MSH

Prije istraživanja biološkog potencijala KCR, KCS, KCL i KCF na melanogenezu izazvanu MSH, procijenjena je vitalnost ćelija nakon tretmana KCR, KCS, KCL i KCF (0.5 mg/mL) pomoću CCK-8 test u melanocitima B16F10 sa ili bez -MSH. KCR, KCS, KCL i KCF (0,5 mg/mL) nisu promenili vitalnost ćelija u prisustvu ili odsustvu -MSH (Slika 5A). -MSH je važan melanogeni agens koji može povećati intracelularni sadržaj melanina vezivanjem za melanokortin 1 receptor i aktiviranjem adenilat ciklaze. Da bi se istražio uticaj KCR, KCS, KCL i KCF na melanogenezu u melanocitima, vizuelnim posmatranjem i biohemijskim merenjima određen je sadržaj intracelularnog melanina. Kao što je prikazano na slici 5B, intracelularni sadržaj melanina je značajno povećan za -MSH. Međutim, zajednički tretman sa KCR, KCS, KCL i KCF pokazao je značajno smanjenje intracelularnog sadržaja melanina u poređenju sa tretmanom -MSH. Redoslijed biohemijskih mjerenja koja ukazuju na inhibiciju intracelularnog sadržaja melanina bio je sljedeći: KCL > KCR > KCS > KCF (slika 5B). Intracelularni test aktivnosti tirozinaze izveden je prema intracelularnom testu sadržaja melanina. Intracelularna aktivnost tirozinaze melanocita stimulisanih -MSH se povećala, dok je melanocita stimulisanih -MSH tretiranih KCR, KCS, KCL i KCF smanjena. Redoslijed biohemijskih mjerenja koja ukazuju na inhibiciju intracelularne tirozinaseaktivnosti bio je sljedeći: KCL > KCR > KCS > KCF (slika 5C). Ovi rezultati pokazuju da nekoliko parcijalnih ekstrakata KC značajno smanjuje sadržaj intracelularnog melanina i inhibira aktivnost tirozinaze bez promjene vitalnosti stanica.

3.6. Poređenje nivoa transkripcije i translacije tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 u melanocitima tretiranim s nekoliko djelomičnih ekstrakata KC u prisustvu ili odsustvu-MSH tretman

Da bi se istražio efekat KCR, KCS, KCL i KCF na smanjenje nivoa ekspresije proteina i mRNA markera melanogeneze (tirozinaze, TRP-1 i TRP-2), melanociti su tretirani KCR , KCS, KCL i KCF u prisustvu ili odsustvu -MSH. Kao što je prikazano na slici 6A-C, nivoi mRNA tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 su značajno povećani tretmanom -MSH. Nasuprot tome, u poređenju sa tretmanom -MSH, KCR, KCS, KCL i KCF smanjili su ekspresiju mRNA tirozinaze, TRP-1 i TRP-2. Osim toga, KCR, KCS, KCL i KCF sami nisu imali značajan uticaj na nivoe mRNA tirozinaze, TRP-1 i TRP{11}}. Western blot analiza je izvedena u saradnji sa PCR u realnom vremenu. Rezultati su pokazali da -MSH tretman povećava nivoe ekspresije proteina tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 i da su ti nivoi smanjeni zajedničkim tretmanom sa KCR, KCS, KCL i KCF (Slika 6D ). Slijed kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu i western blotiniranja inhibicije tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 mRNA i ekspresije proteina bio je sljedeći: KCL > KCR=KCS > KCF (Slika 6). Ovi rezultati sugeriraju da nekoliko djelomičnih ekstrakata KC ima potencijal da promovira anti-melanogenezu, što se pokazalo smanjenjem regulacije markera melanogeneze.

3.7. Poređenje MITF ekspresije i CREB fosforilacije melanocita tretiranih s nekoliko parcijalnih ekstrakata KC u prisustvu ili odsustvu -MSH tretmana

Tirozinaza, TRP-1 i TRP-2 su neophodni u melanogenezi. Njihova ekspresija je regulisana MITFekspresijom i CREB fosforilacijom [17,21]. Western blot analiza je pokazala da KCR, KCS, KCL i KCefikasno inhibiraju povećanje nivoa proteina MITF-a uzrokovano tretmanom -MSH. Osim toga, samo KCR, KCS, KCL i KCF teško su otkrili ekspresiju MITF proteina. Slijed kvantificiranih western blot rezultata koji ukazuje na inhibiciju nivoa ekspresije MITF proteina bio je sljedeći: KCL > KCR > KCS > KCF (slika 7A). Štaviše, KCR, KCS, KCL i KCF preokrenuli su efekte tretmana -MSH na fosforilaciju CREB. KCR, KCS, KCL i KCF sami su imali mali uticaj na CREB fosforilaciju. Redosled kvantifikovanih western blot rezultata koji ukazuje na inhibiciju nivoa fosforilacije CREB bio je sledeći: KCL > KCR > KCS > KCF (Slika 7B). Ovi rezultati su pokazali da je nekoliko parcijalnih ekstrakata KC potisnulo melanogenezu u melanocitima, barem djelomično, kroz MITF ekspresiju i CREB fosforilaciju.

4. Diskusija

Popularnost izbjeljivanja kože raste širom svijeta zbog povećanja UV zračenja, a vjerovatno će dostići velike razmjere u narednim decenijama u estetske svrhe [8]. Brojne vrste izbjeljivača, poput kojične kiseline i arbutina, koriste se na kozmetičkom i farmaceutskom tržištu. Štaviše, prirodnim ekstraktima se posvećuje sve veća pažnja zbog njihovog potencijalnog antioksidativnog, protuupalnog, antitumorskog, antibakterijskog i drugih aktivnosti [26,27]. Na osnovu karakteristika antioksidansa i fotoprotektivne i antimelanogeneze, razvijeno je nekoliko kozmetičkih i farmaceutskih kandidata. Dobro je poznato da su ova svojstva kandidata za izbjeljivanje nezamjenjivi doprinos kozmetičkom i farmaceutskom istraživanju i razvoju [28]. TDM ima višekomponentna i višeciljna svojstva i uvelike poboljšava ljudsku biološku efikasnost i kvalitet života [29]. Moderna fitokemijska istraživanja pokazuju da KC sadrži različite sastojke, pri čemu su glavni sastojci lignani i terpenoidi [30]. Identificirano je više od 202 jedinjenja, uključujući dibenzociklooktadien lignane, spirobenzofuranoid dibenzociklooktadien lignane, arilnaftalenske lignane, kadlongilakton triterpenoide i seskviterpenoide [31,32]. Osušeni korijeni, stabljike i listovi KC imaju široku tradiciju upotrebe u TDM-u za liječenje reumatoidnog artritisa, duodenalnog čira, gastrointestinalnih poremećaja i ginekoloških problema. Osušeni korijeni KC, s djelovanjem čišćenja topline i eliminacije toksina, izazivaju diurezu za uklanjanje edema. Plodovi KC se najčešće konzumiraju u obliku svježeg voća, sokova i voćnog vina, što ukazuje da su korisni za zdravlje ljudi [7,33,34]. Prethodna istraživanja su također pokazala da je bogat bioaktivnim sastojcima kao što su lignani, triterpenoidi, flavonoidi, fenolne kiseline, steroidi i aminokiseline, koje imaju visoku nutritivnu i medicinsku vrijednost [3,35]. U ovoj studiji ekstrahovani su različiti delovi KC. Primjetno je da je ukupni sadržaj polifenola i flavonoida u listovima i korijenu KC bio mnogo veći nego u stabljikama i plodovima. Listovi i korijenje sadrže više nego dvostruko više polifenola i flavonoida nego stabljike i plodovi. Kao rezultat toga, smatramo da ukupni polifenoli i flavonoidi daju značajan doprinos fotoprotektivnim i antimelanogenim efektima KC.

Kožna fototoksičnost uzrokovana UV zračenjem prvenstveno je posljedica ćelijske citotoksičnosti, intracelularne akumulacije ROS-a i apoptoze u keratinocitima. Stoga je razumnije fokusirati se na inhibiciju ćelijske citotoksičnosti, intracelularne akumulacije ROS i apoptoze u keratinocitima ozračenim UVA i UVB [36,37]. Kao što je opisano u ovoj studiji [10,38], intervencija sa ekstraktima KC na fotocitotoksičnost (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) pokazala je da ekstrakti KC značajno smanjuju citotoksičnost ćelije, intracelularnu akumulaciju ROS i apoptoza. U skladu sa prethodnim rezultatima, foto-zaštitni efekti listova i korena KC bili su mnogo veći od efekata stabljike i ploda. Nadalje, naši rezultati su pokazali da KC ekstrakti pokazuju gore navedene efekte promicanjem antioksidativne aktivnosti. Melanogeneza se često opaža nakon UV zračenja i prvenstveno je povezana s pigmentacijom ili hiperpigmentacijom [39]. Prema dosadašnjim istraživanjima, metoda izazivanja melanogeneze korištenjem -MSH je široko priznata i primijenjena. Stoga je ova studija zasnovana na konstrukciji modela melanocita stimulisanog -MSH [24,39]. Otkrili smo da ekstrakti KC potiskuju -MSH-stimulirani intracelularni sadržaj melanina i aktivnost tirozinaze. Osim toga, KC ekstrakti su smanjili transkripciju i translaciju markera melanogeneze kao što su tirozinaza, TRP-1 i TRP-2 u melanocitima stimulisanim -MSH. Nadalje, istraživali smo ekspresiju MITF proteina i fosforilaciju CREB u -MSH-stimuliranim melanocitima. Slično, u ovoj studiji smo otkrili da ekstrakti KC potiskuju -MSH posredovanu ekspresiju MITF proteina i CREB fosforilaciju u melanocitima. U skladu sa fotoprotektivnim rezultatima, antimelanogeni efekti listova i korijena KC bili su mnogo veći nego stabljike i plodova.

cistanche kriške

Za više informacija kliknite ovdje.

5. Zaključci

Sve u svemu, potencijalni fotoprotektivni i antimelanogeni efekti ekstrakta KC pronađeni su u ovoj studiji. Ekstrakt KC sa visokim sadržajem polifenola i flavonoida može imati foto-zaštitne i antimelanogene efekte na keratinocite i melanocite. Ova studija daje obrazloženje i strategiju istraživanja za kozmetičke i farmaceutske intervencije za prirodna izbjeljivačka i fotoprotektivna sredstva.