Karvedilol, adrenergički blokator, potiskuje sintezu melanina inhibirajući CAMP/CREB signalni put u ljudskim melanocitima i ex vivo kulturi ljudske kože

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1, Youngsup Song 3,*,‡ i Sung Eun Chang 1

sažetak:Kateholamini funkcionišu preko receptora vezanih za G protein, pokrećući povećanje intracelularnih nivoa od 30, 50-cikličkog adenozin monofosfata (cAMP) u različitim ćelijama. Biosinteza kateholamina i -adrenergički receptor postoje umelanociti; stoga kateholamini mogu igrati kritičnu ulogu u pigmentaciji kože. Međutim, njihovo djelovanje i mehanizmi koji posreduju u melanogenezi neljudske kože još nisu istraženi. Stoga smo ispitali potencijalni antimelanogetski efekat karvedilola, neselektivnog blokatora sa slabim 1-blokirajućim aktivnostima. Karvedilol je smanjio sadržaj melanina i ćelijsku aktivnost tirozinaze bez ugrožavanja ćelijske održivosti kod normalnog čovjekamelanocitikao i u Mel-Ab besmrtnim mišjim melanocitima. Transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF), tirozinaza, protein povezan s tirozinazom (TRP)-1 i TRP-2, smanjen s karvedilolom. Tretman karvedilolom doveo je do smanjenja regulacije proteina koji vezuje elemente fosfor-cAMPresponse (CREB). Štaviše, povećanje nivoa cAMP-a nakon tretmana forskolinom poništilo je antimelanogeno djelovanje karvedilola. Osim toga, karvedilol je značajno smanjio indeks melanina u kulturama ljudske kože zračenim ultraljubičastim zračenjem. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da karvedilol efikasno suzbija melanogenezu kod ljudimelanocitii ex vivo ljudsku kožu inhibiranjem cAMP/protein kinaze A/CREB signalizacije. Antimelanogeni efekti karvedilola imaju potencijalni značaj za kožuizbjeljivanjeagenti.

Ključne riječi:karvedilol; adrenergički blokator;sinteza melanina; cAMP/CREB signalizacija

Cistanchemože inhibirati sintezu melanina

1. Uvod

Širok spektar pigmentnih poremećaja kože ima značajan psihološki i socijalni uticaj na pacijente. Razvijeni su različiti modaliteti liječenja, uključujući sistemske i lokalne lijekove, kao i lasersku terapiju [1–3]. Međutim, rezultati su često nezadovoljavajući i česte su nuspojave, kao što su post-inflamatorna hiperpigmentacija (PIH) i hipopigmentacija nakon liječenja. Osim toga, liječenje je skupo i dugotrajno [4–6].

Kateholamini, koji uključuju dopamin, epinefrin i norepinefrin, su signalne molekule koje djeluju kao neurotransmiteri i endokrini hormoni. U koži se biosinteza i razgradnja kateholamina odvija u ljudskim keratinocitima, ali je sinteza kateholamina u melanocitima nešto drugačija [7–9]. Kateholamini funkcionišu preko receptora vezanih za G protein (GPCR). Vezivanje kateholamina za GPCR pokreće aktivaciju intracelularne adenilatciklaze, koja sintetiše 30, 50-ciklički adenozin monofosfat (cAMP) iz ATP-a [10]. Drugi glasnik cAMP ispoljava svoju aktivnost tako što veže R-podjedinicu protein kinaze A (PKA), što rezultira fosforilacijom cAMP proteina koji vezuje element (CREB). GPCR su aktivirani biaminima i peptidima, uključujući glukagon, paratiroidni hormon, sekretin i kalcitonin [10].

Antagonisti adrenergičkih receptora uključuju antagoniste -receptora i -receptora. -receptorantagonisti su podkategorisani na neselektivne, 1-selektivne i 2-selektivne agense, dok su antagonisti -receptorskih subklasifikovani na neselektivne, 1-selektivne i 2-selektivne agenti zasnovani na njihovim selektivnim blokirajućim aktivnostima. Za razliku od prve generacije neselektivnih antagonista receptora, kao što su propranolol, timolol i nadolol, karvedilol je neselektivni blokator treće generacije koji pokazuje vazodilatatorsko djelovanje blokiranjem 1-adrenoreceptora (1-AR) [11]. Stoga je karvedilol neselektivni blokator sa slabim 1-blokirajućim aktivnostima [12]. Uglavnom se koristi kao oralni lijek za kontrolu visokog krvnog tlaka i kongestivnih srčanih bolesti, slično drugim blokatorima [12]. Međutim, blokatori treće generacije pokazuju angiogene, antioksidativne, antiproliferativne, antihipertrofične i antiapoptotičke aktivnosti koje zahtijevaju daljnje razjašnjenje [11]. U dermatološkom polju, zbog svog antioksidativnog i protuupalnog djelovanja, karvedilol se često koristi u oralnim formulacijama za liječenje tematotelangiektatske rozacee [13,14]. Štaviše, antioksidativna aktivnost karvedilola dovodi do prevencije karcinogeneze kože izazvane ultraljubičastim (UV) zračenjem, što ga čini privlačnim sredstvom za upravljanje kožnim bolestima povezanim sa UV zračenjem [15–18]. Međutim, hemopreventivni efekti karvedilolara nisu direktno posredovani preko AR. [19] Iako je tačan mehanizam relativno nepoznat, cAMP/PKA i PKC-δ signalni put bi mogao biti povezan sa svojstvima karvedilola protiv metastaza na koži [20].

U ranim fazama istraživanja pigmentacije, ljudskamelanocitinađeno je da eksprimiraju -1-AR signalizaciju nakon ekstracelularne indukcije sa norepinefrinom. Međutim, -AR nisu pronađeni nakon stimulacije sa adrenergičkom signalizacijommelanociti[8]. Nasuprot tome, Cillbro et al. kasnije je pokazano da specifični funkcionalni 2-AR signal postoji u ljudskim melanocitima i da 2-ARstimulacija dovodi do pigmentacije putem 2-AR/cAMP puta [7]. Stoga je sugerirana uloga kateholamina u kontroli pigmentacije, a cAMP se smatra glavnom osovinom za kateholaminsku kontrolu melanogeneze.

Melanogeneza je složen proces koji uključuje brojne puteve. Tirozinaza, protein 1 povezan s tirozinazom (TRP-1) i TRP-2, koji se također naziva dopahrom tautomeraza (DCT), su tri glavna enzima specifična za melanocite uključena usinteza melanina[21]. Melanogenezu induciraju ili inhibiraju brojni faktori, uključujući hormone, citokine, neurotransmitere, faktore rasta i mikromolekule [21-23].

Najvažniji pozitivni regulator je melanokortin{0}} receptor i njegovi ligandi, melanokortin i adrenokortikotropni hormon [23]. Međutim, razni faktori uključeni u melanogenezu su -endorfin, estrogeni, androgeni, vitamin D3 i kateholamini [23]. Kumulativni dokazi sugeriraju da L-tirozin i L-DOPA, koji su supstrati i intermedijeri melanogeneze, djeluju kao induktori i pozitivni regulatori melanogenog puta, pored regulatora drugih ćelijskih funkcija [24]. Štaviše, Jeff Howe et al. sugerira da je indukcija i regulacija melanogeneze L-tirozinom posredovana direktnom aktivacijom adrenergičkih receptora L-tirozinom, a ne uzrokovana njegovim metaboličkim proizvodima kao što su kateholamini [25]. U njihovim studijama, norepinefrin i epinefrin stimulišu aktivnost tirozinaze, ali njihov induktivni efekat nasinteza melaninabio je relativno niži od L-tirozina [25].

Kateholamini mogu igrati važnu ulogu u sistemu pigmentacije kože; međutim, njihovi efekti na melanogenezu u odnosu na djelovanje treće generacije neselektivnih blokatora još nisu istraženi. Stoga smo u ovoj studiji imali za cilj istražiti da li karvedilol utječe na melanogenezu i istražiti njegove mehanizme djelovanja kod ljudi.melanocitii ex vivo ljudska koža i njena potencijalna upotreba kao aizbjeljivanjeproizvod.

inhibiraju stvaranje melanina saherba cistanches

2. Rezultati

2.1. Karvedilol potiskuje melanogenezu

Citotoksičnost karvedilola na normalne ljudemelanociti(NHMs) i Mel-ab ćelije procijenjene su testom proliferacije WST ćelija. Koncentracija karvedilola od 10 µM počela je pokazivati ​​citotoksičnost i na NHM i na Mel-ab ćelije (Slika 1A, B). Stoga smo u daljnjim procjenama koristili 8 µM karvedilola, koji nije citotoksičan za NHM.

Tretman karvedilolom smanjio je sadržaj melanina na način ovisan o dozi bez utjecaja na održivost NHM (slika 1C). Sadržaj melanina je smanjen za 28,36 posto nakon tretmana 96 hof 8 µM karvedilolom (slika 1C). Dodatak 100 mg/mL arbutina smanjio je sadržaj melanina u manjem stepenu nego karvedilol (slika 1C). Nakon 4 dana liječenja karvedilolom, sadržaj melanina se smanjio ovisno o vremenu (slika 1D). Međutim, tretman sa forskolinom (FSK) 4 dana nakon prethodnog tretmana karvedilolom inducira povećanje sadržaja melanina (Slika 1E). FSK povećava transkripciju MITF do najvećeg stepena nakon 2 h u NHM i vjeruje se da funkcioniše preko cAMP /PKA/CREB put (slika 1F).

2.2. Karvedilol inhibira ekspresiju MITF-a i njegovih ciljnih gena i smanjuje nivoe fosfo-CREB u NHM-ima

Budući da je karvedilol smanjio akumulaciju melanina, istražili smo aktivnost ćelijske tirozinaze. Tretman karvedilolom je smanjio aktivnost tirozinaze na dozi u NHMs (slika 2A). Aktivnost tirozinaze smanjena je za 28,48 posto nakon 96 h tretmana 8 µM karvedilolom (slika 2A). Zatim smo utvrdili da li karvedilol utiče na ekspresiju MITF-a, koji igra ključnu ulogu u regulaciji tirozinaze i nizvodnih melanogenih gena. Liječenje FSK povećalo je intracelularne nivoe cAMP i poništilo antimelanogeno djelovanje karvedilola. Karvedilol je značajno smanjio nivoe proteina MITF, centralnog transkripcionog faktora melanogeneze, na 72 h (Slika 2B). Nadalje, ekspresija njegovih ciljnih gena, kao što su tirozinaza i TRP-1, bila je smanjena nakon liječenja karvedilolom (slika 2B). Ovi rezultati pokazuju da karvedilol inhibira melanogenezu tako što smanjuje MITF signalizaciju.

Zatim smo istražili intracelularne signalne puteve melanogeneze, koji regulišu MITF transkripciju, mjerenjem nivoa ekspresije fosfo-CREB i fosfo-ERK. Nivoi fosfo-ERK se nisu mijenjali tokom vremena nakon liječenja karvedilolom; međutim, nivoi fosfo-CREB su smanjeni (slika 2B). U skladu s prethodnim zapažanjima, naši rezultati su otkrili da karvedilolin inhibira melanogenezu inhibiranjem cAMP/PKA/CREB signalnog puta. Štaviše, FSK tretman je preokrenuo anti-melanogeno djelovanje karvedilola povećanjem nivoa cAMP.

2.3. Melaninski indeks i imunohistohemijsko bojenje u Ex vivo kulturi ljudske kože

Gustoća epidermalnih melanocita i indeks melanina in ex vivo preseci tkiva kulture ljudske kože detektovani su Melan-A i Fontana-Massonovim bojenjem, respektivno. Karvedilol nije uticao na broj Melan-A ( plus )melanocitiu uzorku tretiranom karvedilolom plus UV zračenje (UVR) u poređenju sa uzorkom tretiranim samo UVR (Slika 3A). HMB45( plus )melanociti mogu ukazivati ​​na to da se aktivnost melanocita povećala nakon tretmana UVR-om i da je reverzno smanjena nakon tretmana karvedilolom (slika 3B). Međutim, sadržaj melanina je značajno smanjen u uzorcima tretiranim karvedilolom plus UVR u poređenju sa onim u uzorcima tretiranim samo UVR (Slika 3C). Za izračunavanje indeksa melanina, izračunat je i upoređen udio Fontana-Massonove mrlje na ukupnoj površini između uzorka izloženog UVR i onog karvedilolu plus UVR (Slika 3D). Ćelijski lizati svakog uzorka analizirani su Western blota testom, koji je otkrio da su tirozinaza, TRP1 i DCT povećani UVR i smanjeni tretmanom karvedilolom (slika 3E). Kao rezultat toga, karvedilol je značajno smanjio indeks melanina i proteine ​​povezane s melanogenezom, pokazujući svoj antimelanogeni učinak na UVR tretiranu ljudsku kožu.

3. Diskusija

Melanin je pigment odgovoran za boju kože i kose i sintetizira se u melanosomimamelanociti. Iako epidermalni melanin igra važnu zaštitnu ulogu od UV zračenja, proizvodnja melanina i nakupljanje u koži uzrokuje problematične hiperpigmentarne poremećaje kože, kao što su PIH, dispigmentacija povezana sa fotostarenjem, melazma i solarne lentigine [18,26]. Stoga je inhibicija melanogeneze u fokusu medicinskih i kozmetičkih tretmana za ljepotu i zdravlje kože. Uloženi su značajni napori da se identifikuju nova i učinkovita sredstva protiv pigmentacije. Međutim, mehanizmi antimelanogeneze specifičnih agenasa trenutno su neizvjesni i općenito su procijenjeni u ćelijama miša, što daje rezultate koji nisu uvijek konzistentni s onima u ispitivanjima na ljudskoj koži [27,28]. Štoviše, kako je melanogeneza melanocita strogo regulirana keratinocitima i drugim susjednim stanicama, kokultivirane ljudske ćelije ili ex vivo ljudska koža su pouzdanije eksperimentalne postavke za istraživanje učinkovitihizbjeljivanjeagensi [29]. Većina sredstava za izbjeljivanje kože, bilo prirodno ili kemijski dobivenih, mogu uzrokovati toksičnost ili iritaciju kože, što se u određenoj mjeri može predvidjeti korištenjem in vitro testova vitalnosti stanica s melanocitima. U našem istraživanju, karvedilol nije pokazao citotoksičnost kada se koristio u umjerenim dozama.

cistanche bienfaits

Hidrokinonske kreme za lokalnu upotrebu mogu dovesti do neželjenih poremećaja hipopigmentacije i toksičnosti kože [30-32]. Štaviše, nekeizbjeljivanjekozmetika ima katastrofalne posljedice izazivanjem hipopigmentacije kroz razgradnju proteina tirozinaze [33-35]. Sredstva za izbjeljivanje mogu se koristiti u većim dozama ovisno o korisniku kako bi se maksimiziralo izbjeljivanje hiperpigmentarnih lezija. Stoga se kontinuirano istražuju napori da se otkriju sigurna i zdrava sredstva za izbjeljivanje kože.

Stoga je ova studija dizajnirana da se provodi u normalnim ljudskim stanicama i ex vivo ljudskoj koži. Nadalje, na osnovu utvrđenog mehanizma djelovanja kateholamina G signalizacije, koji povećava ćelijski cAMP nivo, vjerovali smo da adrenergički blokator može smanjiti nivoe cAMP i inhibirati UVR/cAMP/CREB signalni put, što je glavni mehanizam za hiperpigmentaciju kože izazvanu UV zračenjem. [36,37]. Stoga smo pretpostavili da adrenergički blokatori koji snižavaju nivoe cAMP smanjujusinteza melanina.

Osim toga, razvijati sigurnoizbjeljivanjeagensi, pouzdani i reproducibilni mehanizmi antimelanogeneze treba da se prate paralelno. Fiziološki najznačajniji stimulus je UV, a među UVR signaliziranjem epidermamelanocitiCREB osovina je najutvrđeniji put za regulaciju melanogeneze u ljudskoj epidermi [29]. Izlaganje UV zračenju sukcesivno aktivira proizvodnju cAMP, PKA i faktor transkripcije CREB, koji zauzvrat inducira ekspresiju MITF i nizvodno ciljanih melanogenih gena [38,39]. Pored CREB fosforilacije pomoću PKA, nedavne studije su pokazale da je regrutovanje CREB reguliranog koaktivatora transkripcije (CRTC) 3 u CREB transkripcijski kompleks također potrebno za cAMP stimuliran MITF. MITF ima najvažniju ulogu u regulacijisinteza melaninai rezultirajuća transkripcija melanogenih enzima [26,40,41]. Tokom ovog procesa intracelularne signalizacije, melanogeneza je regulisana ključnim enzimom, tirozinazom i dodatnim enzimskim proteinima, kao što su TRP-1 i DCT [1–4]. U ovoj studiji, karvedilol je efikasno smanjio fosforilaciju CREB-a, što ukazuje da je smanjio MITF i proteine ​​tirozinaze inhibiranjem MITF transkripcije (Slika 4). Uzimajući u obzir da je regulacija MITF mRNA gena zamršeno kontrolirana i spašavana od strane drugih intracelularnih signalnih molekula i koaktivatora, regulacija nivoa transkripcije MITF-a je obećavajuća strategija za istraživanje zdravih sastojaka za izbjeljivanje kože jer je funkcija preživljavanja MITF-a očuvana i spašena [1,38,40]. Zaista, kada smo istraživali MITF transkripciju izazvanu FSK-om, otkriveno je da MITF mRNA ima svoju vlastitu krivulju vršnog odgovora za melanogenezu i ćelijsko preživljavanje za ćelijsku homeostazu. Biološke funkcijemelanocitičinilo se da je suštinski regulirano drugim povratnim signalima u ljudskim melanocitima. Štaviše, karvedilol ima manji rizik od nuspojava hipopigmentacije jer smanjuje aktivnost ćelijske tirozinaze tokom vremena, a ne naglo.

Kateholamini uključuju dopamin, epinefrin i norepinefrin i sintetiziraju se iz dijetalnog tirozina djelovanjem enzima [42]. Biosinteza i razgradnja kateholamina odvija se u širokom spektru ćelija, uključujući neurone simpatičkih nerava i mozga, adrenomedularne ćelije, endotelne ćelije, neutrofile i mononuklearne ćelije [43-45]. U ljudskoj koži, kateholaminska sinteza se javlja u keratinocitima. Suprotno tome, melanociti također eksprimiraju mRNA i enzime za autokrinu sintezu norepinefrina, ali ne i epinefrina [7,42]. U ljudskommelanociti, -1-AR može biti važan u reakciji na norepinefrin, alisinteza melaninaje također pod utjecajem funkcionalnog 2-ARsignalinga [7,8]. Zanimljivo je da pacijenti sa vitiligom imaju povećanu 2-AR gustinu u keratinocitima [46]. Povećani nivoi norepinefrina nalaze se u urinu i plazmi pacijenata sa nesegmentalvitiligom, što implicira da metabolizam kateholamina može biti povezan s razvojem i napredovanjem vitiliga [47]. Štaviše, pored klasičnih neurotransmitera stresa, melanociti proizvode neuropeptide i hormone, kao što su kortikotropin-oslobađajući faktor i proopiomelanokortin. Ovu proizvodnju stimuliše UVR i drugi agensi koji djeluju unutar neuroendokrinog sistema kože [48]. Stoga su djelovanje kateholamina i melanocitna funkcija usko povezani u nizu složenih puteva. Nadalje, karvedilol bi mogao ometati kemijske reakcije na melanogenom putu i tu mogućnost treba dalje proučavati. Karvedilol može imati prednosti jer ima istovremeno protuupalno djelovanje, budući da je većina hiperpigmentarnih poremećaja PIH klinički ili subklinički kod tamnoputih pacijenata. Budući da je prodiranje karvedilola kroz kožu proučavano i in vitro i ex vivo, karvedilol se može razviti kao topikalniizbjeljivanjeagent u budućnosti [49–51].

Sistemska primjena karvedilola može uzrokovati bradikardiju, vrtoglavicu, hipotenziju, glavobolju i vrtoglavicu. Lokalna primjena karvedilola obično ne uzrokuje sistemske simptome; međutim, treba obratiti posebnu pažnju na ove simptome kada ga primjenjujemo kod pacijenata s defektnom kožnom barijerom, poput onih s atopijskim dermatitisom. Štaviše, ekcem, pruritus i lihenoidna erupcija su prijavljeni u rijetkim slučajevima kada se uzima karvedilol. Ove dermatološke nuspojave, kao i kontaktni dermatitis, također treba uzeti u obzir prilikom primjene karvedilola kao lokalneizbjeljivanjeagent.

Zaključno, pokazali smo da karvedilol efikasno smanjuje melanogenezu kod ljudimelanocitii ex vivo ljudsku kožu inhibiranjem cAMP/CREB/MITF puta, što sugerira njegovu potencijalnu upotrebu kao efikasnog sredstva za izbjeljivanje. Dalje istraživanje funkcionalnog uključivanja adrenergikreceptora karvedilola u humane melanocite treba da uslijedi.

4. Materijali i metode

4.1. Materijali

Karvedilol, 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), toksin kolere (CT) i 12-Otetradekanoilforbol-13-acetat (TPA) kupljeni su od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, SAD). Dulbecco-ov modificirani Eagle's Medium (DMEM) i Dulbecco-ov fiziološki rastvor puferiran sa fosfatom kupljeni su od WelGENE-a (Daegu, Koreja). Fetalni goveđi serum (FBS), antibiotik-antimikotik i tripsin-EDTA kupljeni su od Gibco-a (Grand Island, NY, SAD). Medium 254 (CascadeBiologics, Portland, OR, SAD) i FSK ([3R-(3,4a,5,6,6a,10,10a,10b)]-5-(acetiloksi)-3-etenildodekahidro{ {24}},10,10b-trihidroksi-3,4a,7,7,10a-pentametil-1H-nafto[2,1-b]piran-1-jedan )kupljeni su od Tocris Bioscience (Bristol, UK).

4.2. Ćelijske linije i ćelijska kultura

Primarni NHM dobijeni od Invitrogena (Carlsbad, Kalifornija, SAD) održavani su u medijumu 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) dopunjenom dodatkom za rast humanih melanocita (Thermo Fisher). Mel-ab ćelije, spontano besmrtno besmrtne melanocitne ćelijske linije dobijene od miša, dobijene su iz Korean Cell Line Bank (KCLB, Seul, Koreja) i održavane u DMEM dopunjenim 10 posto FBS, penicilin-streptomicinom, 100 nM TPA i 1 CT. Sve ćelije su rutinski održavane na 37 ◦C u vlažnom okruženju od 5 posto CO2.

4.3. Antitijela i Western blots

Ćelije su jednom isprane hladnim PBS-om i lizirane u puferu za lizu proteina (1 posto SDS u 10 mMTris i 5 mM EDTA, pH 7,4), nakon čega je uslijedila inkubacija na 98 ◦C tokom 10 min. Uzorci proteina su razdvojeni elektroforezom 8% SDS-poliakrilamidnog gela, naneseni na nitrocelulozne membrane (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, USA), a zatim blokirani s Tris puferiranim fiziološkim rastvorom koji sadrži 0,5% Tween 20 i 5% BSA, i podvrgnuti imunoblotingu. Tirozinaza i TRP{14}} antitijela su kupljena od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, SAD), a MITF je kupljen od Abcam-a (Cambridge, UK). -tubulin (Gentex, Holandija, MI, SAD) korišćen je kao unutrašnja kontrola opterećenja.

4.4. Sadržaj melanina

Citotoksični efekat karvedilola je procenjen korišćenjem Ez-Cytox kompleta za ispitivanje vitalnosti ćelija (Dogen-Bio Co., Ltd., Seul, Koreja) u skladu sa uputstvima proizvođača. Mel-Ab ćelije i NHM su zasejane u ploče sa šest jažica. pri gustini od 6 × 105 i 3 × 105 ćelija/jažici, respektivno. Ćelije su tretirane karvedilolom, kao što je prikazano na slikama, 3 ili 5 dana (d). Prije mjerenja sadržaja melanina, ćelije su posmatrane pod fazno-kontrastnim mikroskopom i fotografisane (Olympus, Tokio, Japan). Ćelije su rastvorene u 550 µL 1 N NaOH na 100 ◦C tokom 30 min i centrifugirane na 13,{16}} rpm tokom 5 min. Apsorbancija supernatanta je izmjerena na 405 nm čitačem mikroploča. Intracelularni sadržaj melanina predstavljen je kao postotak u odnosu na netretiranu kontrolu ćelija. Arbutin (100 mg/mL) je korišten kao pozitivna kontrola.

4.5. Aktivnost stanične tirozinaze

Aktivnost tirozinaze je procijenjena mjerenjem brzine stvaranja dopahroma L-DOPA. Nakon inkubacije s karvedilolom, ćelije su isprane u ledeno hladnom PBS-u i lizirane u puferu za lizu tirozinaze (fosfatni pufer, pH 6,8, koji sadrži 1 posto Triton X{ {5}}) sa ponovljenim ciklusima zamrzavanja/odmrzavanja. Lizati su izbistreni centrifugiranjem na 15,{7}} rpm na 4 ◦C tokom 10 min. Nakon kvantifikacije nivoa proteina u lizatu i prilagođavanja koncentracije proteina puferom za lizu, 90 µL supernatanta pomešanog sa 10 µL 10 mM L-DOPA u puferu za lizu tirozinaze inkubirano je na 37 ◦C. 475 nm koristeći čitač mikroploče svakih 10 minuta u trajanju od najmanje 1 h. Arbutin (100 mg/mL) je korišten kao sredstvo pozitivne kontrole.

herba cistanches

4.6. Imunohistohemijska analiza

Ljudska kožna tkiva ugrađena u parafin su izrezana na 6-µm debele dijelove i obojena Melan-A (Novocastra, Newcastle, UK), Fontana-Masson setovima (ID laboratorije, London, ON, Kanada) i HMB45 (Santa Clara , CA, USA), prema uputama proizvođača. Indeks melanina je određen mjerenjem procenta obojene površine prema ukupnoj površini tkiva pomoću softvera ImageJ 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.7. Statistička analiza

Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM), a statistička značajnost je određena neparnim Studentovim t-testom korišćenjem softvera GraphPad Prism5 (San Dijego, Kalifornija, SAD). U ovoj studiji, p < 0.05,="" p="">< 0.01,="" i="" p="">< 0,001="" smatrani="" su="" statistički="" značajnim="" i="" predstavljeni="" su="" sa="" *,="" **="" i="" ***,="">

Reference

1. Gillbro, JM; Olsson, MJ Melanogeneza i mehanizmi agenasa za posvjetljivanje kože—Postojeći i novi pristupi. Int. J. Cosmet. Sci. 2011, 33, 210–221. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, YJ; Shin, HJ; Ne, TK; Choi, KH; Chang, SE Tretman melazme i post-inflamatorne hiperpigmentacije pikosekundnim 755-nm aleksandritnim laserom u azijskih pacijenata. Ann. Dermatol. 2017, 29,779–781. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, YJ; Park, JH; Lee, DY; Lee, JH Stečena bilateralna dispigmentacija na licu i vratu: klinički prikladni pristupi. J. Korean Med. Sci. 2016, 31, 2042–2050. [CrossRef] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; Lee, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Postinflamatorna hiperpigmentacija povezana s tretmanom solarnih lentigine korištenjem Q-Switched 532-nm Nd: YAG lasera: multicentrično istraživanje.J. Dermatolog. Treat. 2017, 28, 447–451. [CrossRef] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno, S.; Higashino, T.; Yoshimura, K. Prospektivna randomizirana kontrolirana studija oralne traneksaminske kiseline za prevenciju postinflamatorne hiperpigmentacije nakon Q-switched rubin lasera. Dermatol. Surg. 2011, 37, 605–610. [CrossRef] [PubMed]

6. Taylor, CR; Anderson, RR Neefikasno liječenje refraktorne melazme i postinflamatorne hiperpigmentacije rubin laserom s Q-switchedom. J. Dermatol. Surg. Oncol. 1994, 20, 592–597. [CrossRef]

7. Gillbro, JM; Marles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU Autokrina biosinteza kateholamina i signal thebeta-adrenoceptora potiču pigmentaciju u ljudskim epidermalnim melanocitima. J. Investig. Dermatol.2004, 123, 346–353. [CrossRef]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pittelkow, MR; Swanson, NN; Gardner, ML Indukcija sistema za transdukciju signala alfa-1-adrenoceptora na ljudskim melanocitima. Exp. Dermatol. 1996, 5, 20–23.[CrossRef]

9. Sivamani, RK; Shi, B.; Griffiths, E.; Vu, SM; Lev-Tov, HA; Dahle, S.; Chigbrow, M.; La, TD; Mashburn, C.; Peavy, TR; et al. Akutno ranjavanje mijenja beta2-adrenergičku signalizaciju i kateholaminske sintetičke puteve u keratinocitima. J. Investig. Dermatol. 2014, 134, 2258–2266. [CrossRef]

10. Emery, AC kateholaminski receptori: Prototipovi za otkrivanje lijekova zasnovanih na GPCR-u. Adv. Pharmacol. 2013, 68,335–356.

11. Do Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC Tri generacije beta-blokatora: istorijat, razlike u klasama i klinička primenljivost. Curr. Hipertenzije. Rev. 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. McTavish, D.; Campoli-Richards, D.; Sorkin, EM Karvedilol: Pregled njegovih farmakodinamičkih i farmakokinetičkih svojstava i terapijske efikasnosti. Drugs 1993, 45, 232–258. [CrossRef] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Izraženo crvenilo lica i uporni eritem rozacee koji se efikasno leči karvedilolom, neselektivnim beta-adrenergičkim blokatorom. J. Am. Akad. Dermatol. 2012, 67, 491–493. [CrossRef][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Dugotrajno liječenje izrazitog crvenila lica i perzistentnog eritema ofrosacee liječenjem karvedilolom. J. Dermatolog. Treat. 2018, 29, 310–313. [CrossRef] [PubMed]

15. Chang, A.; Yeung, S.; Thakkar, A.; Huang, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.; Jackson, EK; Andresen, BT; et al. Prevencija karcinogeneze kože beta-blokatorom karvedilolom. CancerPrev. Res. 2015, 8, 27–36. [CrossRef] [PubMed]

16. Chen, M.; Liang, S.; Shahid, A.; Andresen, BT; Huang, Y. Beta-blokator karvedilol spriječio je ultraljubičasto posredovano oštećenje mišjih epidermalnih stanica i 3D rekonstruirane kože čovjeka. Int. J.Mol. Sci. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

17. Huang, KM; Liang, S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Cleveland, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meyskens, FL, Jr.; Andresen, BT; Huang, Y. Lokalno primijenjen karvedilol ublažava karcinogenezu kože uzrokovanu sunčevim ultraljubičastim zračenjem. Rak Prev. Res. 2017, 10, 598–606. [CrossRef]

18. Brenner, M.; Sluh, VJ Zaštitna uloga melanina od UV oštećenja u ljudskoj koži. Photochem.Photobiol. 2008, 84, 539–549.

19. Cleveland, KH; Liang, S.; Chang, A.; Huang, KM; Chen, S.; Guo, L.; Huang, Y.; Andresen, BT Carvedilolinhibira formiranje kolonija JB6 P plus posredovano EGF-om putem mehanizma neovisnog o adrenoceptorima. PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [CrossRef]

20. Dzong, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Karvedilol potiskuje migraciju i invaziju malignih ćelija dojke inaktivirajući Src koji uključuje cAMP/PKA i PKCdelta signalni put. J. Cancer Res. Ther.2014, 10, 998–1003.

21. Rzepka, Z.; Bussman, E.; Beberok, A.; Wrzesniok, D. Od tirozina do melanina: Signalni putevi i faktori koji reguliraju melanogenezu. Postepy Hig. Med. Dosw. Online 2016, 70, 695–708. [CrossRef]

22. Kim, Y.; Cho, JY; Oh, SW; Kang, M.; Lee, SE; Jung, E.; Park, YS; Lee, J. Globularni adiponektin djeluje kao melanogeni signal u ljudskim epidermalnim melanocitima. Br. J. Dermatol. 2018, 179, 689–701. [CrossRef][PubMed]

23. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentacija melanina u koži sisara i njena hormonska regulacija. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

24. Slominski, A.; mr Zmijewski; Pawelek, J. L-tirozin i L-dihidroksifenilalanin kao hormonski regulatori funkcija melanocita. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

25. Howe, J.; Costantino, R.; Slominski, A. O pretpostavljenom mehanizmu indukcije i regulacije melanogeneze L-tirozinom. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150–152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signalizacija puteva u melanogenezi. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef]

27. Jung, JA; Kim, BJ; Kim, MS; Ti, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; Park, SH; Kim, DW Zaštitni učinak botulinum toksina protiv pigmentacije kože izazvane ultraljubičastim zračenjem. Plast. Reconstr. Surg. 2019, 144, 347–356.[CrossRef]

28. Jeong, YM; Oh, WK; Tran, TL; Kim, WK; Sung, SH; Bae, K.; Lee, S.; Sung, JH Aglikon od Rh4 inhibira sintezu melanina u B16 ćelijama melanoma: Moguća uključenost na put protein kinaze A. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2013, 77, 119–125. [CrossRef]

29. Kim, YH; Kim, D.; Hong, AR; Kim, JH; Yoo, H.; Kim, J.; Kim, I.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. Terapeutski potencijal Rottlerina za kožne hiperpigmentarne poremećaje inhibiranjem transkripcione aktivnosti CREB-reguliranih koaktivatora transkripcije. J. Investig. Dermatol. 2019, 139, 2359–2367.e2.[CrossRef]

30. Das, A.; Ghosh, A.; Kumar, P. Hemijska leukoderma zbog hidrokinona: neobičan fenomen. Indian J.Dermatol. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [CrossRef]

31. Jow, T.; Hantash, BM Depigmentacija izazvana hidrohinonom: Prikaz slučaja i pregled literature. Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [CrossRef]

32. Kersey, P.; Stevenson, CJ Vitiligo i profesionalna izloženost hidrokinonu od servisiranja mašina za samofotografisanje. Kontaktirajte Dermat. 1981, 7, 285–287. [CrossRef] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kawabata, K.; Takahashi, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.; Inoue, S. Rhododendron, fenolno jedinjenje koje izaziva depigmentaciju, ispoljava citotoksičnost melanocita putem mehanizma ovisnog o tirozinazi. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 754–763. [CrossRef] [PubMed]

34. Yoshikawa, M.; Sumikawa, Y.; Hida, T.; Kamiya, T.; Kase, K.; Ishii-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamiya, S.; Sato, Y.; et al. Klinička i epidemiološka analiza 149 slučajeva leukoderme izazvane rododendronom.J. Dermatol. 2017, 44, 582–587. [CrossRef] [PubMed]

35. Harris, JE Chemical-induced Vitiligo. Dermatol. Clin. 2017, 35, 151–161. [CrossRef] [PubMed]

36. Li-Sha, G.; Yi-He, C.; Na-Dan, Z.; Teng, Z.; Yue-Chun, L. Efekti liječenja karvedilolom na ekspresiju i fosforilaciju proteina koji vezuju elemente srčanog cAMPresponse kod akutnog miokarditisa izazvanog koksaki virusom B{6}}. BMC Cardiovasc. Disord. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. Zhang, F.; Steinberg, SF S49G i R389G polimorfizmi beta(1)-adrenergičkog receptora utiču na signalizaciju putem cAMP-PKA i ERK puteva. Physiol. Genom. 2013, 45, 1186–1192. [CrossRef]

38. Lee, AY; Noh, M. Regulacija epidermalne melanogeneze putem cAMP i/ili PKC signalnih puteva: Uvid u razvoj hipopigmentiranih agenasa. Arch. Pharm. Res. 2013, 36, 792–801. [CrossRef]

39. Garcia-Borron, JC; Abdel-Malek, Z.; Jimenez-Cervantes, C. MC1R, cAMP put i odgovor na sunčevo UV zračenje: Proširivanje horizonta izvan pigmentacije. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 699–720.[CrossRef]

40. Lin, CB; Babiarz, L.; Liebel, F.; Roydon Price, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fisher, DE; Seiberg, M. Modulacija ekspresije gena transkripcionog faktora povezanog s mikroftalmijom mijenja pigmentaciju kože.J. Investig. Dermatol. 2002, 119, 1330–1340. [CrossRef]

41. Kim, JH; Hong, AR; Kim, YH; Yoo, H.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. JNK potiskuje melanogenezu interferirajući sa CREB-regulisanim koaktivatorom transkripcije 3-zavisne od MITF ekspresije. Theranostics2020, 10, 4017–4029. [CrossRef] [PubMed]

42. Rios, M.; Habecker, B.; Sasaoka, T.; Eisenhofer, G.; Tian, ​​H.; Landis, S.; Chikaraishi, D.; Roffler-Tarlov, S. Sinteza kateholamina je posredovana tirozinazom u odsustvu tirozin hidroksilaze. J. Neurosci. 1999, 19, 3519–3526. [CrossRef] [PubMed]

43. Cosentino, M.; Marino, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Endogena kateholaminska sinteza, metabolizam, skladištenje i unos u ljudskim neutrofilima. Life Sci. 1999, 64, 975–981. [CrossRef]

44. Marino, F.; Cosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Endogena kateholaminska sinteza, skladištenje metabolizma i apsorpcija u mononuklearnim ćelijama ljudske periferne krvi. Exp. Hematol.1999, 27, 489–495. [CrossRef]

45. Sorrento, D.; Santulli, G.; Del Giudice, C.; Anastasio, A.; Trimarco, B.; Iaccarino, G. Endotelne ćelije su sposobne da sintetiziraju i oslobađaju kateholamine i in vitro i in vivo. Hypertension 2012, 60, 129–136.[CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Frattini, P.; Santagostino, G.; Preda, S.; Orecchia, G. Kateholamini se povećavaju u urinu kod nesegmentnog vitiliga, posebno tokom njegove aktivne faze. Pigment Cell Res. 2003, 16, 111–116. [CrossRef][PubMed]

47. Salzer, BA; Schallreuter, KU Istraživanje strukture ličnosti kod pacijenata sa vitiligom i moguća povezanost sa poremećenim metabolizmom kateholamina. Dermatologija 1995, 190, 109–115. [CrossRef][PubMed]

48. Slominski, A. Neuroendokrina aktivnost melanocita. Exp. Dermatol. 2009, 18, 760–763. [CrossRef]

49. Gannu, R.; Vishnu, YV; Kishan, V.; Rao, YM In vitro permeacija karvedilola kroz svinjsku kožu: efekat vozila i pojačivača penetracije. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2008, 62, 256–263.

50. Kshirsagar, SJ; Bhalekar, MR; Mohapatra, SK Razvoj i evaluacija transdermalnog sistema isporuke lijekova napunjenog karvedilolom: In-vitro i in-vivo studija karakterizacije. Drug Dev. Ind. Pharm. 2012, 38, 1530–1537. [CrossRef]

51. Tanwar, YS; Chauhan, CS; Sharma, A. Razvoj i evaluacija karvedilol transdermalnih flastera. Acta Pharm. 2007, 57, 151–159. [CrossRef] [PubMed]