13-sedmična studija subhronične toksičnosti 2-(l-mentoksi)etanola kod F344 štakora

Sažetak: 2-(l-Mentoksi)etanol se često koristio kao aroma; međutim, podaci o toksičnosti 2-(l-mentoksi)etanola ostaju ograničeni. Izveli smo 13-sedmicusubhronična toksičnoststudija {{0}}(l-mentoksi)etanola kod mužjaka i ženki štakora F344, sa dozama od 0, 15, 60 ili 250 mg/kg tjelesne težine (BW)/dan oralno davanim putem sonde kukuruzno ulje kao vozilo. Ni u jednoj grupi nisu uočene značajne toksikološke promjene u općem stanju, tjelesnoj težini ili unosu hrane. Hematološka procena je pokazalasmanjen hemoglobin,hematokrit, srednji korpuskularni volumen i srednji korpuskularni hemoglobin i povećani broj trombocita u muškoj grupi od 250 mg/kg.Biohemija serumaotkrivenopovišen ukupni holesterolu grupi mužjaka i ženki pacova od 250 mg/kg, smanjen triglicerid u grupi ženki od 250 mg/kg i povećan ukupni protein u grupi mužjaka od 250 mg/kg, što ukazuje na efekte nametabolizam lipidaisinteza proteina. Za težinu organa, apsolutna i relativna težina jetre i nadbubrežne žlijezde povećane su u grupi od 250 mg/kg oba spola i muškoj grupi od 250 mg/kg, respektivno. Histopatološka analiza je pokazalahronična nefropatijau grupama muškaraca od 15 mg/kg ili više, sa povećanom apsolutnom i relativnom težinom bubrega, kao i povišenim serumskim kreatininom, u grupama muškaraca od 60 i 250 mg/kg. Međutim, u proksimalnim tubulima su identificirane eozinofilne granule koje sadrže 2u-globulin, što ukazuje na 2u-globulinsku nefropatiju specifičnu za mužjake pacova i bez toksikološkog značaja. Ovi rezultati su pokazali da je nivo 2-(l-metoksi)etanola bez uočenih štetnih efekata bio 60 mg/kg TM/dan za oba pola. (DOI: 10.1293/tox.2020-0091; J Toxicol Pathol 2021; 34: 309–317)

Ključne riječi: 2-(l-mentoksi)etanol, 2-l-mentoksietanol, aditiv za hranu, aroma, Fischer pacov, mentol

Cistanche dodatak dodatak za podršku bubrežnoj funkciji PhGs75% Ech 30% Act 12%

Uvod

{{0}}(l-Mentoksi)etanol (CAS br. 38618-23-4) je bistra i bezbojna tečnost sa karakterističnim mirisom i široko se koristi kao aroma. Zajednički FAO/WHO stručni komitet za aditive u hrani (JECFA) ocijenio je 2-(l-mentoksi)etanol kao aromu, kategoriziranu kao supstance strukturno povezane s mentolom1. Na osnovu strukturne klase aroma, 2-(l-mentoksi)etanol je dodijeljen klasi I. U Sjedinjenim Državama i Evropi, nivoi unosa 2-(l-mentoksi)etanola od strane ljudi procijenjene su na 12 ug/osobi/dan i 0,01 ug/osobi/dan, respektivno, oba ispod praga klase I od 1800 ug/osobi/dan. Na osnovu ovih procjena, smatra se da 2-(l-mentoksi)etanol možda neće predstavljati sigurnosnu zabrinutost tokom rutinske upotrebe kao arome.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(l-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg tjelesne težine [TW])1. Uprkos upotrebi 2-(l-men thoxy)etanola kao arome, dostupni su ograničeni podaci o toksičnosti ponovljenih doza ovog jedinjenja. Naša laboratorija je istražila toksičnost nekoliko aditiva za hranu, uključujući reprezentativne arome iz svake kategorije, na modelima glodavaca2–7. Da bismo razjasnili toksikološki profil i utvrdili nivo bez uočenih štetnih efekata (NOAEL), proveli smo 13-sedmično ispitivanje subkronične toksičnosti 2-(l-mentoksi)etanola, koji je oralno davan F344 štakori putem sonde.

Materijali i metode

Ispitna hemikalija

2-(l-Mentoksi)etanol (Lot br. 5I0002, čistoća 99,9%) proizvođača Takasago Int. Corp. (Tokio, Japan) obezbedilo je Odeljenje za standarde i evaluaciju, Odeljenje za bezbednost hrane, Ministarstvo zdravlja, rada i blagostanja, Japan, uz podršku Japanskog udruženja za ukuse i mirisne materijale (Tokio, Japan). Iako je ispitivana supstanca isporučena kao mješavina optičkih izomera (CAS br. 38618-23-4), proizvođač ju je potvrdio kao l-enantiomer (CAS br. 75443-64-0). Oralna gavaža sa kukuruznim uljem (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) kao nosač je odabrana kao put primjene zbog nerastvorljivosti u vodi i hlapljivosti 2-(l-mentoksi) etanola. Otopine 2-(l-mentoksi)etanola pripremane su svakodnevno, neposredno prije primjene. Nakon skladištenja od 2 h na sobnoj temperaturi, preostali omjeri 2-(l-mentoksi) etanola u 4, 40 i 400 mg/mL otopine potvrđeni su kao 96,8%, 99,8% i 96,5%, respektivno, gasnom hromatografijom (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokio, Japan).

Eksperimentalne životinje

Ukupno, 40 mužjaka i 40 ženki pacova bez specifičnih patogena (F344/DuCrlCrlj, 5-nedjelja) kupljeno je od Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan) i korišteno nakon aklimatizacije jednu sedmicu. Tokom istraživanja, životinje su bile smještene u polikarbonatnim kavezima sa mekom posteljinom od strugotine, držane u prostoriji sa sistemom barijere za kontrolu ciklusa svjetlo/mrak (12 h), ventilaciju (brzina izmjene zraka od 18 puta/h), temperaturu ( 24 ± 1 stepen), i relativna vlažnost (55 ± 5%). Kavezi i posteljina su se mijenjali dva puta sedmično. Svaka životinja je imala besplatan pristup vodi iz slavine i osnovnoj ishrani (CRF-1; orijentalni kvasac, Tokio, Japan). Na početku eksperimenta, životinje su nasumično raspoređene u četiri grupe od po 10 mužjaka i ženki pacova, na osnovu tjelesne težine mjerene neposredno prije početka tretmana ispitivanom kemikalijom.

Dizajn studija

U preliminarnoj {{0}}dnevnoj studiji koja procjenjuje 2-(l-mentoksi) etanol primijenjen u dozama od 0, 200, 400 i 800 mg/kg TM/dan, apsolutna a relativna težina jetre je značajno povećana u svim liječenim grupama oba spola (podaci nisu prikazani). Na osnovu ovih rezultata, odabrali smo doze 2-(l-mentoksi) etanola od 0, 15, 60 i 250 mg/kg t. sedmična studija toksičnosti

Svakodnevno su procjenjivani opći uslovi i mortalitet. Tjelesne težine, kao i količine unesene i preostale ishrane mjerene su jednom sedmično tokom eksperimentalnog perioda. Svi pacovi su gladni preko noći nakon završetka tretmana, a uzorci krvi za hematologiju i biohemiju seruma su uzeti iz abdominalne aorte pod dubokom inhalacijskom anestezijom korištenjem izoflurana. Dizajn studije bio je u skladu sa Smjernicama za označavanje aditiva za hranu i reviziju standarda za upotrebu aditiva za hranu Japana (1996) i odobren od strane Komiteta za negu i korištenje životinja Nacionalnog instituta za zdravstvene nauke, Japan.

Hematologija i biohemija seruma

Pomoću automatskih hematoloških analizatora ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA) analizirani su sljedeći hematološki parametri: broj bijelih krvnih zrnaca (WBC), broj crvenih krvnih zrnaca (RBC), koncentracija hemoglobina (HGB), hematokrit (HCT), srednji korpuskularni volumen (MCV), srednji korpuskularni hemoglobin (MCH), srednja koncentracija korpuskularnog hemoglobina (MCHC), broj trombocita (PLT) i diferencijalne ćelije leukocita, uključujući neutrofile (Neut), limfocite (limf), monocite (mono), eozinofile (Eosino) i bazofili (Baso). Biohemijska analiza seruma urađena je od strane Oriental Yeast za sljedeće parametre: ukupni protein (TP), albumin (Alb), omjer albumin/globulin (A/G), ukupni bilirubin (Bil), glukoza, ukupni kolesterol (T-Chol), triglicerid (TG), dušik uree (BUN), kreatinin (Cre), kalcij (Ca), neorganski fosfor (IP), natrijum (Na), kalij (K), hlor (Cl), aspartat aminotransferaza (AST), alanin aminotransferaza (ALT), alkalna fosfataza (ALP) i -glutamil transpeptidaza (-GTP).

Težina organa i histopatološka procjena

Urađena je potpuna obdukcija za sve životinje, a izvagani su mozak, timus, pluća, srce, slezena, jetra, nadbubrežne žlijezde, bubrezi, testisi i jajnici. Ovi organi, kao i tkiva iz kičmene moždine, trigeminalnog živca, hipofize, nosne šupljine, pljuvačnih žlijezda, jezika, jednjaka, dušnika, aorte, štitne žlijezde, paratireoidne žlijezde, pankreasa, želuca, tankog i debelog crijeva i submandibularnog crijeva limfni čvorovi, vagina, maternica, mokraćna bešika, prostata, sjemeni mjehurići, epididimis, femur i grudna kost sa koštanom srži, pršljenovi, skeletnim mišićima, bešičnim živcem, kožom i mliječnom žlijezdom, fiksirani su u 10% formalinskom neutralnom puferu zatim su pripremljeni parafinski rezovi i obojeni hematoksilinom i eozinom za histopatološki pregled. Testisi i oči sa Harderovim žlijezdama su fiksirane u Bouin-ovom fiksatoru i Davidsonovom rastvoru, respektivno. Koštano tkivo, uključujući nosnu šupljinu, pršljenove, prsnu kost i femur, dekalcificirano je mješavinom 10% mravlje kiseline i 10% puferovanog formalina do 2 sedmice. Histopatološka procjena je izvršena za sva tkiva dobijena od životinja u kontrolnoj grupi i grupa je primila najveću dozu osim ako nisu uočene bilo kakve lezije povezane s liječenjem.

Imunohistohemija za 2u-globulin

Kod mužjaka pacova, akumulacija 2u-globulina u bubregu ispitana je imunohistohemijskom analizom parafinskih rezova. Za pronalaženje antigena, sekcije dobijene od 5 pacova u svakoj grupi su inkubirane sa proteinazom K (DAKO, Glostrup, Danska) 1 min na sobnoj temperaturi. Sve sekcije su uronjene u 3% rastvor H2O2/metanola 10 minuta na sobnoj temperaturi radi inaktivacije aktivnosti endogene peroksidaze. Nakon blokiranja nespecifičnih reakcija sa 10% normalnog zečjeg seruma, sekcije su inkubirane sa primarnim antitelom za 2u-globulin (razblaženo 1:400; anti-pacovsko 2u-globulin antitelo; R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD) preko noći na 4 stepena 8. Vizualizacija vezivanja antitela izvedena je korišćenjem Vecta Stain Elite ABC kompleta (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SAD) i 3,3′-diaminobenzidina. Svi rezovi su obojeni hematoksilinom.

Statistička analiza

Varijacije u vrijednostima podataka za tjelesnu težinu tokom eksperimentalnog perioda, kao i za hematologiju, biohemiju seruma i težinu organa, procijenjene su na homogenost korištenjem Bartlettovog testa. Jednosmjerna analiza varijanse i Kruskal-Wallisov test, respektivno, korišteni su za homogene i heterogene podatke. U određivanju statistički značajnih razlika, Dunnettov test višestrukog poređenja korišćen je za poređenje kontrolnih i tretiranih grupa. Poređenja histopatoloških incidencija i stupnjeva analizirana su korištenjem Fisherovog testa egzaktne vjerovatnoće i Mann-Whitneyjevog U testa, respektivno. P vrijednosti od<0.05 were considered statistically significant.