Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Mi Young Ahn1*, Ban Ji Kim1, Ha Jeong Kim1, Jae Sam Hwang1, Yi-Sook Jung2 i Kun-Koo Park3

Cistanche ima efekat protiv starenja

Abstract

Pozadina: Ova studija imala je za cilj evaluacijuprotiv starenjaefekat novopripremljenog jedinjenja dobijenog od insekata, glikozaminoglikana balege (GAG), koji se daje intraperitonealno starim SD štakorima kao deo njihove ishrane tokom 1 meseca. Utvrđeno je da je primjena GAG insekata povezana sa smanjenjem oksidativnog oštećenja, nivoa hepato-ćelijskih biomarkera, sadržaja proteina karbonila i koncentracije malondialdehida. Theprotiv starenja-povezani molekularno genetski mehanizmi GAG balege bube još uvijek nisu u potpunosti razjašnjeni.

Rezultati: Catharsius molossus (vrsta balege) GAG (CaG) posjedujeprotiv starenjaaktivnosti; smanjio je nivo kreatinin kinaze u serumu, imao vazorelaksansu aorte i kardioprotektivno djelovanje, te održava normalan nivo glukoze kod tretiranih pacova. Analiza mikromreža je obavljena sa 30 K cDNA klonskim nizom štakora kako bi se identificirali profili ekspresije gena 14-mjesečnih SD štakora tretiranih glikozaminoglikanom balege bube 5 mg/kg (CaG5) tokom 1- mjesečnom periodu, što je urađeno da bi se ispitala njegovaprotiv starenjaefekat u poređenju sa Bombus ignitusom (vrsta bumbara), maticom GAG 5 mg/kg (IQG5) ili hondroitin sulfatom 10 mg/kg. CaG5 i IQG5 su imali izražene antiinflamatorne efekte, što je dovelo do inhibicije slobodne masne kiseline, mokraćne kiseline, sGPT, IL-1 beta i CK vrijednosti. Osim toga, uočeni su antikoagulantni i antitrombotički efekti: koncentracija faktora 1 (fibrinogen) je povećana u plazmi pacova tretiranoj CaG. Grupa štakora tretirana CaG5-, u poređenju sa kontrolnom, pokazala je pojačanu regulaciju 131 gena, uključujući lipokalin 2 (Lbp) i inhibitor serin peptidaze, Kaszal tip 3 (Spink3), i 64 gena sa smanjenom regulacijom, uključujući lizil oksidazu (Lox ), serin dehidrataza (sds) i retinol saturaza (Retsat).

Zaključak: Naši podaci sugeriraju da glikozaminoglikan balege može biti koristan tretman za stare pacove, što ukazuje na njegov potencijal kao terapeutskog biomaterijala za starenje.

Ključne riječi: efekat protiv starenja, balega buba (Catharsius molossus), kraljica B. ignitus, glikozaminoglikan

Pozadina

koriste se putem pročišćavanja, ekstrakcije i identifikacije moćnih aktivnih sastojaka, kao funkcionalna hrana ili lijekovi. Ekstrakti balege bube Catharsius molossus, koji se nalazi u Kini, pokazali su izraženu fibrinolitičku aktivnost i antioksidativne i antihiperglikemijske efekte na pacovima koji su hranjeni hranom sa visokim sadržajem masti [9, 10]. Sadržaj proteina karbonila u krvi i koncentracija malondialdehida u tkivu jetre tretiranog etanolom balege ili ekstraktom acetona tokom 1-mjesečnog perioda, značajno su smanjeni u odnosu na kontrolu [10]. Nedavno je otkriveno da peptid korejskog balege, LLCIALRKK-NH2, koji je 9-mer peptid izveden iz Copris tripartitus Coprisin, ispoljava baktericidno djelovanje protiv E. coli i antimikrobno djelovanje uzrokujući ozbiljno oštećenje DNK , koji indukuje smrt nalik apoptozi [11]. Pčelarski proizvod, alkoholni ekstrakt B. ignitus queen (BIQ) ima najveću potencijalnu efikasnost među svim ekstraktima bumbara koji su testirani za liječenje upale kod SD pacova, jer je značajno smanjio edem šapa [12]. Dakle, pripremili smo GAG dobijene od najvećeg mogućeg broja matica C. molossus ili B. ignitus kako bismo testirali njihoveprotiv starenjasvojstva. Starenje podrazumijeva progresivno smanjenje fizioloških kapaciteta organizma, a manifestuje se nagomilanim promjenama i destabilizacijom na nivou cijelog sistema [13]. Starenje je također povezano s diferencijalnim obrascem ekspresije gena koji ukazuje na smanjenu reakciju na stres među metaboličkim i biosintetičkim genima [14]. Konkretno, povećanje visceralnog masnog tkiva povezano sa godinama ili gojaznošću obično je praćeno kroničnom upalom niskog stupnja, za koju se pretpostavlja da je uzrok različitih metaboličkih bolesti uključujući rak, kardiovaskularne bolesti i, najistaknutije, tip dva dijabetesa [15]. Ovi GAG-ovi insekata mogu se koristiti u polju koji se brzo razvija s perspektivom korištenja tkivnog inženjeringa i biomaterijala kao novih terapija [16].

U ovoj studiji izvještavamo da je GAG ​​iz balege i BIQ prikazanprotiv starenjasvojstva i stoga ova jedinjenja imaju velika obećanja za upotrebu kaoprotiv starenjaagenti. Također, demonstriramo potencijalnu vrijednost glikozaminoglikana balege C. molossus u smanjenju štetnih aspekata starenja, mjereno iu serumu i u obrascima ekspresije gena 14-mjesečnih SD pacova nakon tretmana u trajanju od 1 mjeseca.

Metode

Materijali

Priprema glikozaminoglikana od insekata

Osušeni C. molossus je kupljen na lokalnom tržištu u Kini; bumbara (kraljica Bombus ignitus) uzgajana je i sušena zamrzavanjem na Odsjeku za poljoprivrednu biologiju Nacionalne akademije poljoprivrednih nauka, Južna Koreja. Hondroitin sulfat i svi reagensi su isporučeni iz Sigma Aldrich (St. Louis, Mo., SAD).

Svaki od jednog kilograma (1 kg) osušenog insekata natopljen je i ekstrahiran tri puta etanolom ultrazvučnom metodom (Branson, Colorado, MI, USA) u trajanju od 30 min. Ostaci izdvojeni iz alkoholnih ekstrakata su dva puta odmašćeni sa 2 zapremine acetona. Približno 200 g osušenog, odmašćenog i usitnjenog praha suspendirano je u 2 L 0.05 M natrijum karbonatnog pufera (pH 9). Suspenzija je inkubirana 48 h na 60 stepeni nakon dodavanja 28 ml (1,4 posto) Alcalase (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo., SAD). Digestivna smjesa je ohlađena na 4 stepena i dodana je trihlorosirćetna kiselina do konačne koncentracije od 5 posto. Uzorak je pomiješan, ostavljen da stoji 1 h, a zatim centrifugiran 30 minuta na 8000 × g (Hanil Science Industrial, Incheon, Južna Koreja). Tri zapremine 5% kalijum acetata u etanolu dodane su u jednu zapreminu supernatanta. Nakon miješanja, suspenzija je čuvana preko noći na 4 stepena, a zatim centrifugirana. Precipitat od 20 g rastvoren je u 40 ml 0,2 M NaCl i centrifugiran. Cetilpiridinijum hlorid (5 procenata) je dodan u 0,2 puta zapreminu supernatanta, a talog je sakupljen centrifugiranjem. Talog je rastvoren u 20 ml 2,5 M NaCl. Dodano je pet zapremina etanola, a talog je odvojen centrifugiranjem. Precipitat je otopljen u vodi i dijaliziran prema 100 zapremina vode [17], a dijalizirani sirovi glikozaminoglikan je osušen zamrzavanjem kako bi se dobilo oko 1,1 g CaG, 4,89 g IQG u obliku praha. Sirovi GAG je stavljen na DEAE Sephadex A-25 kolonu za gel hromatografiju (40 x 1,2 cm) ekvilibriranu sa 50 mM fosfatnog pufera (pH 7,4). Frakcije su eluirane korišćenjem linearnog gradijenta natrijum hlorida od 0 do 2,5 M NaCl u fosfatnom puferu pri brzini protoka od 20 ml/h, a dijalizovani glikan je osušen zamrzavanjem do čistog GAG.

Životinje

Sprague Dawley (SD) pacovi (mužjaci), u dobi od 8- mjeseci, nabavljeni su od Samtako Co. Ltd. (Osan, Koreja). Sve procedure su bile u skladu sa NIH smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja. Svi eksperimenti su odobreni od strane Etičkog odbora za laboratorijske životinje Nacionalne akademije poljoprivrednih nauka, RDA, Južna Koreja (NAAS1503) i slijedili su nacionalne smjernice za njegu i korištenje životinja (individualni smještaj). Štakori su se aklimatizirali 6 mjeseci u normalnim uvjetima uzgoja (23 ± 2 stepena C, 55 ± 10 posto vlažnosti i 12 h ciklusa svjetlo/mrak) i hranjeni su normalnom prehranom (D10001, AIN-76Dijeta za glodare, istraživanje Diet Inc., New Brunswick, NJ, SAD) i voda ad libitum. 14-Mjesečni štakori su podijeljeni u 4 tretirane grupe od po 10 pacova i raspoređeni prema sličnosti u težini (680,2 ± 9,20 g). Tretmani su davani u PBS-u dnevno i svaki je davan intraperitonealno.

Grupe su bile kontrolne, date su 5 mg/kg CaG (CaG5), 5 mg/kg IQG (IQG5) i 10 mg/kg CS (CS10) (Sigma Aldrich Co., SAD). Svaka grupa je održavana na normalnoj prehrani (AIN-76Dijeta za glodare, dijeta za istraživanje) i tretman uzorkom 1 mjesec (šema 1).

Težina masnog tkiva

Određeni su omjeri abdominalne i epididimalne masti prema tjelesnoj težini. Mjerenja su obavljena nakon žrtvovanja na kraju perioda tretmana od 1- mjeseca.

Gustina adipocita

Izrezani organi i masno tkivo fiksirani su 10 posto neutralnim formalinom. Nakon ugradnje parafina, obojeni su hematoksilinom i eozinom, te toluidin plavim O, pregledani svjetlosnom mikroskopijom (Leica CTR6000, Hesse, Njemačka) i fotografirani. Gustina adipocita (ćelije/mm2) određena je u tretiranom i kontrolnom tkivu toluidin plavom O bojenjem (originalno uvećanje, x400).

Uzimanje krvi i krv, plazma, analiza seruma

Na četiri grupe pod nazivom CON, CaG5, IQG5, CS10 (n =10), nakon mjesec dana liječenja, krv (~5 ml) je sakupljena iz stražnje šuplje vene pod laganom inhalacijom CO2 i korištena za mjerenja hemije u serumu. Ispitani parametri su uključivali fosfolipide, hijaluronsku kiselinu, slobodnu masnu kiselinu, albumin, alkalnu fosfatazu (ALP), glutaminsku oksaloacetatnu transaminazu (GOT), glutaminsku piruvičnu transaminazu (GPT), laktičnu dehidrogenazu (LDH), CK (fosfazokreatininu glutaminu). , ukupni holesterol trigliceridi, HDL holesterol, LDL holesterol, kreatinin, azot uree u krvi (BUN), ukupni protein, mokraćna kiselina i c-reaktivni protein (CRP). Svi parametri su evaluirani pomoću autoanalizera (Hitachi 7060 automatski klinički analizator, Tokio).

Uzimanje krvi i analiza plazme za otkrivanje antikoagulantne aktivnosti

Nakon 1-mjesečnih tretmana, približno 4 ml plazme je sakupljeno iz stražnje šuplje vene pod laganom inhalacijom CO2 i centrifugirano. Supernatant je korišten za vrijeme zgrušavanja kao test antikoagulantne aktivnosti: aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTT), trombinsko vrijeme, protrombinsko vrijeme i faktor 1 (fibrinogen) kao test fibrinolitičke aktivnosti koristeći gore spomenuti automatski klinički analizator prema priručniku Green Cross Lab-a.

Oksidativno oštećenje lipida

Da bi se odredilo oksidativno oštećenje lipida u hepatocitima štakora, mjereni su nivoi malondialdehida (MDA) testom peroksidacije lipida koristeći metodu boje koja uključuje reaktivne supstance tiobarbiturne kiseline (TBARS) na 535 nm [18].

Oksidativno oštećenje proteina

Za određivanje sadržaja karbonila korišteni su supernatanti homogenata jetre i krv, dobiveni centrifugiranjem. Proteinski oksidativni stres procijenjen je mjerenjem sadržaja karbonila proteina u krvi. Sadržaj karbonila je određen enzimskim imunotestom prema protokolu proizvođača za OxiSelect™ protein karbonil ELISA komplet (Cell Biolabs, Inc., San Diego, Kalifornija, SAD). CAT aktivnost (U/mg protein) mjerena je na osnovu CAT-posredovane razgradnje H2O2 [19].

Preparat homogenata jetre za detekciju oksidativnih enzima

Otprilike četiri grupe nazvane CON, CaG5, IQG5, CS10, tkiva jetre su homogenizovana na ledu u 10-proizvodnom rastvoru za ekstrakciju proteina PRO-PREP™ pufera za lizu 10- (iNtRON, Busan, Koreja). Supernatant homogenata jetre nakon centrifugiranja (800 g, 10 min) ispitan je na katalazu, glutation peroksidazu, glutation s-transferazu i superoksid

aktivnost dismutaze prema priručniku za analizu (OxiSelect™ ELISA komplet, Cell BioLabs, InC., San Diego, Kalifornija, SAD).

Analiza citokina IL-1, IL-6 i IL-10

Na četiri grupe pod nazivom CON, CaG5, IQG5, CS10, nivo IL- 1 ili IL − 6 ili IL − 10 u serumu pacova tretiranim GAG-om insekata mjeren je korištenjem komercijalnih Elisa kompleta (Quanti-kine, R&D Systems, Inc. , Minneapolis, MN, SAD) prema uputama proizvođača.

Priprema RNK i kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu

Ukupna RNK je izolovana iz jetre pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD), a koncentracija i čistoća RNK mjerene su UV/Vis spektrofotometrom (Beckman Coulter Co., Miami, FL, USA). Komplementarna DNK (cDNA) je sintetizirana iz 1 g ukupne RNK korištenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNA visokog kapaciteta (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, SAD). Umnožavanje polimerazne lančane reakcije (PCR) u realnom vremenu je izvedeno sa Power SYBR Green Master Mixom koristeći 7500 Real-Time PCR sistem (oba od Applied Biosystems), prema uputstvima proizvođača. Za detekciju transkripata ciljnih gena, dizajnirali smo posebno naprijed i obrnuto oligonukleotidne prajmere koristeći Beacon Designer softver (PREMIER Biosoft, Palo Alto, Kalifornija, SAD). Sekvence prajmera su navedene u Šemi 2. Ciljni nivoi mRNA su normalizovani korišćenjem gliceraldehid 3- fosfat dehidrogenaze (GAPDH) kao interne kontrole da bi se kvalifikovala relativna ekspresija ciljne mRNA prema metodi praga ciklusa. Svi uzorci su analizirani u tri primjerka.

Prajmer sekvence za amplifikaciju gena uključenih u mehanizam popravke ćelija i GAPDH interni standard (Shema 2).

Postupak DNK mikromreža

Nakon histopatološke analize, izvršena je hibridizacija mikromrežom na uzorcima jetre [20]. Ukupna RNK je izolovana iz tkiva jetre pomoću Qiagen RNeasy Midi kompleta (Qiagen, Valencia, Kalifornija, SAD). FairPlay™ komplet za označavanje mikromrežom (Stratagene, La Jolla, Kalifornija, SAD) je korišten prema uputama proizvođača. Obilježena DNK je stavljena na mikromrežni čip. Hibridizaciona komora je sastavljena sa mikromrežnim čipom, Rat Genome 230 2.0 Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, SAD), i potopljena u vodeno kupatilo preko noći na 60 stepeni. Čip mikromreža je ispran u puferu za ispiranje I, puferu za ispiranje II, a zatim u puferu za ispiranje III 5 ili 15 minuta. Stakalca je osušena centrifugiranjem na 500 g tokom 15 minuta i skenirana BMS Array Scannerom, primijenjenim preciznim Array Worx eBiochip Readerom (BioRad, Dallas, TX, SAD), koristeći Cy3 i Cy5 kanale [21].

Izolovana analiza srca pacova

Mužjaci Sprague-Dawley pacova, težine 350 ± 50 g, anestezirani su pentobarbitalom (100 mg/kg). U repnu venu je ubrizgan heparin (1000 U/kg), a zatim je intubiran dušnik. Dok su pacovi mehanički ventilirani ventilatorom za glodare (model 7025; Ugo Basile, Comerio-Varese, Italija), njihova srca su perfuzirana in situ oksigeniranim modificiranim Krebs-Henseleit bikarbonatnim puferom retrogradnom aortalnom kanulacijom. Srca su zatim izrezana i premještena u Langendorffov aparat (Hugo Sachs Electronik, March-Hugstetten, Njemačka), gdje su perfuzirana oksigeniranim modificiranim Krebs-Henseleit bikarbonatnim puferom pri konstantnom perfuzijskom pritisku od 75 mmHg. Vodom punjena komora od lateksa uvedena je kroz plućnu venu i povezana sa Isotec transduktorom pritiska (Hugo Sachs Electronik) za merenje pritiska u levoj komori (LVP). Srcima je ostavljeno da se ekvilibriraju 15 minuta, nakon čega je krajnji dijastolni pritisak lijeve komore (EDP) podešen na 10 mmHg, a ovaj volumen balona je održavan tokom eksperimenta. Zatim, početna kontraktilna funkcija, otkucaji srca i koronarni protok (ekstrakorporalna elektromagnetna sonda protoka; narko Bio-systems, Houston,

TX, SAD). Srčana kontraktilna funkcija je izračunata oduzimanjem LVEDP od maksimalnog sistolnog pritiska LV (LVSP), dajući razvijeni pritisak (LVDP). Nakon 1 h ekvilibracije, aortni prstenovi su tretirani nosačem (fiziološki rastvor) ili CaG (10 ug/ml, 100 ug/ml) 10 minuta prije induciranja kontrakcije fenilefrin 1 μM. Zatim je acetilkolinom (0,1–100 μM) izazvana relaksacija zavisna od endotela [22].

Statistička analiza

Srednje vrijednosti i standardna greška svih proučavanih parametara određene su za svaku grupu korištenjem ANOVA testa. Sproveden je Studentov t-test kako bi se utvrdile značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe. A p vrijednost<0.05 was="" considered="">

Rezultati

Promjene tjelesne težine i masnog tkiva

Nije bilo značajnih razlika u srednjoj tjelesnoj težini između tretiranih grupa (slika 1). Tokom 1-mjesečnog perioda primjene, tjelesne težine ostarjelih mužjaka pacova bile su uporedive u kontrolnoj i CaG-, IQG- i CS grupama koje su tretirane. Srednja nedeljna telesna težina prikazana je na slici 2a: CON, 685,16 ± 9,14 g; CaG5, 659,54 ± 14,21 g; IQG5, 646,50 ± 11,56 g, i CS1{51}}, 662,93 ± 7,82 g. Srednja količina trbušne masti značajno je smanjena u IQG5 i CS10 grupama u poređenju sa kontrolom: 21,84 ± 7,46 g za kontrolu; 20,66 ± 8,47 g za CaG5; 16,56 ± 5,97 g za IQG5 (IQG5 vs CON, p < 0,05);="" i="" 16,93="" ±="" 5,17="" g="" za="" cs10="" (cs10="" vs="" con,="" p="">< 0,05)="" (slika="" 2a).="" epididimidna="" mast="" je="" takođe="" značajno="" smanjena="" u="" grupama="" iqg5="" i="" cs10="" u="" poređenju="" sa="" kontrolom:="" 10,38="" ±="" 2,58="" g="" za="" kontrolu;="" 8,19="" ±="" 4.00="" g="" za="" cag5;="" 7.00="" ±="" 1,35="" g="" za="">

(IQG5 vs CON, p < 0.05);="" i="" 8,56="" ±="" 2,53="" g="" za="" cs10="" (cs10="" vs="" con,="" p="">< 0,05)="" (slika="">

Gustina adipocita

Gustoća adipocita [broj ćelija/površina (mm2)] tkiva jetre pacova tretiranih GAG-om u HFD-u, kako je procijenjeno toluidin plavim O bojenjem, smanjena je za CaG5 (33.00 ± 1,73), IQG5 (45 .00 ± 4,36), ili CS10 (26.00 ± 2,52) (CS10 vs CON, p < 0,05) u poređenju sa kontrolnom (51.00 ± 5,29) (slika 2b).

Promene krvnog pritiska i otkucaja srca

Nisu uočene značajne razlike u krvnom pritisku (sistolni krvni pritisak ili broj otkucaja srca) između grupa koje su primale 5 mg/kg CaG-, IQG- ili CS i kontrolne grupe (podaci nisu prikazani).

Hematologija i hemija krvi

Uočene su neke dozno zavisne promjene između tretirane i kontrolne grupe u pogledu hematoloških parametara ispitivanih na kraju eksperimenta. Zabilježeno je povećanje APTT-a (sek.) od 27,5 posto u grupi liječenoj CaG5-: CON, 35,68 ± 5,68; CaG5, 45,49 ± 10.91; IQG5, 29,93 ± 3,57; CS10, 36,83 ± 23,95 (sl. 3). Trombinsko vrijeme (sek.) bilo je sljedeće: CON, 40,18 ± 2,04; CaG5, 42,13 ± 3,23; IQG5, 36,15 ± 6,67; CS10, 45,02 ± 21,89. Došlo je do značajnog (62,6 posto) povećanja faktora I (fibrinogen, mg/dL) u grupi koja je tretirana CaG{47}}: CON, 429,33 ± 142,22; CaG5, 698,29 ± 120,28 (CaG5 vs CON, p < 0,05);="" iqg5,="" 627,14="" ±="" 160,67;="" cs10,="" 790.00="" ±="" 274,22="" (cs10="" vs="" con,="" p="">< 0,05).="" protrombinsko="" vrijeme="" (sek.)="" bilo="" je="" sljedeće:="" con,="" 62.86="" ±="" 47,30;="" cag5,="" 52,71="" ±="" 4,96;="" iqg5,="" 52,14="" ±="" 5,58;="" cs10,="" 55.00="" ±="">

Biohemija seruma

U serumima iz grupa tretiranih IQG i CS (Tabela 1), nivoi fosfolipida (mg/dL) su bili značajno niži nego u kontrolnim serumima nakon 1 mjeseca kod starijih pacova: CON, 271,78 ± 91,74; CaG5, 233,67 ± 71.0; IQG5, 173,2 ± 32.{{20}}2 (IQG5 vs. CON, p < 0.05);="" cs10,="" 259,7="" ±="" 57,27="" (cs10="" naspram="" con,="" p="">< 0,05).="" nivoi="" slobodnih="" masnih="" kiselina="" (μeq/l)="" su="" smanjeni:="" con,="" 686,78="" ±="" 104,67;="" cag5,="" 431,33="" ±="" 66,22="" (cag5="" naspram="" con,="" p="">< 0,05);="" iqg5,="" 405,6="" ±="" 63,39="" (iqg5="" vs.="" con,=""><0.05); cs10,="" 566.9="" ±="" 115.38="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). also,="" serum="" gpt="" (alt)="" levels="" (iu/l)="" in="" the="" cag-="" and="" iqg-="" treated="" groups="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" control="" group="" in="" aged="" rats:="" con,="" 76.33="" ±="" 40.21;="" cag5,="" 36.78="" ±="" 8.0="" iu/l;="" iqg5,="" 43.22="" ±="" 13.86="" (iqg5="" vs.="" con,p="" <="" 0.05);="" cs10,="" 53.44="" ±="" 11.36="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). fur-="" thermore,="" the="" mean="" creatinine="" phosphokinase="" (ck="" u/l)="" level="" in="" the="" cag-treated="" group="" was="" lower="" than="" that="" in="">

kontrolna grupa kod starih pacova: CON, 125,78 ± 91,66; CaG5, 1{{10}}2,89 ± 65,73 (CaG5 naspram CON, p < 0.05);="" iqg5,="" 91,22="" ±="" 24,74;="" cs10,="" 131,2="" ±="" 62,56.="" srednja="" serumska="" glukoza="" (mg/dl)="" značajno="" je="" smanjena="" kod="" starijih="" pacova="" (svaka="" grupa="" naspram="" con,="" p="">< 0,05):="" con,="" 435,11="" ±="" 105,42;="" cag5,="" 304,0="" ±="" 44,44;="" iqg5,="" 275,9="" ±="" 43,18;="" cs10,="" 317,8="" ±="">

Srednji nivo ukupnog holesterola (mg/dl) u grupi tretiranoj IQG bio je niži nego u kontrolnoj grupi kod starijih pacova, a ta razlika je takođe bila značajna: CON, 212,67 ± 92,82; CaG5, 181,44 ± 68,4; IQG5, 124,1 ± 23,6 (IQG5 vs. CON, p < 0.05);="" cs10,="" 198,9="" ±="">

Pored toga, nivoi triglicerida (mg/dL) su bili sljedeći: CON, 207,89 ± 101,95; CaG5, 136,22 ± 61,6; IQG5, 103,3 ± 35,59 (IQG5 naspram CON, p < 0.05);="" cs10,="" 183,4="" ±="" 104,74.="" nivoi="" ldl="" holesterola="" (mg/dl)="" su="" smanjeni:="" con,="" 74,67="" ±="" 44,91;="" cag5,="" 69,0="" ±="" 31,3;="" iqg5,="" 41,44="" ±="" 10,14="" (iqg5="" naspram="" con,="" p="">< 0,05);="" cs10,="" 65,22="" ±="" 18,52.="" značajno="" smanjenje="" nivoa="" mokraćne="" kiseline="" (mg/dl)="" uočeno="" je="" u="" svim="" grupama="" tretiranim="" gag-om="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnom="" (svaka="" grupa="" naspram="" con,="" p="">< 0,05):="" con,="" 10,9="" ±="" 2,26;="" cag5,="" 8,12="" ±="" 1,48;="" iqg5,="" 6,49="" ±="" 0,89;="" cs10,="" 8,14="" ±="" 2,17,="" tabela="">

Smanjenje oksidativnog oštećenja

Malondialdehid (MDA, nmol/ml) je analiziran nakon 1 mjeseca svakog tretmana GAG-om [CON, 252,9 ± 13,1; CaG5, 175,1 ± 5,8 (smanjenje za 30,32 posto). Svaki tretman GAG-om i hondroitin sulfatom smanjivao je peroksidaciju lipida u hepatocitima (slika 4a). Koncentracija karbonila proteina u krvi smanjena je u omjeru od 68,52 posto, 36,89 posto i 53,70 posto u GaG5, IQG5 i CS10, respektivno (slika 4b). Ali, svaki GAG nije imao statističke razlike u poređenju sa kontrolom u sadržaju karbonila hepatocita (podaci nisu prikazani).

Kvantifikacija oksidativnih enzima (katalaza, GPx, GST, SOD).

Aktivnost katalaze (mg proteina/min) u hepatocitima nakon 1 mjeseca GAG tretmana bila je sljedeća: CON, 17,72 ± 2,81; CaG5, 19,87 ± 3,88; IQG5, 17,22 ± 4,55; CS10, 19,23 ± 3,55. Povećana je aktivnost katalaze u svim grupama hepatocita tretiranih CaG. Super oksid dismutaza (SOD) je enzim za uklanjanje slobodnih radikala (super oksida). Aktivnost SOD (nmol/min/ml) povećana je u tretiranim grupama u poređenju sa kontrolom: kontrola, 381,44 ± 85,32; CaG5, 400,56 ± 60,62; IQG5, 386,72 ± 69,22; CS10, 513,05 ± 60,07. Aktivnost glutation peroksidaze (jedinica/mg proteina) u grupi hepatocita tretiranoj CaG je značajno povećana tretmanom (CaG5 naspram CON, p < 0,05),="" a="" aktivnost="" glutation="" s-transferaze="" (nmol/min/ml)="" u="" cag="" grupa="" je="" takođe="" značajno="" povećana="" u="" odnosu="" na="" kontrolnu="" grupu="" (cag5="" vs.="" con,="" p="">< 0,05)="" (tabela="">

Proizvodnja citokina IL-1 i IL-10

Porast nivoa IL-10 uočen je u grupi koja je liječena CaG. Nivoi IL-1 (ρg/ml) u serumu su smanjeni za 1

Tabela 1. Serološki nalazi ostarjelih pacova liječenih CaG ili IQG tokom 1 mjeseca

mjesec CaG ili IQG tretmana, demonstrirajući protuupalno djelovanje jedinjenja: kontrola, 251,3 ± 70.7; CaG5, 102,9 ± 9,5; IQG5, 110,4 ± 5,2; CS10, 110,4 ± 10,1 (svaka grupa naspram CON, p < 0,05).="" il-10="" aktivnost="" (ρg/ml)="" nakon="" 1="" mjeseca="" cag="" tretmana="" kod="" pacova="" je="" povećana:="" con,="" 34,9="" ±="" 11,5;="" cag5,="" 67,4="" ±="" 13,3="" (cag5="" vs.="" con,=""><0.05); iqg5,="" 55.5="" ±="" 24.7;="" cs10,="" 28.0="" ±="" 3.8="" (fig.="" 5).="" the="" il-10="" levels="" in="" the="" cs10="" group,="" was="" statistically="" different="" from="" that="" in="" the="" con="" group="" (cs10="" vs.="" con,p=""><>

Ekspresija gena kvantitativnom PCR analizom u realnom vremenu

The data represented that PCR cycle required number (Ct value) when the concentration of PCR amplicon are equilibrated by sample amplicon. Median CT values of 5 sample's represented, but there was no difference from the control group (Ct vale >2.0) na korištenoj sekvenci prajmera (podaci nisu prikazani).

DNK mikromreža

Analiza mikromreža korištenjem mišjeg 28 K cDNA klonskog niza je izvršena kako bi se identificirali profili ekspresije gena u jetri SD štakora tretiranih s CaG, IQG i CS tretiranim 15- mjesec dana starim SD pacovima, te da bi se pružile informacije o potencijalnimprotiv starenjamarkeri.

U poređenju sa kontrolnom grupom, CaG5 grupa je pokazala 2- do 4- puta povećanje u 118 gena, 4- 8- puta povećanje kod 11 gena i više od 8- puta povećanje u 2 gena. Nivoi ekspresije preostalih ~30,000 gena su ostali isti. Šezdeset gena je smanjeno sa 2- na 4-put, a 4 su pokazala 4- do 8- puta smanjenje.

U IQG5 grupi u poređenju sa kontrolnom grupom, 162 gena su se povećala za 2- do 4- puta, 10 gena porasla za 4- do 8- puta, a 3 gena povećana za više od 8- puta. S druge strane, 66 je smanjeno za 2- na 4- puta, a 7 je smanjeno za 4- na 8- puta.

Tabela 2 Antioksidativna aktivnost enzima glikozaminoglikana balege u jetri starih štakora

U CS10 grupi u poređenju sa kontrolnom grupom 63 gena su povećana od 2- do 4- puta, 2 gena su povećana od 4- do 8- puta, a 2 gena su povećana za više od 8- puta. Trideset osam gena je smanjeno 2- do 4-puta, 4 su smanjeno 4- do 8- puta, a 4 su smanjena za više od 8-puta.

U poređenju sa kontrolnom grupom, gen za lipocalin2 (Lcn2) je povećan za oko 10-putu u CaG5- tretiranom tkivu jetre, 46- puta u IQ5 grupi i {{6} }presavijte u CS10 grupu. U tkivima jetre miševa tretiranih CaG5-, lizil oksidaza (Lox) je smanjena u omjeru od 0,13, odnosno smanjena je ekspresija gena. Grupa štakora tretirana CaG5, u poređenju sa kontrolnom, pokazala je da je 131 gen uključujući lipokalin 2, protein koji vezuje oligosaharide (Lbp) i inhibitor serin peptidaze, Kaszal tip 3 (Spink3) pojačan (Tabela 3) i 64 gena uključujući lizil oksidazu (Lox), serin dehidrataza (sds) i retinol zasićeni (Retreat) su bili smanjeni (tabela 4). Grupa koja je tretirana CaG5-, u poređenju sa kontrolnom grupom, pokazala je povećanu regulaciju 131 gena, uključujući lipokalin 2, protein koji vezuje oligosaharide (Lbp) i inhibitor serin peptidaze Kaszal tip 3 (Spink3) (tabela 3 ) i smanjenje regulacije 64 gena, uključujući lizil oksidazu (Lox), serin dehidratazu (sds) i retinol zasićenje (Retsat) (tabela 4). Ovi podaci upućuju na lipokalin 2 i adipokine, kao povećane gene, i lizil oksidazu (vezanu za heparanazu), kao niskoregulirani gen, kao potencijalne terapijske markere koji djeluju protiv starenja i gojaznosti.

Karakterizacija CaG

Sastav amino, kiselih i neutralnih monosaharida GaG određen je GC-MS (Tablica 5). Primarni amino monosaharidi CaG-a su sljedećim redoslijedom: D-glukozaminska kiselina > N-acetil-galaktozamin > N-acetil-D-gaktozaminitol > galaktozamin HCl > galaktozaminska kiselina > galaktozamin > glukuronska kiselina. Takođe, neutralni monosaharidi koji se nalaze u CaG su uglavnom - glukoza i manitol, dok su manji monosaharidi arabinoza i ramnoza.

Pokazatelji kardioprotekcije

U ovom eksperimentu okarakterizirali smo direktan učinak CaG na arterije otpora koristeći posude inkubirane in vitro sa kontrakcijom izazvanom fenilefrinom i relaksacijom izazvanom acetilkolinom. CaG je ocijenjen kao kardioprotektivni agens. Kriva koncentracija-odgovor na CaG pomaknuta je naniže u poređenju sa onom nakon kontrolnog (samo PBS) tretmana, pokazujući da se stimulacija srca dogodila na način ovisan o koncentraciji (slika 6).

Diskusija

Starenje je proces progresivnog opadanja fizioloških kapaciteta organizma koji se manifestuje nagomilanim promjenama i destabilizacijom na nivou cijelog sistema [13]. Smatra se da glikozaminoglikan umanjuje štetne efekte starenja sprečavajući uništavanje hrskavice, kostiju, diskova, kože [23], vaskularnog sistema [8], itd. trenutno se smatra jednim od utvrđenih biokompatibilnih i kompatibilnih s krvlju

biomaterijali koji nude izvanredan odnos strukture i svojstava, kao što je imobilizacija heparinom na hitozanom modificiranim poliuretanskim graftovima s antiadhezivnim i antimikrobnim svojstvima [24]. Danas je pojava kontrole temperature omogućila dizajn velikih sistema za uzgoj insekata. Dakle, glikozaminoglikan

može se dobiti iz korteksa insekata kao ostatak ekstrakta alkohola. Takvi sirovi lijekovi iz balege i matica B. ignitus proučavani su u nastojanju da se identifikuju njihove aktivne komponente ili da se ekstrakti učine sigurnijim za ljudsku upotrebu. Balega buba C. molossus je pročišćena kako bi se dobili N-acetildopamin dimeri, molossusamid AC (1–3), pokazujući

COX-1 i COX{1}} inhibitorna aktivnost [25]; hitozan [26]; melanin [27]; i serinske proteaze [9, 28]. Pokazalo se da ekstrakt bumbara (Bombus ignitus) sadrži serinsku proteazu pčelinjeg otrova [29], peroksiredoksine [30] i protein za prepoznavanje peptidoglikana (PGRP-S) [31].

Strategije za prevenciju ili odlaganje starenja uključivale su uzimanje antioksidansa za popravku oksidativnog oštećenja ćelija na DNK, proteina i lipida, kao i regeneraciju tkiva posredovanu matičnim ćelijama i gensku terapiju [32]. Kao marker oksidativnog oštećenja lipida u stanjima oksidativnog stresa lipida hepatocita, malondialdehid je smanjen CaG tretmanom. Također, sadržaj karbonila u krvi, posebno neutrofila, smanjen je CAG tretmanom i pokazao je popravak ćelijskog oksidativnog oštećenja proteina.

Glikozaminoglikani iz matica C. molossus i B. ignitus sastoje se uglavnom od D-glukozaminske kiseline kao kiselog monosaharida i N-acetil-galaktozaminitola kao aminokiseline

monosaharida, zajedno sa -glukozom i D-manitolom kao neutralnim monosaharidima. Dakle, spoj može pristupiti receptorima ćelijske membrane i može spriječiti uzroke bolesti povezanih sa starenjem mijenjajući energetski metabolizam. Glikozaminoglikani mogu popraviti vezivno tkivo [23], erodiranu hrskavicu, diskove, kosti i glikoproteine ​​na molekularnom nivou, pri čemu GAG formira vezu između proteina [9]. U ovom eksperimentu korišćeni pacovi su bili stari i težili su oko 680 g, tako da nije bilo lako postići smanjenje telesne težine, ali smo primetili smanjenu masu masnog tkiva i broj adipocita. Kao i kod većine glikozaminoglikana, CaG i IQG doveli su do smanjenja nivoa u serumu parametara povezanih sa upalom: slobodne masne kiseline, AST (SGPT), kreatinin kinaze (povezane funkcije srca), glukoze, mokraćne kiseline i hiperglikemije. nivoi: holesterola, ukupnog, triglicerida, LDL holesterola, itd. Nivoi slobodnih masnih kiselina (povezana masna jetra) u tretiranim grupama su statistički značajno smanjeni, 36,7 procenata u CaG grupi i 40,94 procenata u IQG grupi. Takođe, nivo sGPT (povezana funkcija jetre) je značajno smanjen, 51,58 posto u CaG grupi i 43,38 posto u IQG grupi.

Podaci generirani analizom DNK mikromreža podržavajuprotiv starenjaefekat IQG, sa značajnim promjenama u profilima ekspresije gena kod 14-mjesečnih SD pacova uočenih nakon 1-mjesečnog perioda tretmana. Pacovi tretirani CaG5-, u poređenju sa kontrolnom grupom, imali su povećanje u 131 genu, uključujući lipokalin 2 [33], protein koji vezuje liposaharide (Lbp) [34] i inhibitor serin peptidaze, Kazal tip 3 (Spink3) [35] i smanjuje se u 64 gena, uključujući lizil oksidazu (Lox) [36], serin dehidratazu (sds) [37] i retinol saturazu (Retsat) [38]. Podaci ukazuju na lipokalin 2 i adipokine, koji su bili pojačano regulirani, i lizil oksidazu (u vezi s heparanazom), koja je bila smanjena, kao potencijalne terapijske markere zaprotiv starenjaefekti kod gojaznih životinja.

Ova studija je uočila značajne promjene u profilima ekspresije gena kod ostarjelih pacova nakon tretmana sa CaG ili IQG tokom 1 mjeseca. Ekspresija gena lipokalina-2, koji je adipokin uključen u insulinsku rezistenciju [39] i sekretornog proteina sa prosperitetom vezivanja lipida, povećana je za oko 10 puta. Ovo je u skladu sa studijom na mikromrežu koja je objavila da gutanje soje izaziva povećanje endogenog amiloid-šaperona, prostaglandin D2 sintaze lipokalinskog tipa (Ptgds), što dovodi do supresije amiloida i sprečava kognitivne disfunkcije [4{{ 22}}]. Lipopolisaharidni (LPS) vezujući protein (LBP), surogat marker mikrobne translokacije, povezan je sa smanjenom fizičkom funkcijom i povećanom upalom [41]. Normalan proces starenja mijenja sistem koagulacije krvi kod ljudi; Prirodni antikoagulansi, uključujući antitrombin III, heparin kofaktor II, protein C, protein S i inhibitor puteva tkivnog faktora, mogu modulirati reakcije sistema koagulacije krvi [42]. U ovoj studiji, došlo je do značajnog povećanja faktora I (fibrinogena) u CaG (162,6 posto), IQG (146,0 posto) i CS10 (184,0 posto)—liječenim grupama u poređenju sa kontrolnom grupom koja je tretirana PBS-om. Također, nivo LBP-a (LPS binding protein) je povećan u našim podacima mikromreža DNK, što sugerira da se heparin (GAG) vezuje za LBP, olakšava prijenos LPS-a na CD14 i poboljšava LPS posredovanu aktivaciju monocita periferne krvi, što rezultira antikoagulantna aktivnost [43]. Inhibitor tripsina, inhibitor serinske proteaze Kazal-tip 3 (Spink3), je reguliran u ovom eksperimentu, što ukazuje na ulogu parakrine modulacije; također je uključen u implantaciju embrija [44]. Kako je Spink3 važan inhibitor serinske proteaze, njegova regulacija može odražavati važan endogeni citoprotektivni mehanizam koji bi spriječio daljnje ozljede [45]. Smanjenje regulacije lizil oksidaze može ukazivati ​​na to da heparin (GAG) koji inhibira čvrsto vezivanje lizil oksidaze za prethodno formirane fibrile nije bio teško pogođen [46]. Smanjenje regulacije zasićenja retinola uočeno u ovom eksperimentu je primetno, jer retinol saturaza potiče adipogenezu i smanjena je kod gojaznosti [47]. Prema hipotezi, gustina masnog tkiva, novi biomarker koji predviđa rizik od smrtnosti kod starijih osoba, a ne čini se da je povezan s upalom [48], nadalje, CaG je značajno smanjio gustinu masnog tkiva obećavajući moćnuprotiv starenjaagent.

Zaključci

Glikozaminoglikan balege je snizio nivo holesterola i triglicerida u serumu, izazvao smanjenje mase masnog tkiva i normalizaciju nivoa slobodne masne kiseline, GPT, glukoze i mokraćne kiseline u serumu, kao i produženje vremena koagulacije koje bi sprečilo agregaciju krvi i lipida akumulacija u vaskularnim endotelnim barijerama koje doprinose homeostazi u cirkulatornom sistemu. IL{{0}} (pg/ml) u serumu je smanjen za 1 mjesec CaG ili IQG tretmana, što pokazuje protuupalno djelovanje. Pored toga, zaštitni gen za jetru lipokalin je bio visoko (10-} puta) preregulisan, a lizil oksidaza je smanjena (01- puta) kod pacova tretiranih CaG. CaG dobijen od insekata može biti a

sigurnija zamjena za heparin i druge GAG-ove iz izvora sisavaca, jer izvori insekata smanjuju mogućnost prijenosa infektivnih virusa sa životinja kao što su svinje. Ovi rezultati sugeriraju da CaG i BIQ ne mogu biti samo prirodniprotiv starenjaagensi, ali i funkcionalna hrana, slična hitozanu i budućim biomaterijalima koji će igrati vitalnu ulogu u našem svakodnevnom životu.

Skraćenice

ALP: alkalna fosfataza; ALT(GPT): Glutamat piruvat transaminaza; aPTT: Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme; AST(GOT): Glutamat oksaloacetat transaminaza; BUN: Azot ureje u krvi; CaG 5: balega buba (Catharsius molossus) glikozaminoglikan 5 mg/kg; CK: kreatinin fosfokinaza; CON: Kontrolna grupa; CRP: C-reaktivni protein;

CS10: hondroitin sulfat (10 mg/kg); GAG: Glikozaminoglikan; GGT: - glutamil transferaza; H. Chol: Visok holesterol; IQG5: Queen of Bombus ignitus (vrsta bumbara) glikozaminoglikan 5 mg/kg; l.Chol: Nizak holesterol; LDH: Laktat dehidrogenaza; PT: protrombinsko vrijeme; T. Chol: Ukupni holesterol; TG: Trigliceridi

Priznanja

Autori zahvaljuju Nacionalnoj akademiji poljoprivrednih nauka za finansijsku (RDA, PJ011853) i tehničku podršku.

Finansiranje

Ovaj rad je podržan od strane Projekta osnovnih istraživanja Uprave za ruralni razvoj, PJ011853.

Dostupnost podataka i materijala

Svi podaci dostupni su na portalima časopisa u dostavljenom rukopisu. Uz ovaj podnesak nisu potrebni nikakvi drugi prateći fajlovi/podaci.

Konkurentni interesi

Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljene interese.

Doprinosi autora

MY je izvršio većinu eksperimenata, pripremio rukopis: osmislio studiju, učestvovao u njenom dizajnu i koordinaciji, prikupio i analizirao podatke i pripremio rukopis. BJ je sproveo studije na životinjama, učestvovao u testu enzima koji se odnosi na oksidaciju. HJ je izvršio analize citokina. JS je učestvovao u usklađivanju genetskih sekvenci. KK je učestvovao u DNK mikromrežu. YS je proveo in vivo studiju odziva arterija otpora. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

Saglasnost za objavljivanje

Ovaj rukopis ne sadrži podatke bilo koje osobe u bilo kom obliku.

Etičko odobrenje

Studije koje su uključivale životinje odobrio je Etički komitet za laboratorijske životinje Nacionalne akademije poljoprivrednih nauka, RDA, Južna Koreja (NAAS1503).

Studije o rukopisima nisu sadržavale ljudske učesnike, ljudske podatke ili ljudska tkiva.

Napomena izdavača

Springer Nature ostaje neutralan u pogledu jurisdikcijskih zahtjeva u objavljenim mapama i institucionalnim vezama.

Detalji o autoru

1Odsek za poljoprivrednu biologiju, Nacionalna akademija poljoprivrednih nauka, Uprava za ruralni razvoj (RDA), Wanju-Gun 55365, Južna Koreja. 2 Farmaceutski koledž, Univerzitet Ajou, Suwon 442-749, Južna Koreja. 3Pharmacogenechips Inc., Chuncheon 200-160, Južna Koreja.