Fenolni spojevi iz listova i cvjetova hibiskusa Roseus: potencijalne primjene nedovoljno istraženih vrsta u kozmetičkoj industriji

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Upotreba biljnih ekstrakata u kozmetici za njegu kože moderan je trend zbog njihovog bogatstva polifenolima koji djeluju kao molekuli protiv starenja. ruža hibiskusa je višegodišnja vrsta naturalizovana u Italiji, sa prekrasnim nežno ružičastim cvetovima; njegov fenolni sastav i biološke aktivnosti još nisu proučavane. Cilj ovog istraživanja bio je karakterizirati i kvantificirati fenole i procijeniti antioksidans, zaštitni faktor (SIPF) i antikolagenaznu aktivnost etanolnih ekstrakata listova i cvijeća H. roseus (HL) i cvjetova (HE). Derivati ​​kumarinske, hlorogenske i transferulne kiseline, kao i flavonoidi kvercetina i kempferola, bili su glavni detektovani fenolni spojevi. Otkriveni su katehin, epikatehin, kaempferol-3-O-rutinozid, kaempferol{7}}O-glukozid, kaempferol-7-O-glukozid, salidrozid, oenin i peonidin-3-O-glukozid samo u HF, dok je floridzin bio isključiv iz HL, koji je također pokazao veće količine derivata hidroksicimetne kiseline. HF je bio bogatiji flavonoidima i ukupnim fenolima, a pokazao je i veći antioksidativni kapacitet.bioflavonoidiSPF i anti-kolagenazna aktivnost oba ekstrakta bila je slična i uporediva sa sintetičkim standardima. Ukupni rezultati pokazuju da su ekstrakti H. roseus obećavajući izvori bioaktivnih fenolnih spojeva koji bi se potencijalno mogli primijeniti kao sredstva protiv starenja u kozmetici za njegu kože.

Ključne riječi:anti-kolagenaza; antioksidans; flavonoidi; cvijeće; biljna kozmetika; hidroksicimetne kiseline; LC-MS/MS-MRM; listovi; njega kože; zaštita od sunca

1. Uvod

Upotreba kozmetike je drevna, a njena istorija se oblikuje paralelno sa ljudskom [1,2]. Kozmetika za njegu kože je jedan od najvažnijih proizvoda, glavna je kategorija u ovoj industriji [1,3]. Stoga je interesovanje za njegu kože postalo široko rasprostranjeno, što je izazvalo potražnju za učinkovitim proizvodima dobivenim iz prirodnih izvora [2].

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Nedavna svijest o okolišu, zdravstvu i manjoj upotrebi sintetičkih kemikalija dovela je do sve većeg interesa za kozmetiku na biljnoj bazi, koja sada predstavlja jednu trećinu cjelokupnog kozmetičkog sektora [1A]. Stoga je korištenje biljnih ekstrakata i njihovih fitokonstituenata kao aktivnih sastojaka moderan „proekološki“ pristup [5,6]. Povećana potražnja za ovim proizvodima može biti posljedica njihovih smanjenih nuspojava, širokog spektra djelovanja u kombinaciji s visokom djelotvornošću i općenito niske cijene [7,8].

Biljke su bogate sa nekoliko klasa bioaktivnih spojeva, što je jedan od najzastupljenijih izvora novih sastojaka odgovornih za liječenje mnogih bolesti [9,10]. Osim toga, biljke su također izvor prirodnih hidratantnih sredstava, aroma i pigmenata, što ih čini vrlo zanimljivim za primjenu u kozmetici [5]. Konačno, biljni ekstrakti se općenito smatraju sigurnima i ispunjavaju zahtjeve regulatornih tijela [10,11].

Među spojevima prisutnim u biljnim ekstraktima, fenoli su dobili posebnu pažnju kao aktivni sastojci[12,13], uglavnom zato što se ističu kao protuupalni, antimikrobni i antioksidativni agensi[14,15]. Ova svojstva čine ih idealnim preventivnim i ljekovitim molekulima za kožne poremećaje koji se primjenjuju u kozmetologiji i dermatologiji [16]. Primjetna antioksidativna aktivnost fenola je također djelomično odgovorna za njihove efekte protiv starenja, koji su vjerovatno posljedica njihove sposobnosti da smanje razgradnju kolagena i pružaju UV zaštitu [16]. Stoga je istražena i ohrabrena upotreba prirodnih ekstrakata bogatih fenolima s visokim antioksidativnim kapacitetom za zamjenu sintetičkih antioksidanata u proizvodima za kožu [12].

Cistanche može protiv starenja

Prirodni proizvodi ekstrahovani iz biljaka porodice Malvaceae koriste se širom svijeta, a rod hibiskusa je privukao veliku pažnju zbog višestrukih farmakoloških aktivnosti njihovih ekstrakata i zbog njihovog visokog fenola [17-19]. Hibiscus spp. sadrži oko 240 vrsta jednogodišnjih ili višegodišnjih cvjetnih biljaka, grmova ili drveća, koje su rasprostranjene u različitim regijama svijeta [20]. Ekstrakti hibiskusa primjenjuju se u tradicionalnoj medicini kao emolijensi za liječenje mnogih kožnih oboljenja i opekotina[19,21].buy cistancheNa osnovu ovih literaturnih podataka, ekstrakti iz Hibiscus sp. biljke mogu biti zanimljivi aktivni sastojci za kozmetičke formulacije kože, štiteći stanice od oksidativnog stresa, razgradnje kolagena i štetnog djelovanja UV zračenja.

Iako rod Hibiskus obuhvata mnogo vrsta, do sada je istraženo manje od 10 posto njih [17]. Hibiscus roseus Thore (syn. H.palustris L., H.moscheutos subsp. palustris (L.) RT Clausen.) je zeljasta višegodišnja vrsta naturalizirana u Italiji [22,23] Identifikacija i opis H. roseus su još uvijek u raspravi[ 20,23]. Prema literaturi, vrsta H. moscheutos subsp. palustris je vrlo rano uveden u Evropu, dok ga je u Francuskoj Thore opisao kao novu vrstu, H. roseus, 1807. godine [23]. Ova vrsta nije okarakterisana po svom fenolnom sastavu i proučavana zbog biološke aktivnosti, što je čini potencijalnim neotkrivenim izvorom bioaktivnih jedinjenja za proizvode za njegu kože.

Narodna upotreba u tretmanima kože i širok spektar bioaktivnosti vrsta hibiskusa opravdavaju važnost novih istraživanja usmjerenih na ovaj biljni rod [17]. Stoga je cilj ovog istraživanja bio karakterizirati fenolni sastav i ocijeniti antioksidativni kapacitet, zaštitu od sunca i inhibicionu aktivnost kolagenaze etanolnih ekstrakata listova i cvjetova H. roseus. Naši rezultati po prvi put predstavljaju fenolni sastav i bioaktivnost H. roseus u vezi sa starenjem, što ukazuje na potencijal ove nedovoljno istražene vrste u medicinskoj i kozmetičkoj primjeni kao antioksidansa i aditiva protiv starenja.

2. Rezultati i diskusija

2.1. Fenolna karakterizacija i kvantifikacija

Ciljna analiza, zasnovana na LC-MS/MS-MRM (tečnoj hromatografiji u kombinaciji sa tandem masenom spektrometrijom koja radi u režimu praćenja višestrukih reakcija), sprovedena je da bi se provizorno identifikovala fenolna jedinjenja prisutna u etanolnim ekstraktima H. ​​roseus od fenolnog sastava ova vrsta još uvijek nije prijavljena u literaturi. Devetnaest fenolnih spojeva prethodno opisanih u rodu Hibiskusa korišteno je kao standard (dopunska tabela S1) za razvoj MRM metode, pri čemu je odabir najboljih prijelaza dizajniran optimizacijom instrumentalnih parametara i literaturnim podacima [24].

The main classes of compounds detected in H.roseus leaf and flower extracts were chlorogenic, p-coumaric, and trans-ferulic acids derivatives and flavonoid derivatives (Figure 1,Table 1), similarly to the previous phytochemical characterization of other Hibiscus species[25-29]. Although the phenolic profile was quite similar, some qualitative differences were observed between flowers (HF) and leaves (HL)(Figure 1 and Table 1). While leaves showed richness in p-coumaric acid derivatives (Figure 1, blue line, peaks with Rt from 2 to 9 min), flowers were especially rich in flavonoid derivatives such as catechins, dihydrochalcones, and anthocyanins (Figure 1, red line, Rt>9,3 min, tabela 1).

Trinaest od devetnaest ciljnih fenolnih jedinjenja autentično je identifikovano u ekstraktima analiziranim pomoću LC-MS/MS u MRM režimu (Tabela 1).cistanchMRM je moćan način za istovremeno određivanje nekoliko komponenti, zasnovano na omjeru mase i naboja (m/z) molekularnog jona (((MH) )i njegovog odgovarajućeg ćerki jona. Omogućava poboljšanje selektivnosti i osjetljivost LC-MS/MS analiza [30]Ova metodologija je vrlo pouzdana i pogodna za analize biljnih ekstrakata i drugih složenih mješavina koje dovode do najveće specifičnosti, odlične osjetljivosti i ekstremnog kapaciteta multipleksiranja zahvaljujući mogućnosti razlikovanja spojeva koji imaju isti matični joni ali različiti fragmenti [31,32].Upotrebom ove metode dobili smo značajno smanjenje hromatografskih serija, veću specifičnost i tačnost obezbeđenu dobrim odvajanjem jedinjenja otkrivenih sa istim prelazima, uz izbegavanje gubitka osetljivosti u slučaju različitih koeluiranih spojeva ili za spojeve prisutne u vrlo niskoj koncentraciji [24,334].

Među 13 fenolnih jedinjenja identificiranih korištenjem autentičnih standarda (dodatna tabela S1), deset je bilo isključivo prisutno u ekstraktima cvijeća (slika 1 crvena linija, tabela 1 HF): katehin i epikatehin (pikovi 16b i 23), hlorogenska kiselina (pik 18), peonidin-3-O-glukozid i oenin (pikovi 21 i 22), trans-ferulna kiselina (pik 27), tri derivata glikozida kempferola (kaempferol-3-O-rutinozid, kempferol-7-O- glukozid i kempferol-3-O-glukozid; vrhovi 30,31b i 32) i salidrozid (pik 34). Dodatno, floridzin (pik 33b) je detektovan samo u ekstraktima lista (slika 1 plava linija, tabela 1 HL), dok su rutin i kvercetin-3-O-glukozid (pikovi 26b i 28a) identifikovani u oba tipa ekstrakta (slika 1, Tabela 1HF/HL). Slični derivati ​​kvercetina, kao što su kvercetin-3-O-sambubiozid i izokvercitrin, ranije su uočeni u H.sabdariffa [26,29,35,36] i u ekstraktima H. ​​rosa-sinensis [18]. Neki od ovih glikozida mogli bi odgovarati derivatima kvercetina koje smo otkrili u H. roseus. Osim toga, tilirozid je također ranije otkriven u fenolnim ekstraktima H. sabdarifa cvijeće [37,38]. Oenin (malvidin-3-O-glukozid) i peonidin{44}}O-glukozid, dva antocijana ovdje identificirana u cvjetovima H. ​​roseus po prvi put, bili su drugačiji od onih koji su prethodno opisani u cvjetovima H. ​​sabdariffa, delfinidin 3-sambubiozid, delfinidin-3-glukozid i cijanidin-3-O-sambubiozid [27,35,39,40]. Međutim, važno je napomenuti da je najviše proučavan dio cvjetovi H. sabdariffa su čaška (sepals), a ne latice kao što je ovdje istraženo za H.roseus.

Pored jedinjenja identifikovanih i potvrđenih autentičnim ciljnim standardima, još 27 jedinjenja je navodno identifikovano u ekstraktima listova i cvetova H.roseus na osnovu njihovog MRM (m/z) i njihovih ćerki jona, s obzirom na dobijene produkte fragmentacije od prekursora (dopunska tabela S1). Konkretno, u oba ekstrakta je utvrđeno prisustvo derivata p-kumarinske, transferulne i hlorogenske kiseline i derivata kvercetina, kao i derivata floretina i floridzina (tabela 1).

Kvantifikacija fenola identifikovanih u ovim ekstraktima izvršena je HPLC-DAD analizom (tečna hromatografija visokih performansi povezana sa detekcijom niza dioda; tabela 2). Sadržaj derivata hidroksicimetne kiseline (THC) veći je u listovima nego u cvjetovima, dok su veće količine flavonoida (TFC) pronađene u cvjetovima nego u listovima (p<0.001,table 2).catechin="" derivatives(tcd),dihydrochalcones(tdc),and="" anthocyanins="" (tac)="" were="" quantified="" only="" in="" flower="" extracts(table=""><0.001).therefore, flowers="" represent="" a="" greater="" source="" of="" phenolics="" compared="" to="" leaves="" (tpc,p="0.02," table="" 2).="">cistanche AustraliaSlično ekstraktima H. ​​sabdariffa, glavne klase spojeva pronađenih u listovima H. ​​roseus bili su derivati ​​hlorogenske i p-kumarinske kiseline, kao i kafeoilkinske i p-kumaroilkinske kiseline [26,40,41]. Osim toga, antocijanini su isključivo prijavljeni u Hibiscus spp. cvjetovi i čašice, zajedno sa katehinima [19,28,35].

Nasuprot tome, ferulna kiselina i njeni derivati ​​su manje prijavljeni kao sastojci Hibis-cus spp. ekstrakti, ali mogu biti od velike važnosti za svoje biološke aktivnosti [6,42-44]. Zaista, derivati ​​ferulne kiseline dobijeni iz različitih vrsta hibiskusa pokazali su važna farmakološka svojstva kao što su antivirusna i inhibitorna aktivnost enzima koji konvertuje angiotenzin [43,44]. Osim toga, ferulna kiselina je opisana kao aktivna molekula u ekstraktima H.mutabilis, H.taivanensis [45,46] i u ekstraktima čašice H.sabdariffa [28,38].

Što se tiče potencijalnih kozmetičkih primjena, dokazano je da ferulinska kiselina inhibira stvaranje melanina [6,42], dok derivati ​​p-kumarinske kiseline posjeduju depigmentaciju [47,48], antiinflamatornu i inhibicijsku aktivnost tirozinaze[49]. Osim toga, mnoga istraživanja naglašavaju dodatnu ulogu flavonola i antocijanina, koji mogu djelovati kao jedinjenja za zaštitu kože, posebno inhibirajući melanogenezu [50,51] i kroz njihovo djelovanje kao jedinjenja protiv starenja i prevenciju melanoma [52,53]. Osim toga, potencijalne primjene ekstrakata H. roseusleaf za kožne poremećaje također bi mogle biti poboljšane prisustvom floridzina, koji je pokazao da smanjuje ekspresiju proinflamatornih citokina izazvanih UVB-om u koži izloženoj UV zračenju [54].

2.2. Testovi antioksidativne aktivnosti

Danas je široko dokazano da je akumulacija reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) odgovorna za procese starenja kože, što dovodi do isušivanja, gubitka potkožnog tkiva i stvaranja bora [55,56]. Stoga je pronalaženje prirodnih potencijalnih antioksidativnih spojeva koji se mogu primijeniti u proizvodima za njegu kože vrlo važno za kozmetičku industriju.

Naši rezultati su pokazali da ekstrakti listova H. roseus imaju nižu antioksidativnu aktivnost (izraženu kao ECso vrijednosti) od cvijeća (Tabela 3). Zaista, antioksidativna aktivnost nižih ekstrakata bila je najmanje dva puta veća od onih ekstrakata lista u oba testa (Tabela 3). Ovi rezultati se slažu sa fenolnim sastavom i sadržajem ovih ekstrakata (Slika 1, Tabele 1 i 2), budući da su HF ekstrakti bili bogatiji fenolnim jedinjenjima (Tabela 2). Zaista, analiza korelacije između ECso vrijednosti i sadržaja različitih klasa fenola pokazala se značajnom i negativnom za sve spojeve osim za THC. Kao takve, veće količine flavonoida, katehina, antocijanina, dihidrohalkona i ukupnog sadržaja fenola doprinose većim antioksidativnim kapacitetima (niže vrijednosti EC50—Tabela 4).

Među flavonoidima, kvercetin i njegovi derivati ​​su najpoznatiji antioksidansi i hvatači slobodnih radikala, djelujući i kao učinkoviti inhibitori oksidaza i lipoksigenaza [57]. Štaviše, dihidrohalkoni, kao što je floretin, su takođe opisani kao moćni antioksidansi u testovima 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) i OH-čišćenja[58]. Osim toga, antocijanini izolirani iz ekstrakata hibiskusa pokazali su se kao glavni antioksidativni spojevi u ljudskim stanicama [59].

Ekstrakti različitih delova vrsta hibiskusa pokazali su visok antioksidativni kapacitet [18,21,27,35,40]. Frakcije etanolnih ekstrakata H. sabdariffa pokazale su vrlo niske vrijednosti EC50 u antioksidativnim testovima, što je povezano s visokim sadržajem protokatehijske kiseline [21,59], hlorogenske kiseline, flavonoida i antocijana [24,60]. Osim toga, studija o H. esculentus pokazala je in vitro antioksidativni potencijal derivata kvercetina i katehina prisutnih u njegovim ekstraktima[61]. Konačno, kod H.acetosella, antioksidativna aktivnost je u snažnoj korelaciji sa sadržajem antocijana [62].

Rezultati naše studije na etanolnim ekstraktima H. ​​roseus pokazali su antioksidativnu aktivnost koja je bila sto puta veća od one koja je prijavljena za vodene ekstrakte čašice H. sabdariff, za koje je EC bio blizu 45 mg mL- u sličnom DPPH in vitro model [56] Međutim, za razliku od naših nalaza, ukupan sadržaj flavonoida i antioksidativni kapacitet ekstrakta listova H. sabdariffa bili su veći od onih u cvjetovima[63,64]. 2.3. In vitro zaštitni faktor od sunca (SPF)

Ultraljubičasto zračenje je jedan od najštetnijih faktora okoline koji utječe na zdravlje i fiziologiju kože, te je važan vanjski uzrok starenja kože [65,6]Stalno izlaganje ultraljubičastom zračenju povećava rizik od poremećaja pigmentacije i fotostarenja kože[67]. To je uglavnom zbog povećanja nivoa ROS, što dovodi do stimulacije proizvodnje kolagenaze i rezultira značajnim oštećenjem ćelijskih funkcija kože [56]. Stoga se sastojci koji štite od UV zračenja, uključujući i one prisutne u biljnim ekstraktima, široko primjenjuju u kozmetici kako bi se izbjeglo prodiranje ultraljubičastog zračenja u kožu, ali i spriječilo stvaranje ROS djelujući kao antioksidansi [56,

Jednostavna metoda za provjeru efikasnosti različitih prirodnih komponenti kao UV filtera je analiza faktora zaštite od sunca (SPF), koja je brza i pouzdana in vitro metoda zasnovana na skriningu apsorpcije unutar UV-B spektralnog područja (između 290 i 320 nm), koji su korisni u ranoj fazi odabira aktivnih sastojaka za fotoprotekciju [69].

Visok sadržaj fenola i antioksidativno djelovanje H.cistanche benefitsroseus extracts suggest that they may have also an UV absorbing activity. Both leaf and flower extracts of H. roseus at 0.1 mgmL-1 showed comparable SPF results (p>{{0}}.05):2,6±0,15 za HL i 2,4±0,19 za HF. Ovi rezultati obećavaju jer je standardna formulacija kreme za sunčanje koja sadrži 8 posto homosalata (široko primijenjena hemijska krema za sunčanje) pokazala SPF vrijednost od 4[69,70]. Ovdje pronađeni rezultati za H.roseus bili su slični onima pronađenim za druge biljne vrste[68,69,71,72]i važni su s obzirom na nisku koncentraciju ekstrakata korištenih za testiranje ovog efekta.

Ekstrakti H. rosa-Sinensis već su pokazali pozitivne efekte protiv oštećenja kože miševa ultraljubičastim zračenjem putem antioksidativne zaštite [73]. Prirodni proizvodi koji pokazuju SPF zajedno s visokim antioksidativnim kapacitetom i inhibicijom kolagenaze i elastaze važni su kandidati za zaštitu kože od fotooštećenja i sprječavanje pojave bora[66,71]. Zapravo, veza između odobrenog tradicionalnog sunca filtere i te derivate prirodnih izvora predstavlja trend u kozmetičkoj industriji, budući da potrošači ove proizvode doživljavaju sigurnijim, zbog nuspojava sintetičkih UV filtera[72].

Veći sadržaj ukupnih fenolnih spojeva HF ekstrakata (TPC; tabela 2) može ukazivati ​​na njihovu veću apsorpcionu aktivnost UV zraka. Međutim, i ekstrakti listova i cvijeta pokazali su vrlo slične rezultate, što ukazuje da bi više od ukupnog sadržaja fenola, fenolni profil ekstrakata bio povezan sa zaštitom od UV zraka. Konkretno, veći sadržaj derivata hidroksicimetne kiseline u HL( Tabela 2) može doprinijeti povećanju njihove SPF vrijednosti, budući da ova jedinjenja imaju UV apsorpciju oko 300-320 nm [74] koja je stoga centrirana u UV-B regiji. Suprotno tome, flavonoidi i antocijanini, uglavnom prisutni u ekstraktima cvijeća, imaju širi spektar apsorpcije u kojem su prisutne najmanje dvije trake, sa glavnim opsegom u ili blizu vidljivog opsega, oko 350 nm za flavonole i 505-550 nm za antocijanine [53,69]. Zaista, derivate hidroksicimetne kiseline proizvode biljke, posebno za njihovu zaštitu od UV zračenja [75]. Stoga, ovi derivati ​​hidroksicimetne kiseline mogu uvelike doprinijeti apsorpciji UV-B u ljudskoj koži [6]. Međutim, s obzirom na prisustvo antocijanina i flavonoida koji pokrivaju granični opseg apsorpcije talasnih dužina, uključujući i UV-A i vidljive regije, ekstrakti cvijeća H. roseus mogli bi biti obećavajući za dalju analizu i razvoj kozmetičkih proizvoda za zaštitu od sunca. Osim toga, veća antioksidativna aktivnost uočena za HF (Tabela 3) mogla bi poboljšati efekte zaštite od sunca u mogućim daljnjim formulacijama[69].

2.4. Aktivnost inhibicije kolagenaze

Both H.roseus extracts showed high collagenase inhibitory activity (>80%)at0.25mg mL-1, which is comparable to that of the synthetic inhibitor 1,10-phenanthroline 1M (Figure 2). The IC50 value of both extracts were very similar( >{{0}}.05),IC50cvjetni ekstrakti =0.14 ± 0.02 mg mL-1 i IC50list ekstrakti =0.13±0.01 mg mL-1, uprkos njihovim razlikama u fenolnom sastavu i sadržaju (Tabele 1 i 2). To bi moglo biti zbog sinergijskih interakcija između fenola i kolagenaze, koje bi mogle igrati važnu ulogu u mehanizmu inhibicije. Osim toga, druga jedinjenja koja su eventualno prisutna u ekstraktima H. ​​roseus, a nisu ovdje analizirana, mogu učestvovati u anti-kolagenaznoj aktivnosti, uključujući vitamin E i askorbinsku kiselinu [71,7]. Štaviše, dva testirana standardna jedinjenja, hlorogena kiselina i kvercetin, čiji su derivati ​​prisutni u ekstraktima listova i cvetova H. roseus (Tabela 1), pokazali su veoma visoku inhibiciju kolagenaze, sa vrednostima ICso od 5,8±0,5 i 5,6±0,7ug mL -l respektivno. Stoga, ova jedinjenja mogu biti odgovorna za uočenu aktivnost protiv kolagenaze. Važno je primijetiti da su različite klase fenola, koje su također prisutne u našim biljnim ekstraktima, već pokazale djelovanje protiv starenja kroz inhibiciju razgradnje kolagena i doprinoseći vlaženju kože [78]. Na primjer, dokazano je da ferulinska kiselina i njeni derivati ​​hidratiziraju kožu i stimuliraju sintezu kolagenih vlakana, a koriste se u kozmetici kao što su kreme protiv bora [6]. Nadalje, flavonoli, posebno derivati ​​kvercetina, jaki su inhibitori enzima kolagenaze [79].

Naši rezultati pokazuju obećavajući učinak ekstrakta H. roseus protiv razgradnje kolagena, koji je jedan od najvećih proteina odgovoran za gubitak elastičnosti i integriteta kože i za stvaranje bora [80,81]. Enzim kolagenaza inhibira zadržavanje elastičnosti i zatezne čvrstoće kože [82]. Zaista, različite studije su pokazale važnost prirodnih antioksidanata zbog njihove efikasnosti u odlaganju preranog starenja kroz inhibiciju aktivnosti kolagenaze [78,83].

Provedene su prethodne studije koje su procjenjivale efekte vrsta Hibiskusa na stimulaciju proizvodnje kolagena i na inhibiciju aktivnosti kolagenaze [56,84,85]. Inhibicija aktivnosti kolagenaze vodenih ekstrakata H. sabdariffa nedavno je opisana u literaturi [56]. Slično našim nalazima, autori nisu uočili efekte inhibicije kolagenaze pri niskim koncentracijama ekstrakata, već samo pri značajno visokim koncentracijama [56]. U drugoj studiji, vrijednost ICso u inhibiciji kolagenaze etanolnih ekstrakata H. sabdariffin bila je 0.75±0.04 mg mL-1[65], što je aktivnost koja je skoro šest puta niže od onih koje su ovdje opisane za H. roseus.

3. Materijali i metode

3.1. Biljni materijal

Deset biljaka Hibiscus roseus Thore, kupljenih od komercijalnog rasadnika u Firenci (Italija), posađeno je u 10-litarske saksije napunjene pješčanom zemljom (pjesak/treset, 60:40, v/v) i održavane u stakleniku Odeljenje za poljoprivredu, hranu, životnu sredinu i šumarstvo (DAGRI)—Univerzitet u Firenci (UNIFD, Sesto Fiorentino (Italija,43949/N,1137/E). Biljke su uzgajane u stakleniku od januara do jula 2019., ručno navodnjavanje u kapacitetu saksije.Od ovih deset različitih biljaka, sakupljeni su listovi i cvjetovi u dva bazena krajem jula tokom perioda cvatnje i odmah pohranjeni na -80 stepeni do ekstrakcije.3.2.Ekstrakcija uz pomoć ultrazvuka

Liofilizirani uzorci (900 mg) cvjetova i listova H.roseus (HF) i listova (HL) su mljeveni u tekućem dušiku i ekstrahirani sa 3 × 15,0 mL etanola 75 posto (pH2,5 prilagođen sa HCOOH) pomoću ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom (UAE). UAE je sprovedeno u ultrazvučnom kupatilu (BioClass@ CP104) koristeći konstantnu frekvenciju od 39 kHz i ulaznu snagu od 100 W, tokom 30 minuta, na 5 stepeni. Nakon centrifugiranja (5 min, 9000 rpm, 5 stepeni; ALC@4239R, Milano, Italija), supernatanti su podijeljeni sa 3×15 mL n-heksana kako bi se uklonila lipofilna jedinjenja koja bi mogla ometati analizu. Etanolna faza je redukovana do suva, izmerena na digitalnoj analitičkoj vagi (Precisa[ 125A), a ostatak je resuspendovan sa zakiseljenim rastvorom metanol/voda (1:1 v/v, pH 2,5 podešen sa HCOOH). Proces ekstrakcije je izveden u tri primjerka.

3.3.LC-MS analiza: fenolni profil ekstrakata

LC-MS analiza je sprovedena korišćenjem ABSciex API3000 trostrukog kvadrupolnog masenog spektrometra (AB Sciex LC, Framingham, MA, SAD) u kombinaciji sa Agilent 1100 HPLC sistemom sa binarnom pumpom i autosamplerom (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA, USA ). Akvizicija i redukcija podataka obavljeni su pomoću softvera Analyst 1.6.2 (AB Sciex LLC, Framingham, MA, SAD).

HPLC odvajanje je izvedeno na Agilent fenil koloni (3 × 10 mm; 2,7 um), a eluenti su (A) zakiseljena voda (na pH 2,5 podešena sa HCOOH) i (B) acetonitril/ voda (90/10, na pH 2,5 podešeno sa HCOOH). Korišćen je gradijentni sistem rastvarača kako slijedi: 0-3 min,5 posto B;3-18 min,5-40 posto B; 18-28 min,40 posto B;28-38min, 40-80 posto B; 38-43min, 80 procenata B,43-45min, 80-5 procenat B, pri brzini protoka od 0,4mLmin -l. MS analiza je sprovedena u sledećim eksperimentalnim uslovima: Atmosferski pritisak Hemijska jonizacija (APCI) korištenjem grijanog sučelja nebulizatora; Struja igle (NC), -5 μA; Gas za raspršivanje (vazduh), 10 (proizvoljne jedinice); Pomoćni plin (vazduh), 3L min-l; Temperatura pomoćnog gasa (TEM), 550 stepeni; Gas zavjese (CUR, dušik), 6 (proizvoljne jedinice); Collision Gas (CAD, Nitrogen),9 (proizvoljne jedinice, što odgovara 2,6×10~ Torr tlaku u kolizijskoj ćeliji).

Identifikacija različitih fenolnih komponenti izvršena je ciljanim pristupom, koristeći metodu praćenja višestrukih reakcija (MRM), optimiziranu sa standardima za 19 ciljnih jedinjenja (odabranih na osnovu prethodnih studija polifenolnog sastava Hibiscus spp.[25,35]). ): dva flavan{3}}ola (katehin i epikatehin), sedam flavonola (quercetagetin-7-O-glukozid, rutin, kvercetin-3-O-glukozid, kempferol-3-O. rutinozid , kaempferol-7-O-glukozid, kaempferol-3-O-glukozid i kvercetin), jedan cinamat estar (hlorogenska kiselina), dvije hidroksicimetne kiseline (p-kumarinska i trans-ferulna kiselina), dva dihidrohalkona ( floridzin i floretin), jedan oksiflavon (salidrozid) i četiri antocijana (mirtilin, kuromanin, peonidin{15}}O-glukozid i oenin). Vrijeme zadržavanja i relativni MRM prijelazi (kvantifikator i kvalifikator) prikazani su u Dodatnoj tabeli S1. Štaviše, predložene su dodatne probne identifikacije pomoću neciljanog pristupa, skeniranjem kvadrupola od m/z 100 do 100 Da.

3.4.HPLC-DAD analiza: Kvantifikacija fenola

HPLC-DAD analiza je izvršena da se kvantifikuju različite klase fenola (derivati ​​hidroksicimetne kiseline, katehini, dihidrohalkoni, flavonoidi i antocijanini) u ekstraktima. Alikvoti uzoraka (15 μL) su ubrizgani u Flexar tečnost Elmerografa kvaternarnu pumpu 200Q/410 i detektor diode LC 200 (DAD) (svi iz Perkin Elmer, Bradford, CT, SAD). Kromatografski uslovi su bili isti kao oni korišteni za HPLC-MS/MS analize (odjeljak 3.3) .

Kromatogrami su dobijeni na 280,330,350 i na 520 nm (za kvantifikaciju antocijana). Identifikacija i kvantifikacija fenolnih jedinjenja izvršena je na osnovu vremena zadržavanja, UV spektralnih karakteristika i poređenja sa standardima, kao i na osnovu literaturnih podataka [25] i prethodne LC-MS analize. Kalibracione krivulje u pet tačaka sa različitim standardima (hlorogena kiselina, p-kumarin, rutin, epikatehin, naringin i peonidin{8}}O-glukozid, svi iz Sigma-Aldrich"-Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) korišteni su za kvantifikovati različite polifenole otkrivene i identifikovane u ekstraktima. Ako komercijalni standard nije bio dostupan, kvantifikacija je izvršena korišćenjem kalibracione krive standarda iz iste fenolne klase, dajući procenjeni sadržaj. Linearnost krivulja određena je koef. determinacije (R4), veći od 0,99 za sve standarde.

Svi ekstrakti su analizirani u tri primjerka, a kvantitativni rezultati fenola dati su u mg gl suhe težine (mg gl DW), izražene kao ukupni sadržaj derivata hidroksi cimetne kiseline (THC), ukupni sadržaj flavonoida (TFC), ukupni derivati ​​katehina sadržaj (TCD), ukupni sadržaj dihidrohalkona (IDC), ukupni sadržaj antocijana (TAC) i ukupni sadržaj fenola (TPC), koji su procijenjeni kao zbir pojedinačnih identifikovanih jedinjenja koja pripadaju svakoj klasi.

3.5. Testovi antioksidativne aktivnosti

Ispitivanje antioksidativne aktivnosti izvedeno je korištenjem dvije različite metode: DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) i hidroksilnih radikala (OH)-čišćenja (HRS).

Metoda Khandi i Charles [{{0}}] je primijenjena za DPPH test. Ukratko, razrijeđeni uzorci ekstrakata (0.5 mL) dodani su u 0.5 mL otopine DPPH (0.1 mM u metanolu; Sigma-Aldrich@,St. Louis, MI, SAD), i smjesa je ostavljena da reagira na sobnoj temperaturi 40 min u mraku. Ovo vrijeme (40 min) je definirano na osnovu rezultata kinetičke analize svakog ekstrakta i standarda hlorogenske kiseline i rutina. Nakon vremena reakcije, apsorbancija je izmjerena na 518 nm pomoću PerkinElmer§ Lambda 25UV/VIS spektrofotometra. Upijanje slijepog uzorka (0,5 mL metanola i 0,5 mL uzoraka) i negativne kontrole (0,5 mL metanola i 0,5 mL DPPH otopine) također je procijenjeno. Sve analize su obavljene u tri primjerka. Procenat antioksidativne aktivnosti izračunat je na sljedeći način (1).

4. Zaključak

Sekundarni metaboliti su potencijalni aktivni sastojci za nove kozmetičke formulacije. Među njima, fenolna jedinjenja ekstrahovana iz biljaka mogu imati velika antioksidativna svojstva i svojstva protiv starenja, efikasni u inhibiciji dermalnih enzima (npr. kolagenaze) i u apsorpciji UV zraka. Prema tome, nedovoljno istraženi biljni ekstrakti, poput onih iz H. roseus, mogu predstavljati neotkrivene izvore bioaktivnih molekula.

Pokazali smo da su listovi i cvjetovi H.roseus bogati derivatima hidroksicimetne kiseline i flavonoidima, pri čemu cvjetovi imaju veće količine kempferol glikozida, katehina, dihidrohalkona i antocijana, sva ova jedinjenja još nisu opisana u literaturi za ovu vrstu. . Veliki antioksidativni kapacitet, posebno ekstrakta cvijeća, zajedno sa zaštitom od sunca i anti-kolagenaznom aktivnošću ekstrakta listova i cvijeta, ukazuju na obećavajuću upotrebu ove slabo istražene vrste u primjenama u njezi kože. Zaključno, naši rezultati su pokazali potencijal cvjetova i listova H. roseus kao izvora fenola, kao i djelovanje njihovih ekstrakata kao agenasa protiv starenja koji se mogu koristiti kao sastojci za funkcionalne kozmetičke proizvode.

Ovaj članak je preuzet iz Plants 2021, 10, 522. https://doi.org/10.3390/plants10030522 https://www.mdpi.com/journal/plants