Duga nekodirajuća RNA KCNQ1OT1 reguliše protein kinazu CK2 preko MiR-760 u starenju i ograničenju kalorija

Ključne riječi:KCNQ1OT1; duga nekodirajuća RNK; starenje;ograničenje kalorija; protein kinaza CK2;miR-760

Kliknite ovdje da biste dobili više informacija o Cistanche efektima protiv starenja

1. Uvod

Duge nekodirajuće RNK (lncRNA) su transkripti s veličinom većom od 200 nukleotida koji nisu prevedeni u proteine. LncRNA su odgovorne za različite funkcije, uključujući regulaciju transkripcije ucisilitrans, organizacija nuklearnih domena i interakcija s mikroRNA (miRNA) [1–3]. Konkretno, razumijevanje mreže interakcija lncRNA i miRNA pruža novu perspektivu na regulatorne mehanizme gena. lncRNAKCNQ1OT1, čiji je puni nazivKCNQ1preklapajući transkript 1, je transkript od 91 kb koji je transkribovan pomoću RNA polimeraze II u antisense orijentaciji, u odnosu naKCNQ1[4,5]. KCNQ1OT1prisutan je u intronu 10 gena KCNQ1. TheKCNQ1lokus se nalazi na kratkom kraku ljudskog hromozoma 11 (11p15.5). Kroz regrutovanje G9a i H3K27 histon metiltransferaze PRC2 (polycomb represivni kompleks 2),KCNQ1OT1stupa u interakciju s hromatinom kako bi formirao složenu strukturu preklapanja, a zatim utišava višestruke ciljne gene [6]. Osim toga,KCNQ1OT1uključen je u nekoliko poremećaja, uključujući bolesti srca, cerebralni ishemijski moždani udar, aterosklerozu, piroptozu i razne karcinome (želuca, jajnika i kolorektalnog) vezivanjem za različite miRNA (na primjer, miR-760, miR{{1} }a, miR-452-3p, miR-320a, miR-701-3p i miR-2054), od kojih svi regulišu ekspresiju svojih ciljnih gena [7–13]. Ipak, biološke ulogeKCNQ1OT1starenje i ograničenje kalorija (CR) ostaju nejasni.

Ćelijsko starenje je terminalno zaustavljanje proliferacije, stimulirano nekoliko ćelijskih stresova kao što su skraćivanje telomera, onkogena aktivacija i oksidativni stres [14,15]. Prethodne studije su identifikovale protein kinazu CK2 (CK2), sastavljenu od dva katalitička ( i/ili 0 ) podjedinice i dvije regulatorne podjedinice, kao regulator starenja. CK2inhibicija pokreće ekspresiju nekoliko markera starenja, uključujući i one povezane sa starenjem -galaktozidaza (SA- -gal) aktivnost [16], p53–p21Cip1/WAF1aktivacija ose [17], proizvodnja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) [18], formiranje heterohromatinskih žarišta (SAHF) povezano sa starenjem [19], i ekspresija sekretornog fenotipa povezanog sa starenjem (SASP) [20]. miR-186, miR-216b, miR-337-3p i miR-760 promoviraju ćelijsko starenje inhibiranjem CK2 [21,22]. Restrikcija kalorija (CR), koja se sastoji od kroničnog smanjenja ukupnog unosa kalorija bez pothranjenosti, najuspješnija je strategija za odlaganje ćelijskog starenja [23]. Nedavno je objavljeno da CK2 pojačano regulira CR i izaziva autofagiju [24]. Međutim, molekularni mehanizam koji leži u osnovi CR-posredovane regulacije CK2 ostaje nejasan.

U ovoj studiji, potencijalna ulogaKCNQ1OT1u starenju i CR je procijenjen.KCNQ1OT1nokdaun je podstakao fenotip starenja putem smanjenja CK2 u ćelijama humanog raka MCF-7 i HCT116 i IMR-90 ćelijama fibroblasta pluća. Ovo istraživanje ukazuje na toKCNQ1OT1reguliše CK2 izražavanje kroz interakciju sa miR-760 tokom starenja i CR, što sugerira daKCNQ1OT1može biti nova terapijska meta za bolesti povezane sa starenjem.

2. Rezultati

2.1. KCNQ1OT1 Aktivacija SA-a izazvana nokdaunom -gal Bojenje, p53-p21Cip1/WAF1Pathway i H3K9 trimetilacija preko CK2 Utišavanje u ljudskim ćelijama raka

MCF-7 i HCT116 ćelije su transficirane saKCNQ1OT1siRNA da istraži umiješanostKCNQ1OT1u starenju.KCNQ1OT1knockdown upregulated SA- - aktivnost žena (Slika1A). Osim toga, rezultati imunoblota to su pokazaliKCNQ1OT1 nokdaunpovećao nivoe p53 i p21Cip1/WAF1i obeležja SAHF (povećana trimetilacija H3K9 (H3K9me3) i smanjena acetilacija H3K9 (H3K9Ac)) (Slika1B). Ranije je objavljeno da smanjenje CK2 indukuje ove markere starenja (aktivacija SA- -gal bojenje, p53-p21Cip1/WAF1put i SAHF) [16,17,19]. Stoga je ispitano da liKCNQ1OT1stupa u interakciju sa CK2. Zanimljivo, ektopična CK2 izraz poništio indukciju SA- -galna aktivnost, str.53, str.21Cip1/WAF1, i H3K9me3, posredovanKCNQ1OT1smanjenje regulacije (Slika1A,B). Nadalje,KCNQ1OT1 nokdaunsmanjio nivo proteina CK2 (Slika1B). Ovi rezultati zajedno ukazuju na toKCNQ1OT1knockdown inducira ćelijsko starenje smanjenjem CK2.

2.2. KCNQ1OT1 Ekspresija SASP faktora izazvana srušenjem i generisanje ROS-a preko CK2 Utišavanje u ljudskim ćelijama raka

Ispitivano je da liKCNQ1OT1smanjena regulacija povećala je ekspresiju SASP faktora zbog izvještaja da stare ćelije luče proinflamatorne faktore [14,15]. KCNQ1OT1nokdaun je izazvao ekspresiju SASP faktora, uključujući interleukin (IL)-1 , IL-6 i matriks metaloproteinaza (MMP) 3 (Slika2A). KCNQ1OT1smanjenje regulacije povećalo je količinu intracelularnog ROS-a jer je oksidativni stres glavni uzrok starenja [14,15]. U tu svrhu transficirane su ćelije HCT116 i MCF{1}}KCNQ1OT1siRNA i obojena CM-H2DCFDA.KCNQ1OT1Knockdown je povećao proizvodnju ROS-a, što pokazuje desni pomak u FL fluorescenciji tokom protočne citometrije (Slika2B). Ranije je objavljeno da smanjenje CK2 inducira ekspresiju SASP [20] i ROS generacija [18]. Ektopična ekspresija CK2 ukinuo indukciju ekspresije SASP faktora i generisanja ROS-a, posredovanKCNQ1OT1smanjenje regulacije (Slika2A,B). Zbirno, ovi rezultati ukazuju na toKCNQ1OT1Knockdown inducira stvaranje ROS i upalu kroz smanjenje CK2.

Slika 1. KCNQ10T1 indukovana aktivacija SA--gal bojenja, p53-p21CipI/WAFpathwaya i H3K9 trimetilacije putem CK2x utišavanja u ljudskim ćelijama raka. HCT116 i MCF{{10}} ćelije su transficirane sa KCNO10T1 siRNA dva dana u odsustvu ili prisustvu pcDNA3.1.HA-CK2x. (A) Ćelije su obojene 5-bromo-4-hloro-3-indolil--D-galaktozidom, a reprezentativne slike su dobijene pri 20x uvećanju (gornje). Traka razmjera=100 um. Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta. Grafikoni predstavljaju procenat ćelija obojenih u plavo (dole). (B) Imunobloting je korišten za određivanje nivoa svakog proteina korištenjem specifičnih antitijela (gornja). 3-Aktin je korišten kao kontrola. Grafikoni predstavljaju kvantitaciju svakog proteina u odnosu na B-aktin (dolje). Podaci su prikazani kao srednji SEM.* p < 0,05; ** p < 0,01, ** p < 0,001.H3K9me3, histon H3 Lys9 trimetilacija; H3K9AC, H3 Lys9 acetilacija.

Slika 2. KCNQ10T1 ekspresija faktora sekretornog fenotipa povezanog sa starenjem (SASP) i stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) putem CK2x utišavanja u ljudskim ćelijama raka HCT116 i MCF{6}} ćelije su transficirane sa KCNO1{ {20}}T1 siRNA dva dana u odsustvu ili prisustvu pcDNA3.1-HA-CK2a. (A) Nivo svake mRNA određen je lančanom reakcijom reverzne transkripcije-polimeraze (RT-PCR) korištenjem specifičnih prajmera (gornji). Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta. Grafikoni predstavljaju kvantitaciju svake mRNA u odnosu na 6-aktin (dole). (B) Ćelije su inkubirane sa 10 UM CM-HDCEDA Intenzitet fluorescencije je određen analizom protočne citometrije (gornja). Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta. Grafikoni pokazuju relativni nivo fluorescencije (dole) Podaci su prikazani kao srednja vrednost 士 SEM. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

2.3. KCNQ1OT1 je bio uključen u ekspresiju SASP faktora posredovanu lipopolisaharidom (LPS) putem utišavanja CK2 u ljudskim ćelijama raka

Zato što tretman LPS-om uzrokuje ćelijsko starenje smanjenjem CK2 [20], testirano je da li je LPS smanjenKCNQ1OT1izraz. Liječenje LPS-om (6µg/µL) smanjio nivo transkriptaCK2 iKCNQ1OT1u ljudskim ćelijama raka (Slika3A). Štaviše, efekat odKCNQ1OT1ispitivana je ekspresija SASP faktora u ćelijama tretiranim LPS. Međutim, liječenje LPS-om (6µg/µL) povećan SASP faktor (IL-1 , IL-6 i MMP3) ekspresija u ljudskim ćelijama raka; dodatni tretman sa pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36,181–37,140) poništio je LPS posredovanu indukciju SASP faktora (Slika3B). Ranije je pokazano da usklađeno djelovanje miR-760, miR- 186, miR-337-3p i miR-216b stimulira prerano starenje kroz utišavanje CK2 proteina u stanicama HCT116 [21], i da su miR-760 i miR-186 povećani u replikativnim senescentnim IMR-90 ćelijama [22]. Određeni su obrasci ekspresije ovih miRNA na koje utiče tretman sa LPD. Kvantitativna analiza lančane reakcije polimeraze (qPCR) u realnom vremenu otkrila je da se količina miR-760 povećala za više od 200 posto u HCT116 i MCF{4}} ćelijama tretiranim LPS (6µg/µL), u poređenju sa kontrolnim ćelijama. miR-186 nije pojačano reguliran LPS tretmanom, a miR-337-3p i miR-216b su različito regulirani u ovim ćelijama (Slika3C). Stoga, ovi rezultati zajedno pokazuju da je LPS povećao količine miR-760 putem smanjenjaKCNQ1OT1, što rezultira CK2 starenje posredovano smanjenjem regulacije.

Slika 3. KCNO10T1 je bio uključen u ekspresiju faktora sekretornog fenotipa (SASP) posredovanog lipopolisaharidom (LPS) putem utišavanja CK2x u ljudskim ćelijama raka. (A) HCT116 i MCF-7 ćelije su tretirane sa LPS (6 ug/uL) dva dana. Nivo svake mRNA je određen RI-PCR upotrebom specifičnih prajmera (gore). Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta. B-Actin je korišten kao kontrola. Grafikoni predstavljaju kvantitaciju svake mRNA u odnosu na B-aktin (dole). (B) Ćelije su tretirane LPS-om (6 ug/uL) u odsustvu ili prisustvu pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) dva dana. Nivo svake mRNA je određen RI-PCR upotrebom specifičnih prajmera (lijevo). Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta da je 3-aktin korišten kao kontrola. Grafikoni predstavljaju kvantitaciju svake mRNA u odnosu na -aktin (desno). (C) Ćelije su tretirane LPS-om (6 ug/uL) dva dana ukupna RNK je izolirana iz ćelija i podvrgnuta PCR analizi da bi se odredili relativni nivoi miR-760, miR-186, miR{{ 26}}p, i miR-216b koristeći RNU48 za normalizaciju. Podaci su prikazani kao vrednosti 士 SEM.*p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

2.4. KCNQ1OT1 Unaprijeđen CK2 Sponging miR-760 u ljudskim ćelijama raka

Zatim je ispitano da liKCNQ1OT1reguliše CK2 izraz preko miR-760. HCT116 i MCF-7 ćelije su transficirane sa pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36,181–37,140) ili KCNQ1OT1 siRNA, zajedno sa miR-760 mimikom ili inhibitorom (sekvencije prikazane u Dodatnoj tabeli S1). Ektopična ekspresijaKCNQ1OT1(36,181–37,140) povećao nivo mRNACK2 , dok je dodatni tretman sa miR-760 mimikom potisnutKCNQ1OT1-posredovanoCK2 regulacija nagore (Slika4A). U kontrastu,KCNQ1OT1nokdaun je smanjio nivo mRNACK2 , dok je dodatno liječenje miR-760 inhibitorom potisnutoKCNQ1OT1posredovano u nokdaunuCK2 smanjenje regulacije (Slika4B). I miR-760 imitator i inhibitor nisu mogli promijeniti količinuKCNQ1OT1, što ukazuje da miR-760 nije bio uzvodni regulatorKCNQ1OT1. Sve u svemu, ovi rezultati ukazuju na toKCNQ1OT1povećava količinuCK2 mRNA spužvavanjem miR-760. Dodatna slika S1 prikazuje sekvence i mjesta vezivanjaKCNQ1OT1, miR-760 iCK2 mRNA, određena korištenjem TargetScan i Miranda.

Slika 4. KCNQ10T1 je pojačao regulaciju CK2x uništavajući miR-760 u ljudskim ćelijama raka. (A) HCT116 i MCF-7 ćelije su transficirane sa pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) dva dana u odsustvo ili prisustvo miR-760. (B) HCT116 i MCF-7 ćelije su transficirane sa KCNO10T1 siRNA dva dana u odsustvu ili prisustvu miR-760 inhibitora. Nivo svake mRNK je određen RT-PCR upotrebom specifičnih prajmera (gore). Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta. Grafikoni predstavljaju kvantitaciju svake mRNA u odnosu na B-aktin (dole). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost 士 SEM.* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

2.5. Stanje CR pojačano regulirano CK2x miR-760 smanjenjem preko KCNQ1OT1 regulacije u ljudskim stanicama raka

Pretpostavljalo se da je ekspresija KCNQ1OT1 povećana u CR stanju jer je nivo CK2x mRNA bio povećan u CR stanju [24]. HCT116 i MCF-7 ćelije su inkubirane u CR uslovima da bi se testirala ova hipoteza. Kao što je prikazano na slici 5A, ekspresija KCNO10T1 i CK2x je indukovana CR u ovim ćelijama gde je dodatni tretman sa KCNQ10T1 siRNA potisnuo CR-posredovanu CK2 indukciju, što ukazuje na KCNQ10T1 kao pozitivan regulator CK2x u uslovima CR. Dodatno, analiza sa qPCR u realnom vremenu pokazala je da se nivo miR-760 smanjio za 70 posto u CR uslovima, dok su nivoi miR-186, miR-216b i miR{{22 }}p u CR uslovi su nepromijenjeni ili povećani (slika 5B). Zatim je ispitan efekat miR-760 na CR-posredovanu regulaciju CK2x. Tretman miR-760 oponaša regulaciju CK2x posredovane supresijom CK2x, što ukazuje na miR-760 kao glavnog negativnog regulatora stanja CK2ain CR (slika 5C). Konačno, gPCR analiza u realnom vremenu otkrila je da tretman sa KCNO10T1 siRNA povećava nivoe miR-760, dok CR potiskuje indukciju miR-760 posredovanu knockdownom KCNO10T1 (slika 5D). Sve u svemu, ovi rezultati ukazuju da je CR smanjio miR-760 tako što je povećao regulaciju KCNQ10T1, što je rezultiralo povećanjem CK2x u ljudskim ćelijama raka. Budući da je objavljeno da lncRNA SNHG6 također djeluje kao asunđer miR-760 u CRC ćelijama [25], testirano je da li se CR povećavaSNHG6 izraz. Kako god,SNHG6izraz je ostao nepromijenjen u CR stanju (podaci nisu prikazani)

Slika 5. Uvjet s ograničenjem kalorija (CR) povećao je CK2x smanjenjem miR-760 preko KCNO10T1 regulacije u ljudskim ćelijama raka. (A,C i D) HCT116 i MCF-7 ćelije su transficirane sa KCNO1{{20}}T1 siRNA (A i D) ili miR-760 (C) tokom 1,5 dana a zatim inkubiran u CR uslovima sedam sati. (B) HCT116 i MCF-7 ćelije su inkubirane u CR uslovima sedam sati. (A,C) Nivo svake mRNA određen je RT-PCR upotrebom specifičnih prajmera (gore) Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta. 3-Aktin je korišten kao kontrolni graf za predstavljanje kvantifikacije svake RNK u odnosu na B-aktin (dolje). (B,D) Ukupna RNK je izolirana iz ćelija i podvrgnuta analizi pomoću qPCR koristeći RNU48 za normalizaciju da bi se odredili relativni nivoi naznačenih miRNA Podaci su prikazani kao srednja vrijednost plus SEM * y < 0,05.*p < 0,01;** * p < 0,001.

2.6. KCNQ1OT1 je smanjen tokom replikativne senescencije u ljudskim ćelijama fibroblasta pluća, koje su CR uvjeti spasili

Budući da je CK2x smanjen u replikativnim senescentnim ćelijama i ostarjelim tkivima [16], ispitano je da li je KCNO1OT1 smanjen tokom starenja u IMR-90 ćelijama humanih fibroblasta pluća. Nokdaun KCNO10T1 smanjio je nivo mRNK ćelija CK2xin IMR-90 (slika 6A). Suprotno tome, KCNO1OT1 nokdaun je povećao aktivnost SA-P-gal u IMR-90 ćelijama, a ektopična ekspresija CK2a poništila je indukciju aktivnosti SA-3-gal posredovanu smanjenjem regulacije KCNO1OT1 (slika 6B). Da bi se utvrdilo kako se ekspresija KCNQ10T1 smanjila replikacijskim starenjem, IMR-90 ćelije su više puta proslijeđene sve dok nije uočeno stanje nalik starenju. Većina ćelija na PDL 47 pozitivno je obojeno na SA-B-gal, dok je samo nekoliko njih pozitivno obojeno na SA-B-gal među ćelijama ranog prolaza (PDL 34) (podaci nisu prikazani). Nivoi transkripta KCNO10T1 smanjeni su za 60 procenata u replikativnim senescentnim ćelijama (PDL 47), u poređenju sa ćelijama ranog prolaza (PDL 34), što ukazuje da je KCNO10T1 bio smanjen tokom replikativnog starenja. Konačno, CR uslovi su povećali KCNO1OT1 za 150 procenata u ćelijama ranog prolaza (PDL 34) u poređenju sa normalnim kalorijskim uslovima. Međutim, CR uslovi su povećali KCNO10T1 jače (za 250 posto) u replikativnim senescentnim ćelijama (PDL 47) u poređenju sa normalnim kalorijskim uslovima. što ukazuje da CR može spasiti smanjenu ekspresiju KCNO10T1 i CK2x, posredovanu replikativnim starenjem (slika 6C). Kolektivno, ovi podaci ukazuju na to da replikativno starenje smanjuje ekspresiju CK2x smanjenjem KCNQ10T1, i da CR može potisnuti replikativno starenje putem KCNO1OT1-CK2 ose

Slika 6. KCNQ1011 je smanjen tokom replikativnog starenja u ćelijama fibroblasta ljudskih pluća, koje je bilo moguće spasiti uslovima ograničenja kalorija (CR). (A) IMR-90 ćelije (PDI36) su transficirane sa KCNO10T1 siRNA. Nivo svake mRNK je određen RT-PCR upotrebom specifičnih prajmera (gore). Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta3-Aktin je korišten kao kontrola. Grafikoni predstavljaju kvantitaciju svake mRNA u odnosu na 6-aktin (dole). (B) IMR-90 ćelije (PDL 36) su transficirane sa KCNO10T1 siRNA dva dana u odsustvu ili prisustvu pcDNA3.1-HA-CK2a. Ćelije su obojene 5-bromo-4-kloro3-indolil--D-galaktozidom, a reprezentativne slike su dobijene pri 20x uvećanju (lijevo) Scale bar=100 um . Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta. Grafikoni predstavljaju procenat ćelija obojenih u plavo (desno). (C) IMR-90 ćelije PDL 34 i PDL 47 inkubirane su u CR uslovima sedam sati. Nivo svake mRNA je određen RT-PCR upotrebom specifičnih prajmera (lijevo). Prikazani su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta3-Aktin je korišten kao kontrola. Grafikoni predstavljaju kvantitaciju svake mRNA u odnosu na 6-aktin (desno). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost 土 SEM.* p < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001. (D) Mogući model koji ilustruje uloge KCNO10T1 za starenje i CR. PDL, nivo udvostručenja stanovništva