Antialergijski i antiinflamatorni efekti neferina na RBL-2H3 ćelije

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Mastociti igraju vrlo važnu ulogu u kožnim alergijama i upalama, uključujući atopijski dermatitis i psorijazu. U prošlosti je utvrđeno da referenca djeluje protuupalno i protiv starenja na koži, ali njen učinak na mastocite još nije detaljno proučavan. U ovoj studiji koristili smo mastocite (RBL-2H3 ćelije) i mišje modele za proučavanje referentnih antialergijskih i upalnih efekata. Prvo, otkrili smo da referenca inhibira degranulaciju mastocita i ekspresiju citokina. Osim toga, primijetili smo da kada su mastociti stimulirani A23187/forbol 12-miristat-13-acetatom (PMA), povišenje intracelularnog kalcija je inhibirano referencom. Fosforilacija MAPK/NF-KB puta je također smanjena prethodnom obradom referentne vrijednosti. Rezultati in vivo studija pokazuju da referenca može poboljšati izgled dermatitisa i infiltracije mastocita uzrokovanih dinitroklorobenzenom (DNCB). Štaviše, ekspresija proteina barijere u koži se takođe obnavlja.cistanchKonačno, otkriveno je da referenca može smanjiti ponašanje grebanja uzrokovano spojem 48/80. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da je referenca vrlo dobar antialergijski i protuupalni prirodni proizvod. Njegovo djelovanje na mastocite doprinosi njegovom farmakološkom mehanizmu.

Ključne riječi:referenca; prirodni proizvod; mast cell; dermatitis; svrab

Molimo kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Mnoge studije su potvrdile da su alergijske bolesti rezultat ne samo urođene imunološke aktivacije već i adaptivne aktivacije. Među njima, mastociti imaju vrlo važnu ulogu u raznim alergijskim bolestima kao što su alergijski rinitis, astma i alergijski dermatitis. Mastociti eksprimiraju IgE receptore (FceRI) na svojim ćelijskim membranama, a FceRI receptori imaju visok afinitet za IgE antitijela [1,2]. Kada se antigen-specifični IgE veže za FceRI, dolazi do interakcije i dolazi do alergijske reakcije. Agregacija FceRI može aktivirati receptorske tirozin kinaze, inicirati nizvodne reakcije i promovirati fosforilaciju različitih ključnih proteina (kao što je protein kinaza aktivirana mitogenom; MAPK), što na kraju dovodi do priliva kalcijevih jona (Ca2 plus), što je ključni događaj u degranulaciji mastocita [3].cistanche AustraliaAktivirani mastociti degranuliraju i oslobađaju kemijske medijatore. Ovi hemijski medijatori koji se koriste u alergijskim reakcijama mogu izazvati upalu [4], pa liječenje alergijskih simptoma uključuje inhibitore degranulacije mastocita. Stoga se inhibicija IgE posredovane degranulacije mastocita često koristi za identifikaciju novih spojeva za prevenciju i liječenje alergijskih bolesti. Utvrđeno je da anti-dinitrofenil (DNP)IgE antitijela i antigeni mogu izazvati reakcije pasivne preosjetljivosti kože (PCA) kao tipičan in vivo model neposredne preosjetljivosti i kao lijek za istraživanje potencijala anti-antigenskih alergija [5,6 ]. Osim toga, degranulaciju mastocita mogu uzrokovati i neimuni stimulansi, kao što su jedinjenja 48/80 i A23187. A23187 kalcijum jonofor, dugo je poznato da stimulira lučenje mastocita oslobađanjem prethodno formiranih medijatora, kao što je histamin iz njihovih granula, koji služi kao primjer [4]Jedinjenje 48/80 je miješani polimer p-metoksi-N-metilfenetilamina umrežen formaldehidom, koji se naširoko koristi za nezavisnu stimulaciju mastocita [7,8] Zbog toga su se odgovarajuće količine jedinjenja 48/80 i A23187 obično koristile kao reagensi za proučavanje mehanizma alergijskih reakcija. Prema statističkim procjenama, oko 15-20 posto populacije pati od atopijskog dermatitisa. Bilo da se radi o djeci ili odraslima koji pate od ove bolesti, bez odgovarajućeg liječenja, atopijski dermatitis može uzrokovati psihički stres pacijenata i opteretiti njihovu porodicu i troškove socijalnog zdravlja [9]. Nažalost, ne postoji odgovarajuća metoda liječenja alergijskog dermatitisa. Trenutne opcije liječenja i dalje izbjegavaju alergene koji uzrokuju bolesti, a kontinuirana upotreba steroida je zlatni standard liječenja. Neizbježni alergeni i nuspojave lijekova potaknule su hitan razvoj novih terapijskih lijekova. Prirodni spojevi izolirani iz ljekovitog bilja i biljaka potencijalni su izvori terapijskih sredstava za prevenciju i liječenje upalnih bolesti i poboljšanje kvalitete života pacijenata s alergijskim poremećajima.

Cistanche može protiv starenja

Referenca dolazi iz lotosovog jezgra (embrion sjemena) biljke Nelumbo nucifera i glavni je bisbenzilizohinolin alkaloid. Postoje dokazi da referenca ima širok spektar farmakoloških svojstava, kao što su antikancerogena, antioksidativna, antiinflamatorna i neuroprotektivna dejstva, u mnogim bolestima [10-15].cistanche benefitsKhan et al. otkrili da referenca proizvodi efekte protiv fotostarenja tako što inhibira UV posredovano povećanje nivoa ROS i malondialdehida (MDA) u ljudskim keratinocitima i fibroblastima[16,17]Nedavno smo otkrili da referenca ima potencijal kao alternativni lijek za liječenje atopije dermatitis ili druge upalne bolesti povezane s kožom[18]. Međutim, još uvijek ostaje neizvjesno da li referenca ima učinak protiv alergije na kožu u mastocitima. U ovoj studiji, imali smo za cilj da istražimo efekte reference na alergijske bolesti posredovane mastocitima, koristeći linije ljudskih mastocita (RBL-2H3 ćelije) i jedinjenje 48/80-i DNCB-indukovanu anafilaksiju model miševa.

La referencia proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la referencia tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectores, en muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referencia product efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descula dialdehído potencijalni potencijalni lijek [16,17] de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un con modelo de lérgicas mediadas por mastocitos (células RBL-2H3) y un con modelo de lérgicas mediadas por mastocitos (células RBL-2H3) y un con modelo de lérgicas mediadas 4 .

2. Rezultati

2.1. Test citotoksičnosti neferina na mastocitima štakora (RBL-2H3)

Budući da su bazofilna leukemija štakora (RBL)-2H3 ćelije, analog mastocita koji oslobađa histamin, pogodne ćelije za ispitivanje efekata upale posredovane mastocitom [19], koristili smo ove stanice za istraživanje antialergijskih efekti reference. Prvo smo testirali može li referenca proizvesti citotoksičnost u mastocitima. Kada se ćelije prethodno tretiraju referencom od 1 do 30 μM tokom 24 h, tretman referentne vrednosti neće uticati na vitalnost ćelija (Slika 1).

2.2.Neferin smanjuje efekat degranulacije RBL-2H3 stimuliranog različitim aktivatorima

RBL-2H3 ćelije se obično koriste za in vitro studije degranulacije [20-22]Stimulacija RBL-2H3 ćelija sa anti-dinitrofenol (DNP)IgE i DNP-konjugiranim humanim serumskim albuminom (HSA) izaziva degranulaciju. Osim toga, poznato je da mastociti degranuliraju kao odgovor na sintetička jedinjenja, kao što su jedinjenje 48/80 i kalcijum jonofor A23187, a ova jedinjenja su korištena kao pogodni reagensi za direktna istraživanja mehanizama in vitro alergijskih odgovora [23, 24]. Rezultati su pokazali da citoplazma RBL-2H3 koja nije aktivirana aktivatorom sadrži ograničene sekretorne granule.cistanche holesterolReferentni tretman (10 μM) sam nije uticao na aktivnost RBL-2H3 (Slika 2A, B). Međutim, dodavanje različitih aktivatora, uključujući jedinjenje 48/80, A23187 i anti-DNP/IgE plus DNP/HSA, jasno je ispunilo citoplazmu sekretornim granulama. Pod elektronskim mikroskopom se može vidjeti da se u citoplazmi nalazi veliki broj sekretornih granula, a neke sekretorne granule se čak spajaju sa ćelijskom membranom, što dovodi do degranulacije (Slika 2C-E). Nakon prethodnog tretmana sa referentnim 10 uM, sekretorne granule u citoplazmi su značajno smanjene (slika 2F-H). Ovi rezultati pokazuju da referenca može efikasno inhibirati aktivaciju i degranulaciju RBL-2H3 stimulisane aktivatorom.

2.3.Neferin inhibira PMA/A23187-indukovanu intracelularnu elevaciju kalcija u RBL-2H3

Kalcijumovi joni igraju ulogu sekundarnog glasnika u procesu aktivacije ćelija. A23187 je najefikasniji način za povećanje prodiranja jona kalcijuma kroz ćelijske membrane i stimulaciju aktivacije mastocita. Forbol miristat acetat (PMA) može aktivirati protein kinazu Cand i povećati intracelularne ione kalcija kako bi poboljšao učinak A23187. Povećanje jona kalcija u mastocitima također se smatra važnim faktorom u izazivanju aktivacije mastocita tako da utiče na degranulaciju mastocita i oslobađa više upalnih citokina i hemokina.nuspojave cistanche deserticola,Stoga je ova studija nastojala istražiti može li referenca inhibirati koncentraciju jona kalcijuma u RBL-2H3 kada inhibira upalu. Eksperimentalna grupa je podijeljena u sa ili bez referentnog prethodnog tretmana u trajanju od 20 minuta, a dodani su 1 mM CaClz i PMA/A23187 za stimulaciju i aktiviranje RBL-2H3. Eksperimentalni rezultati su pokazali da sam tretman RBL-2H3 različitim referentnim koncentracijama nije uticao na povećanje koncentracije intracelularnih jona kalcijuma. U grupi sa PMA/A23187-indukovanim Ca2t influksom, koncentracija intracelularnih jona kalcijuma je značajno porasla. RBL-2H3 ćelije su prethodno tretirane 20 minuta sa referentnim (3 μM i 10 μM) i koncentracija jona kalcijuma je značajno smanjena (Slika 3).

2.4. Neferin je smanjio ekspresiju mRNA proinflamatornih citokina u PMA/A23187 stimuliran RBL-2H3

Imunološki odgovor kože će povećati broj mastocita u tijelu, a mastociti će tada proizvoditi proupalne citokine i ubrzati napredak bolesti. Proinflamatorni citokini, posebno TNF-a, IL-6, IL-1 i IL-8, ne samo da indukuju upalu, već i uzrokuju infiltraciju leukocita, formiranje granuloma i fibrozu tkiva. PMA/A23187 djeluje na mastocite i potiče ih da proizvode IL-16, IL-6, TSLP i TNF-, uzrokujući upalu povezanu s alergijom. Stoga smo prethodno tretirali RBL-2H3 referencom 20 minuta i stimulirali sa PMA/A23187 6 h da otkrijemo da li referenca može regulisati ekspresiju mRNA IL-1 , IL{{ 19}}, TSLP i TNF-a. Rezultati su pokazali da u grupi tretiranoj samo referentnom ekspresijom mRNA citokina nije utjecalo, a ekspresija mRNA u grupi koja je inducirala upalu PMA/A23187 značajno se povećala. U grupi tretiranoj referentnom, uočeno je da su nivoi ekspresije mRNA IL-1, IL-6, TSLP i TNF-a značajno potisnuti (Slika 4).

2.5.Neferin inhibira PMA/A23187-indukovanu fosforilaciju MAPK puta u RBL-2H3

Prethodne studije su istakle da mastociti moraju osloboditi intracelularne ione kalcija da bi aktivirali MAPK. Osim toga, MAPK signalni put reguliše ekspresiju monocita, T limfocita, B limfocita, citokina i hemokina, i indukuje autoimunost. Ovaj mehanizam je sličan aktivacijskom putu PMA/A23187. U ovoj studiji smo istražili da li referenca može učestvovati u regulaciji MAPK puteva. Tretirali smo različite referentne koncentracije (1,3 i 10 uM) na RBL-2H3 tokom 20 minuta, a zatim smo stimulirali sa PMA/A23187 tokom 30 minuta da izazovu upalu. Rezultati su pokazali da kada je RBL-2H3 tretiran samo sa različitim referentnim koncentracijama, aktivacija p38, JNK i ERK proteina nije bila pogođena. U grupi tretiranoj samo sa PMA/A23187, otkrili smo da su proteini p38, JNK i ERK aktivirani i da imaju značajnu fosforilaciju. U grupi prethodno tretiranoj referencom, uočeno je da je za veće referentne koncentracije fosforilacija proteina p38, JNK i ERK značajno smanjena (Slika 5A-C).

2.6.Neferin inhibira PMA/A23187-indukovanu fosforilaciju NF-B puta u RBL-2H3

Ekspresija proinflamatornih citokina zavisi od aktivacije faktora transkripcije NF-kB u mastocitima. Kada je IKB protein fosforiliran i degradiran, NF-kB se oslobađa i migrira u jezgro, vezujući se sa svojim odgovarajućim elementima koji reaguju na DNK i promovišući transkripciju proinflamatornih medijatora. Proizvedeno je mnogo citokina i hemokina, koji reguliraju imunološki odgovor, diferencijaciju i upalu. Stoga smo istražili da li predtretman sa referencom utječe na fosforilaciju proteina izazvanu PMA/A23187. Tretirali smo različite referentne koncentracije (1,3 i 10 μM) na RBL-2H3. Nakon 20 minuta, PMA/A23187 je stimulirao RBL-2H3 1 h ili 2 h da izazove upalu. Rezultati su pokazali da samo tretman RBL-2H3 različitim referentnim koncentracijama nije utjecao na fosforilaciju IKBa i NF-KB. Kada je PMA/A23187 korišćen za stimulaciju, primećeno je značajno povećanje fosforilacije IkBo i NF-KB. U grupi prethodno tretiranoj referencom, nađeno je da je fosforilacija IkBa (slika 6A) i NF-KB (slika 6B) značajno smanjena.

2.7. Učinak neferina na atopijski dermatitis izazvan 2,4-dinitroklorobenzenom(DNCB)

Životinjski model za istraživanje bolesti, DNCB je reprezentativni iritans koji uzrokuje atopijski dermatitis[25]. Naš eksperiment koristi 1 posto dinitroklorobenzena (DNCB) otopljenog u 75 posto alkohola da izazove prvu fazu reakcije senzibilizacije. Referentni (3mg/kg i 10 mg/kg) i deksametazon (Dexa,{{1{15}}}.2 mg/kg) rastvoren u DMSO davani su intraperitonealno petog dana deset dana . Osmog, 1. i 14. dana primijenjen je 0,5 posto DNCB kao druga faza izazivanja upale. Miševi su podijeljeni u četiri grupe – kontrolna grupa, DNCB grupa, referentna grupa i grupa tretirana deksametazonom – a zatim su, nakon poređenja među grupama, uočene razlike. Uočili smo da DNCB izaziva reakciju atopične upale kože na koži miševa. Nakon nanošenja DNCB-a, ustanovljeno je da je koža miševa pojačala crvenilo i ljuštenje. Sve su to zbog abnormalne proliferacije keratinocita, infiltracije i agregacije imunoloških stanica. Grupa koja je četiri dana liječena referentnom dozom od 3 mg/kg i deksametazonom 0,2 mg/kg je ublažila crvenilo. Nastavili smo da pratimo stanje dorzalne kože miševa do 15. dana. U poređenju sa kontrolnom grupom, DNCB grupa je imala jako crvenu i otečenu kožu, a bilo je i peruti i rana za koje se činilo da su uzrokovane svrabom i bolom. . Možemo pronaći trend opadanja nakon tretmana referentnim i deksametazonom (slika 7A). Toluidin plava boja je korištena za promatranje broja agregiranih mastocita. Mastociti su izgledali ljubičasto kada se posmatraju pod mikroskopom. Kvantitativno se može pokazati da su mnogi mastociti infiltrirani i akumulirani u dermisu u eksperimentalnoj grupi DNCB značajno povećani u odnosu na kontrolnu grupu. U grupi liječenoj referentnim i deksametazonom, smanjena je infiltracija, agregacija i broj mastocita (Slika 7B, C).

2.8. Neferin poboljšava ekspresiju mRNA molekula povezanih s barijerom nakon tretmana DNCB

Upala povezana s kožom uzrokovana AD može uzrokovati abnormalnu funkciju kožne barijere. Ako je kožna barijera defektna, antigenima ili iritantima je lakše prodrijeti u epidermu kože i ući u tijelo kako bi izazvali imunološke reakcije. U isto vrijeme, proizvodnja proteina diferencijacije, uključujući filagrin, loricrin i involucrin, bit će potisnuta. Stoga je obnavljanje oštećene kožne barijere vrlo važno za prevenciju i liječenje AD [26]. U našoj studiji koristili smo reference za intervenciju na životinjskom modelu atopijskog dermatitisa izazvanog DNCB. Nakon žrtvovanja miševa, tkivo dorzalne kože je utemeljeno za RI-qPCR analizu kako bi se procijenilo može li referenca poboljšati smanjenje ekspresije mRNA u filagrinu, lorikrinu i involukrinu nakon tretmana DNCB. Rezultati su pokazali da je eksperimentalna grupa DNCB imala značajno smanjenu ekspresiju mRNA filagrina, lorikrina i involukrina u odnosu na kontrolnu grupu. Ekspresija mRNA filagrina, lorikrina i involukrina bila je značajno povećana u grupi tretiranoj referentnim i deksametazonom u poređenju sa DNCB grupom (Slika 8).

Nadalje smo dokazali da referenca ima antialergijski efekat grebanja. Koristili smo sredstvo za degranulaciju mastocita, jedinjenje 48/80, da izazovemo ponašanje češanja kod BALB/c miševa. Kao što je prikazano na slici 9, otkrili smo da je tretman referentne inhibirao ponašanje grebanja uzrokovano jedinjenjem 48/80 (50 ug/mjestu). Ponovljena primjena nižih i viših referentnih doza (3 i 10 mg/kg) tokom 5 uzastopnih dana značajno je smanjila broj ogrebotina uzrokovanih spojem 48/80.