Abstract
Svrha: Ova studija je provedena kako bi se potvrdila primjenjivost miješanog biljnog ekstrakta (MHE) kao lijekakozmetika protiv starenjasastojak ispitivanjem njegovogkože protiv starenjaaktivnosti in vitro i in vivo. Metode: U ovoj studiji smo pripremili MHE koristeći ultrazvučnu ekstrakciju koja sadrži Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Solomonovu foku, sibirski ginseng, Ponciri Fructus i Ginseng. Istražili smoanti-age efekat MHE za kožu u dermalnim fibroblastima. Theaktivnost protiv starenjaodređen je nivoima sinteze kolagena tipa I. Nivoi mRNA matriksne metaloproteinaze-1 (MMP1) i tkivnog inhibitora metaloproteinaza 1 (TIMP1) mjereni su qRT-PCR. Nivoi proteina MMP1 procijenjeni su blot analizom. Klinički testovi vlažnosti, elastičnosti, teksture i bora kože vršeni su korištenjem kozmetike koja sadrži 1 posto MHE. Rezultati: MHE je izazvao pojačanu regulaciju sinteze prokolagena tipa I i ekspresije TIMP1 mRNA. MHE je doveo do smanjenja nivoa MMP1 mRNA i nivoa proteina. Nadalje, nakon nanošenja kozmetike koja sadrži 1 posto MHE, hidratacija kože, elastičnost, tekstura i vranine su poboljšane 4 sedmice nakon tretmana. Zaključak: MHE djeluje protiv starenja tako što potiče sintezu kolagena i potiskuje ekspresiju gena MMP1 in vitro, a in vivo djeluje na poboljšanje kože. Stoga se pokazalo da MHE ima vrijednost kao funkcionalni kozmetički sastojak.
Ključne riječi:Njega kože, Anti-aging, Protiv bora, Prirodna kozmetika, Biljna medicina
Biljni dodaci Cistanche protiv starenja
Uvod
Koža je organ koji dolazi u kontakt s vanjskim okruženjem i vitalan je za naš opstanak, djelujući kao primarna barijeraprotiv spoljnih napadakao što su infektivni agensi i fizičke povrede; osim toga, ispunjava nekoliko važnih fizioloških uloga (Slominski i sur., 2004; Vollmer i sur., 2018). kako starimo,funkcija kožepostupno se pogoršava atrofičnim promjenama zbog ultraljubičastih (UV) zraka, zagađenja i stresa te starenjem kože koje se javlja kako se broj stanica kože i debljina kože smanjuju (Farage et al., 2013).
Starenje kožemogu se podijeliti na endogeno starenje i egzogeno starenje. Endogeno starenje kože događa se prirodno tokom vremena bez obzira na vanjske utjecaje. Dermalno-epidermalnijunction (DEJ) kohezija slabi, a sa diferencijacijomkeratinocita, stvaranje lipida se smanjuje (Makrantonakiet al., 2007). S druge strane, egzogeno starenje je uzrokovano vanjskim djelovanjemfaktori kao što su UV zraci, infracrveni zraci (IR), pušenje, finoprašina i način života. Među njima, fotostarenje je uzrokovano UV zračenjemzraci koji prodiru u kožu i oštećuju kolagen i elastinu dermisu. U tom procesu dolazi do stvaranja elastičnih vlakana i kolagenavlakna kože su deformirana, što rezultira smanjenjem elastičnostii opuštanje. Kolagen je glavna komponenta ekstracelularnogmatriksa i ima važnu ulogu u određivanju funkcije tkiva.
Među različitim tipovima kolagena, kolagen tipa 1 čini oko 75-80 posto ukupnog kolagena (Landau, 2007; Lovell et al., 1987; Mays et al., 1988). Kada je koža izloženaUV zračenjem dugo vremena nastaju slobodni radikali. Ove besplatneradikali stimuliraju ekspresiju matriks metaloproteinaze-1(MMP1) koji potiče razgradnju kolagena i inhibira kolagensinteza koja smanjuje elastičnost kože i rezultira borama.Stoga, za prevenciju i poboljšanje bora kože uzrokovanihstarenje, potrebno je razviti sastojak koji potičeproizvodnju kolagena i inhibira ekspresiju i aktivnostMMP1 (Wlascheket al., 2001).
Starenje kožeje usko povezana sa kvalitetom života. Budući da je koža najvidljiviji organ, čini nas svjesnim procesa starenja (Binić i sar., 2013). U toku su različiti napori u oblasti medicine, farmacije i kozmetike da sesprečavaju i poboljšavaju starenje kože. Therazvoj sastojaka protiv starenjaje jedna od najvažnijih strategija protiv starenja.
Pripremili smo biljne ekstrakte ultrazvučnom ekstrakcijom kako bismo razvili nove sastojke protiv starenja koji sadrže Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Solomonov pečat, Sibirski ginseng, Ponciri fructus i Ginseng.
Odabrano je šest biljnih lijekova od biljaka s različitim medicinskim i kožnim djelovanjem. Forsythiae fructus, sušeni plod Forsythia suspense (porodica Oleaceae), poznat kao Lian Qiaou Kini, prvi put je snimljen u Shennong Bencao Jing, aprestižna monografija o tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM)(Donget al., 2017.). Korišćen je kao sredstvo za čišćenje idetoksikacijski TCM za liječenje zaraznih bolesti, kao nprakutni nefritis, erizipele i čirevi (Wanget al., 2018). TO JEširoko se koristi u klinikama kao pojedinačni lijek ili složeni recept.Moderna farmakologija je pokazala da ima različitebioaktivnosti, uključujući protuupalno, antibakterijsko, antivirusni, antioksidativni, antitumorski, antidijabetički, antihiperlipidemijski,antiandrogena alopecija, protiv povraćanja, protiv starenja i protivgojaznost aktivnosti i neuroprotektivni, hepato-protektivni, ivazorelaksantni efekti (Donget al., 2017.). Osim toga, bilo jeprijavio toForsythiae fructusima izbjeljivanje kože, anti-atopijski dermatitis i efekti protiv starenja. Prema Tajvanubaza podataka recepata širom zemlje,Forsythia Fructusje biouključeno u top 10 biljaka koje se najčešće koriste za liječenje atopijedermatitis (15,9 posto), urtikarija (11.49-13,4 posto) i akne (22,3 posto)(Donget al., 2017). Forsythiae fructussadrži saponine,flavonoidi,te alkaloida i oleanolne kiseline koja ima korisfarmakološko djelovanje. Osim toga, sadrži arktigenin imatairesinol. Kao fiziološki aktivni sastojci kože, onisu inhibitori tirozinaze koji djeluju na metabolizam melaninaput izazvan - hormon koji stimuliše melanocite ( -MSH)i privlače pažnju kao kozmetički materijali za izbjeljivanje(Yang & Choe, 2011).Tribuli fructus, što je sušeno voćeTribulus terrestrisL, prijavljeno je da ima farmakološki učinakaktivnosti poboljšanja seksualne funkcije, prevencije i liječenjakardiovaskularnih bolesti, te poboljšanje neuroprotekcije imemorija. Takođe ima antidijabetičko, antiinflamatorno iantioksidativni efekti (Chhatreet al., 2014). Tribuli fructusekstrakt sadrži velike količine diosgenina, tigogeina, raznihsaponini, itd. Ovi saponini su najvažniji bioaktivnikomponente odgovorne za različite biološke efekte kao nprafrodizijačko, antihipertenzivno i protektivno djelovanjeučinak protiv ishemijsko-reperfuzijske ozljede i antikancerogenih,antibakterijsko i antifungalno djelovanje (Chhatreet al., 2014).
Ostali sastojci uključuju furostanol i spirostanol saponine, polisaharide, flavonoidne glikozide, alkaloide i amide. Osim toga, efikasan je protiv atopijskog dermatitisa kod pacova i ima protuupalno djelovanje (Chhatre et al., 2014). Prijavljeno je da efekat protiv starenja Tribuli fructus ekstrakta povećava proizvodnju pro-kolagena tipa I i elastina u HS68 ćelijama, potiče akumulaciju lipida u adipocitima i na kraju poboljšava bore i elastičnost kože (Kim et al., 2016. ). Sibirski ginseng (Acanthopanax senticosus) je listopadni grm koji pripada porodici Oga zajedno sa ginsengom i divljim ginsengom. Sibirski ginseng ima mnogo sličnosti sa ginsengom i koristi se kao biljni lijek za moždani udar, visoki krvni tlak i dijabetes. Ekstrakt sibirskog ginsenga se dugo koristi u orijentalnoj medicini, a farmakološki i fiziološki rezultati donedavno su izvještavani u raznim studijama. Komponente sibirskog ginsenga koje su do sada identifikovane uključuju eleutero strane A, B, C, D, E, I, K, L i M, i sezamin, kiisanozid, kafeinsku kiselinu, hlorogensku kiselinu, kampesterol, vitamine i minerale (Park et al., 2010).
Sadrži triterpenoidne saponine, lignane, kumarine iflavonoidi, među kojima se fenolna jedinjenja smatraju najaktivnijim komponentama (Huang et al., 2011). Postoje brojni izvještaji o djelotvornosti ekstrakta sibirskog ginsenga na kožu.Efekat protiv bora,antioksidativno dejstvo,sinteza kolagena, a prijavljena je inhibicijska aktivnost kolagenaze protiv fotostarenja (Park et al., 2010). Prijavljeno je da ekstrakt sibirskog ginsenga reguliše sintezu kolagena tipa IV, utičući na proliferativni kapacitet epidermalnih matičnih ćelija i zadebljanje epiderme (Choi et al., 2016). Solomonov pečat je rizom Polygonatum odoratum (sinonim: P.officinale) koji ima tonik i koristi se za liječenje zatajenja srca i dijabetesa u orijentalnoj medicini. Solomonov pečat je anti-ciklični i antitusivan; ublažava napetost srca, diuretik je, energizira, hipoglikemik, sedativ i tonik; koristi se za liječenje plućnih bolesti, uključujući tuberkulozu i gastrointestinalne poremećaje (Haroon et al., 2012). Osim toga, široko se koristi u liječenju poremećaja krvi; blagotvorno djeluje na bubrežne kanale i sprječava sijedu kosu, probleme s vidom, vrtoglavicu i lišajeve. To je tonik za nerve i koristi se u liječenju dijabetesa (Haroon et al., 2012). Solomonov pečat ima visok sadržaj fenola i antioksidativno djelovanje. Homoizoflavanoni iz Solomonovog pečata inhibiraju stvaranje krajnjih produkata napredne glikozilacije. Solomonov pečat je pokazao snažnu regulatornu aktivnost crijevnog imunološkog sistema i sposobnost da izazove diferencijaciju osteoklasta i apoptozu izazvanu lektinom. U slučaju ekstrakta listova P. odoratum, funkcija zacjeljivanja rana je prikazana kao primjer (Fathi et al., 2014). Ponciri fructus immatures je nezreo plod Poncirus trifoliata Rafinesque, koji pripada porodici Rutaceae (Jung et al., 2016). Nedavno su zabilježeni protuupalni i antihipersenzitivni efekti, a zabilježeno je i djelovanje ekstrakta masnog mulja da indukuje apoptozu ćelija raka (Lee et al., 2008). Poznato je da je Ponciri fructus efikasan u liječenju atopijskog dermatitisa. Primjenom na kožu ekstrakta Ponciri fructus, zabilježeno je njegovo djelovanje protiv atopijskih dermatitisa, kao što su epidermalna hiperkeratoza, dermalni edem i citokini. Konkretno, zabilježeno je značajno smanjenje svraba, broja mastocita, proizvodnje IgE i ekspresije faktora rasta živaca. Ekstrakti ponciri fructusa pokazali su djelotvoran protuupalni učinak protiv atopijskog dermatitisa i antipruritsku efikasnost regulacijom imunoloških mehanizama. Osim toga, poznato je da oralna primjena ekstrakta Ponciri fructus pomaže u liječenju i prevenciji alergijskih bolesti (Hwang et al., 1997.). Ginseng je široko korištena tradicionalna biljna medicina s multifunkcionalnim aktivnostima. Ginseng se koristi zbog svojih protuupalnih, antioksidativnih, antitumorskih i anti-aging aktivnosti (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Provedena su mnoga istraživanja o djelotvornosti ginsenga na kožu (He et al., 2018). Među njima, postoji mnogo izvještaja o saponinima i ginsenozidima, koji su reprezentativni sastojci ginsenga. Saponini su spojevi koji se široko nalaze u većini biljaka i postoje u različitim oblicima. Saponini mogu ubrzati različite biološke aktivnosti kao što su hemoliza, te antibakterijske, antivirusne i antioksidativne funkcije. Osim toga, saponini imaju protuupalna svojstva koja mogu smanjiti oticanje i upalu kože. Ginsenozidi povećavaju interleukin (IL)-1, jedan od upalnih citokina za koje se zna da promoviraju angiogenezu i induciraju faktor rasta i akumulaciju vaskularnog endotelana mjestima opekotina kože kod miševa. Prijavljen je i njihov učinak uklanjanja makrofaga iz kožnih rana i promicanja zacjeljivanja rana (Kim et al., 2011).
Cilj ove studije je bio da se razjasni efekat protiv starenja kože mešanog biljnog ekstrakta (MHE) in vitro i in vivo.
Metode
1. In vitro evaluacija efikasnosti
1) Priprema MHE
Osušeni plodovi Forsythia suspense, sušeni plodovi Tribulus Terrestris L., Sibirski ginseng (Acanthopanax senticosus (Eleuthero) Koren), Solomonov pečat (Rhizome i korijen Polygonatum Officinale), plodovi Poncirus Trifoliata Rafinesque (Papanaginax Rafinesque), kupljeno na lokalnom tržištu. Zasnovano na teoriji "Yin-Yang" i "pet elemenata" tradicionalne kineske medicine (TCM), Forsythia suspensa, Tribulus terrestris L. i Poncirus trifoliata Rafinesque koji odgovaraju "Yang" i sibirski ginseng, ginseng i Solomonov pečat koji odgovaraju "Yin" je odabran. Šest ljekovitih biljaka ponovo je podijeljeno na karakteristike koje odgovaraju pet elemenata (drvo, vatra, voda, metal ili zlato i zemlja ili tlo). Ove ljekovite biljke pomiješane su u istom omjeru za ravnotežu svakog elementa, a Poncirus trifoliata i ginseng koji odgovara Zemlji su kombinovani sa ostalim elementima kako bi se uskladile proporcije (Tabela 1). Šest ljekovitih biljaka ekstrahovano je u 30-postotnom etanolu ultrazvukom (20 kHz, 2 h). Nakon koncentriranja na rotacionom isparivaču, dodano je 30 posto (v/v) butilen glikola, a otopina je razrijeđena da se dobije ekstrakt koji sadrži 1 posto krutog sadržaja.
Tabela 1. Sastav mješavine bilja
2) Ćelijske kulture i reagensi
Ljudske primarne ćelije fibroblasta (HDFn) su dobijene od PromoCell-a (Normal human dermal fibroblasts juvenile prepucij, C-12300; PromoCell, Njemačka). Ćelijske kulture sa Dulbeccovimmodificirana Eagle's srednje visoka glukoza (DMEM visoka glukoza, SH30243.01, Hyclone, Cytiva) koja sadrži 10 posto (v/v) fetalnog goveđeg seruma (FBS, SH30084.03, Hyclone) i 1 posto antibiotikaantimikotični agensi (Anti-anti, 15240-062, Gibco, SAD) uzgajani su na 37 stepeni u inkubatoru sa 5% CO2.
3) Test vitalnosti ćelije (MTT test)
MTT test je izmjerio vitalnost stanica i odredio citotoksičnost MHE. Ćelije su zasijane u količini od 5×103 ćelija/jažici na ploči sa 96-jažicom i kultivisane 24 h pod ćelijskom kulturomuslovima. Zatim smo odbacili medijum, isprali ćelije rastvorom fosfatnog pufera (PBS, 21-040-CV; Corning, USA), stavili ćelije u novi medij bez seruma itretirali ćelije koncentracijama {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 i 1{15}} posto uzoraka i inkubirali ćelije 24 i 48 h. Zatim smo dodali 100 μL MTT rastvora(0.5 procenata, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil-2H tetrazolijum bromid) svakom dobro i inkubirali ćelije još 2 sata. Nakon uklanjanja medija kulture, dodali smo 100 μL 100 posto dimetil sulfoksida (DMSO), protresli ćelije 10 minuta i izmjerili apsorbanciju na 590 nm čitačem mikroploča (Epoch 2 mikroploča čitač, BioTek, SAD).
4) Merenje pro-kolagena tipa I generacije
Koncentracija prokolagena tipa I u mediju ćelijske kulture izmjerena je korištenjem komercijalno dostupnog ELISA kompleta (Procollagen type I C-peptide EIA Kit, MK101, TaKaRaBio, Japan) prema uputama proizvođača. Svaki uzorak je analiziran u tri ponavljanja.
5) Merenje nivoa ekspresije mRNA pomoću kvantitativnog
Lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qRT PCR) Ćelije su zasijane na 1×105 ćelija/jažici na 6-pločama. HDFn ćelije su kultivisane 24 h; zatim, ćelije su sinhronizovane sa DMEM visokom glukozom bez FBS tokom 24 h. Podloga je zamijenjena podlogom bez seruma i tretirana je koncentracijama 0.05, 0.10, 0,25, 0,5 i 0,75 posto uzoraka za 24 i 48 sati. Ekstrakcija RNK je izvedena sa HDFn ćelijama pomoću kompleta za ekstrakciju RNK (TaKaRa MiniBEST Universal RNA extraction kit, 9767A, Takara Bio, USA), a uzorci su pročišćeni prema protokolima proizvođača. Izolovana RNK (1 ug) je sintetizirana u cDNK korištenjem TR kompleta reagensa (PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser, RR047A, Takara Bio, USA). Korištenje SYRB Green Realtime PCR Master Mixa (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, SAD) i QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR instrument, A28132, Thermo Fisher Scientific, SAD), mašina za PCR u realnom vremenu Nivoi ekspresije gena su standardizovani za održavanje gena gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH). Prajmeri korišćeni u ovoj studiji prikazani su u tabeli 2. Eksperimenti su izvedeni u duplikatu za tri nezavisna ponavljanja. Analiza krive topljenjaje izvršeno za svaki set prajmera.
6) Western blot analiza
Proteinski lizati iz ćelija fibroblasta ekstrahovani su puferom za lizu (EzRIPA Lysis Kit, WSE-7420; ATTO Corporation, Japan). Za kvantificiranje proteina korištena je Bradfordova metoda.Jednake količine proteina su pomiješane sa 5X puferom za uzorke (TLP-102-01, TransLab, Korea) i denaturirane na 99 stepeni 10 minuta. Proteini su razdvojeni sa 10% SDS-PAGE na 150 V tokom 150 minuta i prebačeni na PVDF membrane (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Japan). Membrane su blokirane sa 0,5 posto goveđeg serumskog albumina (BSA, A4503-10G; Sigma) u trajanju od 1 sata i isprane sa Tris puferiranim fiziološkim rastvorom koji uključuje Tween-20 (10X TBS sa Tween 30, TR{ {17}}; Biosesang, Koreja) tri puta; membrane su zatim inkubirane s primarnim antitijelima protiv MMP-1 (rekombinantno anti-MMP1 antitijelo [EP1249Y], ab134184, Abcam, SAD), -Actin (Anti{24}}Actin (N-tern) i PA0207 (Abfrontier , Koreja) na 4 stepena preko noći. Nakon ispiranja, membrane su tretirane anti-zečjim IgG-peroksidazom hrena (HRP) (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody, #7074; Cell Signaling Technology,USA) kao sekundarnim antitelom Detekcija hemiluminiscencije izvršena je pomoću ECL Prime western blotting reagensa (GE Healthcare, SAD) i ATTO WSE-6100 LuminoGraph (ATTO Corporation, Japan). Za kvantitativnu analizu, snimljene slike su analizirane sa Image softver (CS analizator 4, ATTO korporacija, Japan).
7) Statistička analiza
Statistička analiza je izvršena korišćenjem GraphPad Prism verzije 3.03 za Windows (GraphPad Software, SAD). Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost±SD za 3 eksperimenta. NeuparenKorišten je Studentov t-test i p vrijednosti<0.05 were considered statistically significant.
2. In vivo evaluacija efikasnosti
1) Reagensi i kozmetički proizvodi
Testni proizvodi su bili losion za kožu, esencija krema i krema za oči; te kreme su sadržavale 1 posto MHE kao aktivni sastojak prikazan u tabeli 3.
2) Ljudski učesnici
Svi volonteri su se složili sa svrhom i sadržajem testa i potpisali pismeni informirani pristanak prije početka testiranja. Nisu smjeli koristiti druge proizvode za njegu kože, a testirani proizvodi su nanosili na lice po redosljedu koža-očiočna krema (samo na vranjim nogama)-esencija krema-losion krema. Studija je provedena u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije i odobrena od strane Institucionalnog odbora za reviziju Korejskog nacionalnog instituta za bioetičku politiku (#P01-202108-13-001).
3) Test efikasnosti
U ovoj studiji učestvovala je dvadeset i jedna ispitanica starosti između 45 i 55 (srednja vrijednost ±SD 50,81±2.86) godina sa normalnom kožom. Testni proizvodi su nanošeni dva puta dnevno (ujutro i uveče) tokom 4 nedelje. Učesnici su posjećivali istraživački centar svake 2 sedmice, a testna mjesta su mjerena u laboratoriji, gdje su temperatura okoline i relativna vlažnost održavani na 22±2 stepena, odnosno 50±5 procenata. Učesnici su se aklimatizirali 20 minuta u laboratoriji nakon pranja lica i procijenjeni su hidratacija, elastičnost, tekstura i vranine kože. Hidratacija kože je mjerena pomoću Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH, Keln, Njemačka); elastičnost je izmjerena pomoću Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Keln, Njemačka), a tekstura i vranine su mjerene pomoću DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, francuski).
4) Procjena neželjenih reakcija kože
Neželjene reakcije su provjeravane prilikom svake posjete upitnikom i posmatranjem. U evaluaciji su subjektivni parametri klasifikovani kao svrab, bockanje, škakljanje, peckanje, peckanje,ukočenost i zatezanje, a objektivni parametri su klasifikovani kao eritem, edem, ljuspice i papule.
5) Statistička analiza
Podaci su analizirani pomoću softvera SPSS®. Statistička značajnost razlika između vremenskih tačaka određena je analizom ponovljenih mjera; p-vrijednost<0.05 smatralo se statistički značajnom. Stopa promjene ( posto ) od osnovne vrijednosti izračunata je na sljedeći način:
Stopa promjene=((nakon tretmana-osnovna linija)/osnovna linija)×100 posto
