Urinarne metabolomske promjene koje prate remisiju albuminurije nakon operacije želučane premosnice za dijabetes tipa 2 Ⅱ

3. Diskusija

U ovoj podstudiji MOMS RCT [20], ispitivali smo metabolomske promjene 1H-NMR u urinu nakon liječenja samo lijekovima ili RYGB plus lijekovima upacijenata sa gojaznošću, dijabetes tipa 2, imikroalbuminurija(Slika 8).

Slika 8. Pregled metabolomskih promjena u urinu koje se javljaju 6 mjeseci nakon CSM-a. Metaboliti koji su se povećali od početne vrijednosti do 6. mjeseca označeni su crvenom bojom, dok su oni koji su se smanjili označeni plavom bojom. Kreirano sa BioRender.com. 1H-NMR, spektroskopija protonske nuklearne magnetne rezonance; ACR,omjer albumina i kreatinina; BMI, indeks tjelesne mase; HbA1c, glikirani hemoglobin.

U poređenju sa MTA, tretman sa CSM je rezultirao karakterističnim metabolomskim profilom urina. Metabolomske promjene u urinu izazvane CSM uključivale su povećano izlučivanje kometabolita domaćin-mikrob N-fenilacetilglicina, trimetilamin N-oksida i 4-aminobutirata (GABA) [28-33], kao i povećano izlučivanje aminokiseline arginin i glutamin. CSM je također smanjio koncentraciju aromatičnih aminokiselina u urinu (fenilalanin i tirozin), kao i BCAA (valin i leucin) i srodnih kataboličkih intermedijera (3-hidroksiizobutirat, 3-hidroksiizovalerat i 3-metil{ {9}}oksovalerat). Dok smanjenje aromatičnih aminokiselina i BCAA može biti povezano s gubitkom težine i poboljšanom osjetljivošću na inzulin nakon CSM-a [34-40], smanjene koncentracije aromatičnih aminokiselina u urinu također mogu biti direktno povezane s njihovom smanjenom apsorpcijom u crijevima nakon RYGB-a, što rezultira povećanom metabolizam crijevnih bakterija [30].

Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kupite za više detalja o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA FUNKCIJU BUBREGA

Najistaknutija metabolomska promjena uočena u ovoj studiji bila je povećanje izlučivanja urinom kometabolita domaćin-mikrob 6 mjeseci nakon CSM-a, uključujući N-fenilacetilglicin, trimetilamin N-oksid, 4-aminobutirat (GABA) i arginin. Važno je da su promjene u urinarnim domaćin-mikrobnim kometabolitima nakon CSM-a bile umjerene do snažno povezane s poboljšanjima krvnog tlaka, triglicerida i uACR-a do 2 godine nakon početka liječenja. Ranije je prijavljeno povećano izlučivanje urinom kometabolita domaćin-mikrob nakon RYGB, a pripisano je kompozicionim i funkcionalnim promjenama u crijevnoj mikrobioti, što može objasniti metabolička poboljšanja neovisna o gubitku težine nakon procedure [28–33,41,42 ]. Seyfried et al. pokazao povećano izlučivanje urinom ko-metabolita domaćin-mikrobni fenilacetilglicin, indoksil sulfat i 4-krezil glukuronid 2 i 4 sedmice nakon RYGB u gojaznom Zucker modelu štakora [32]. Ove promjene nisu uočene samo nakon ograničenja kalorija u životinjskom modelu. Također smo ranije primijetili povećano izlučivanje N-fenilacetilglicina i 3-indoksil sulfata u urinu 4 sedmice nakon i RYGB samog i RYGB u kombinaciji sa fenofibratom, metforminom, ramiprilom i rosuvastatinom u Zucker Diabetic Sprague Dawley modelu štakora [33] . Povećano izlučivanje N-fenilacetilglicina u urinu ukazuje na smanjenu apsorpciju aromatične aminokiseline fenilalanin i posljedično pojačan metabolizam crijevnih bakterija nakon RYGB [32]. U skladu s tim, izlučivanje fenilalanina u urinu se smanjilo od početne vrijednosti do 6. mjeseca u CSM kraku.

Smanjena intestinalna pokretljivost nakon RYGB potiče truljenje proteina, pri čemu nepotpuno probavljeni proteini dospiju do debelog crijeva zbog hirurške premosnice prednjeg crijeva [29]. Kao takvo, povećano fekalno izlučivanje GABA je prijavljeno nakon RYGB na modelima glodara i pripisuje se truljenju proteina i mikrobnoj obradi putrescina dobivenog iz ornitina [29,32,43]. Povećana GABA u fecesu je uključena u dobro karakterizirano povećanje peptida sličnog glukagonu-1 (GLP-1) uočeno nakon RYGB, jer GABA može stimulirati oslobađanje GLP-1 iz enterocita putem jonotropne GABAA i GABAC receptori [44,45]. GLP-1-indukovana natriureza je implicirana u antihipertenzivnim i renoprotektivnim efektima RYGB [16,46]. GABA može ne samo da stimuliše lučenje GLP-1, već može imati i direktne natriuretičke efekte i sniziti krvni pritisak putem lokalnog bubrežnog GABAergijskog sistema [47]. Stoga, potencijalni direktni i indirektni renoprotektivni efekti povećanog izlučivanja GABA u urinu uočeni nakon CSM-a u ovoj studiji zaslužuju dalje ispitivanje.

Izlučivanje arginina i glutamina u urinu (prekursor arginina [48]) se također povećalo nakon CSM-a, a koncentracije dvije aminokiseline u urinu bile su umjereno jako povezane jedna s drugom (r=0.6). U modelu Wistar štakora s visokim udjelom masti, RYGB je pokazano da mijenja mikrobnu biosintezu arginina, što rezultira nižim koncentracijama arginina u debelom crijevu i višim koncentracijama aspartata u debelom crijevu [42]. Takve promjene nisu uočene nakon ekvivalentnog gubitka težine putem dijete. Promjene u argininu i glutaminu također mogu ukazivati ​​na povećanu apsorpciju aminokiselina nakon RYGB. RYGB ubrzava probavu proteina i rezultira bržim i prolaznijim post-prandijalnim povećanjem cirkulirajućih aminokiselina [49]. U modelu gojaznog Zucker štakora, RYGB je pokazano da selektivno povećava apsorpciju glutamina u biliopankreatičnim i Rouxovim udovima kroz transkripcijsku regulaciju B0AT1 glutaminskog transportera [50]. Takve promjene u transportu aminokiselina mogu biti uključene u metaboličke prednosti postupka, jer i arginin i glutamin mogu stimulirati lučenje inzulina iz stanica pankreasa, kao i GLP-1 iz crijevnih L-ćelija [51– 53].

Smanjeno izlučivanje BCAA valina i leucina urina urina, kao i BCAA kataboličkih intermedijera 3-hidroksibutirata (valin katabolita), 3-hidroksiizovalerata (katabolita leucina) i 3-metil-2- oksovalerat (katabolit izoleucina) je uočen nakon CSM. Smanjenje izlučivanja 3-hidroksiizobutirata, 3-metil-2-oksovalerata i valina u urinu bilo je umjereno do snažno povezano sa poboljšanjem krvnog pritiska u 6. i 24. mjesecu u CSM kraku. S obzirom na utvrđene veze između povećanja nivoa BCAA, otpornosti na inzulin i hipertenzije [34-40], ovo sugerira da fiziološke posljedice poboljšanog katabolizma BCAA u skeletnim mišićima i masnom tkivu mogu igrati ulogu u antihipertenzivnim i metaboličkim prednostima RYGB [54]. ]. Zaista, zabilježeno je smanjenje cirkulirajućih BCAA nakon RYGB i vertikalne sleeve gastrektomije [55,56], iako smanjenje cirkulirajućih BCAA možda nije potrebno za postizanje korisnih metaboličkih efekata operacije gojaznosti [57].

BCAA katabolizam može ispoljiti renoprotektivne efekte davanjem intermedijara ciklusa trikarboksilne kiseline kada je oksidacija masnih kiselina (FAO) poremećena. Masne kiseline su primarni izvor energije zaproksimalni tubul bubrega, visoko energetski zahtjevna regija koja je osjetljiva na ozljede kada je FAO oštećen [58]. Zaista, oštećenje proksimalnog tubularnog FAO je implicirano u patogenezi DKD [58]. Proksimalni tubularni specifičan nokdaun Krüppelovog faktora 6 (KLF6), transkripcionog faktora koji se inducira u proksimalnom tubulu na početkuakutna povreda bubregai koji suzbija BCAA katabolizam, od čega je zaštićen mišakutna povreda bubregai fibroza [59]. Miševi zaštićeni odakutna povreda bubregadokazano je da imaju očuvanu ekspresiju gena koji kodiraju BCAA kataboličke enzime [59]. Stoga, pojačani BCAA katabolizam može biti impliciran u veće smanjenje albuminurije uočeno nakon CSM-a nakon 2- godine praćenja.

Naše istraživanje treba tumačiti u kontekstu određenih ograničenja. Veličina studije bila je skromna, sa ukupno 97 uzoraka podvrgnutih 1H-NMR u dva kraka istraživanja (MTA i CSM) i dvije vremenske tačke (osnovna linija i mjesec 6). Ipak, činjenica da je ova pod-studija bila ugniježđena u jednom od prvih RCT-ova za procjenu uticaja RYGB naprimarna renalna krajnja tačkaje posebna snaga dizajna studije [19,20]. Među pacijentima uključenim u ovu podstudiju, postojale su razlike u etničkoj pripadnosti između dvije grupe istraživanja, pri čemu je veći udio pacijenata u CSM grupi bio bijelaca. Slični nalazi uočeni su u glavnoj studijskoj kohorti [20]. Ipak, PLS model koji upoređuje urinarni 1H-NMR vršni intenzitet između osoba bijele rase (n=18) i drugih etničkih grupa (n=10) na početku u MTA kraku nije pružio dokaze o sistematskoj razlici u urinu metabolomski profili vezani za etničku pripadnost u ovoj studiji (Slika S2). Metabolomske analize su rađene na ranim jutarnjim uzorcima urina, a ne na vremenskim prikupljanjima urina. Nisu svi uzorci analizirani u trenutnoj studiji bili upareni uzorci istih pojedinaca i na početku i na 6. mjesecu. Međutim, izvršili smo analize osjetljivosti ograničene na podskup uparenih uzoraka (skoro polovina svih uzoraka) i pronašli slične rezultate.

PLS, za razliku od ortogonalnih parcijalnih najmanjih kvadrata (OPLS), u ovom istraživanju implementirani su modeli klasifikacije. Dok OPLS modeli nude prednost uklanjanja sistematske varijanse u skupu podataka koja nije povezana s klasom uzorka [60], PLS modeli provedeni s R paketom MUVR imaju koristi od ugniježđene ponovljene dvostruke unakrsne procedure, što smanjuje rizik od prekomjernog prilagođavanja modela. [61]. Suprotno konvencionalnim PLS algoritmima koji daju procjene iz modela za predviđanje uklapanja i rezultate unakrsne validacije kao točku poređenja, MUVR algoritam daje procjene samo iz unakrsnog potvrđivanja kako bi se smanjila vjerovatnoća prekomjernog prilagođavanja modela i lažno pozitivnog otkrića [61] . Ovo je važno razmatranje u studiji poput ove s relativno malom veličinom uzorka [61,62]. Nažalost, još nije moguće implementirati OPLS modele klasifikacije koristeći R paket MUVR [61]. Kao takav, uprkos nedostatku procjene varijacije u prediktorskim varijablama ortogonalnim odgovoru, smatramo da je poželjno predstaviti rezultate iz PLS modela implementiranih putem MUVR-a, a ne OPLS modela provedenih bez ponovljene dvostruke unakrsne validacije u ovoj studiji.

4. Materijali i metode

4.1. MOMS RCT: Dizajn studije i rezultati

Studija mikrovaskularnih ishoda nakon metaboličke hirurgije (MOMS) je jednocentrično, randomizirano, nezaslijepljeno, kontrolirano kliničko ispitivanje (NCT01821508) koje istražuje učinkovitost kombinirane metaboličke operacije i medicinske terapije (CSM) naspram samo medicinske terapije (MTA) za postizanje remisije albuminurija u odraslih s pretilošću klase 1, dijabetesom tipa 2 i mikroalbuminurijom [20]. Glavni kriterijumi uključivanja bili su dob 18-65 godina, indeks tjelesne mase (BMI) 30-35 kg/m2, dijabetes tipa 2 sa HbA1c < 12%, i uACR > 30 mg/g. Primarni ishod studije bio je remisija mikroalbuminurije (uACR < 30 mg/g). Regrutacija za studije obavljena je između 1. aprila 2013. i 31. marta 2016. godine.

Roux-en-Y želučana premosnica (RYGB) bila je metabolička operacija korištena u MOMS studiji i izvedena je laparoskopski od strane jednog kirurga (RVC) sa želučanom vrećicom od 30 mL, probavnim ekstremitetom od 150 cm i biliopankreasnim ekstremitetom od 80 cm. Lijekovi s blagotvornim djelovanjem na mikrovaskularne i makrovaskularne ishode dijabetesa tipa 2 davani su rano nakon početka ispitivanja ako ih pacijenti već nisu primali. Algoritmi liječenja bili su u skladu sa smjernicama društva za dijabetes koje su ažurirane tokom praćenja studije [63]. Dalji detalji o studijskim tretmanima dostupni su u protokolu studije i 24-mjesečnom dokumentu o ishodima [19,20].

Rezultati studije procijenjeni na početku kao iu 6. i 24. mjesecu i predstavljeni u ovoj podstudiji uključuju uACR, serumski kreatinin, HbA1c, lipide u krvi (ukupni holesterol, holesterol lipoproteina niske gustine (LDL-C), holesterol lipoproteina visoke gustine (HDL-C) i trigliceride), krvni pritisak i antropometriju (tjelesna težina, obim struka i BMI). Uzorci krvi i urina su uzeti nakon minimalno 8-h posta. Uzorci urina su uzeti u ranim jutarnjim satima. Laboratorijska mjerenja je obavljala ista centralna laboratorija, certificirana od strane ISO9001 i ISO14001, a akreditirana od strane Koledža američkih patologa. Krvni tlak je mjeren kalibriranim aneroidnim tlakomjerom nakon 5 minuta odmora. Sistolni krvni pritisak (SBP) i dijastolni krvni pritisak (DBP) izračunati su kao aritmetička sredina dva očitavanja dobijena u razmaku od 5 minuta. Srednji arterijski krvni pritisak (MAP) izračunat je dodavanjem 1/3 pulsnog pritiska na DBP.

Studija je provedena u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije i odobrena od strane Institucionalnog istraživačkog etičkog komiteta bolnice Alemão Os waldo Cruz (broj studije: NCT01821508). Svi učesnici su dali formalni pismeni informirani pristanak.

4.2. Metabolomske analize: spektroskopija nuklearne magnetne rezonance (NMR).

Metabolom u urinu procijenjen je spektroskopijom 1H-nuklearne magnetne rezonance (NMR) u uzorcima urina prikupljenim na početku i 6 mjeseci nakon intervencije u podgrupi pacijenata uključenih u MOMS studiju. Ukupno je analizirano 97 uzoraka iz obe vremenske tačke; podskup od 46 ovih uzoraka bili su upareni uzorci istih pojedinaca u obje vremenske tačke. Broj analiziranih uzoraka, stratificiranih po kraku istraživanja i vremenskoj tački, prikazan je u Tabeli 4.

1H-NMR spektroskopija je izvedena prema standardnim metodama Bruker in vitro dijagnostičkog istraživanja (IVDr) [64]. Uzorci urina su odmrznuti na sobnoj temperaturi 20 min prije kratkog centrifugiranja na 2000 g na 4 ◦C tokom 10 min. NMR uzorci za 5 mm SampleJet police pripremljeni su miješanjem 9 dijelova urina sa 1 dijelom pufera za urin (1,5 M KH2PO4 pD 6,95, 0,5% w/v NaN3, 0,1% w/v 3-trimetilsilil propionska-2 ,2,3,3 kisela natrijumova so D4 (TSP-d4) u 99,8% D2O) korišćenjem robota za rukovanje tečnostima Samplepro Tube L (Bruker BioSpin, Ettlingen, Nemačka), održavajući temperaturu na 279 K tokom procesa pripreme uzorka. Da bi se zapečatile epruvete za uzorke, POM kuglice su dodane u poklopce epruveta pre postavljanja stalka u ohlađeni SampleJet izmenjivač uzoraka na spektrometru.

1D nuklearna Overhauser efekt spektroskopija (NOESY) i 2D J-razlučeni eksperimenti su nabavljeni za svaki uzorak sa 600 MHz Bruker Avance III HD spektrometrom na 300 K opremljenim sa 5 mm BBI sondom za sobnu temperaturu , koristeći standardne setove parametara IVDr za impulsne sekvence 'noesygppr1d' i 'jresgpprqf'. 1D NOESY eksperiment je uključivao prikupljanje 32 skeniranja u 64.000 tačaka podataka, sa širinom spektra od 20 ppm, vremenom akvizicije od 2.726 s, kašnjenjem relaksacije od 4 s, NOESY vremenom miješanja od 10 ms, 4 lažna skeniranja pri postavka pojačanja prijemnika od 90,5, i pomak predzasićenja usredsređen na signal vode. Za 2D J-razriješen eksperiment, nakon 16 lažnih skeniranja, dva skeniranja po inkrementu su prikupljena u 40 inkremenata u indirektnoj dimenziji, sa 8k tačaka podataka u direktnoj dimenziji, i vremenom akvizicije od 0,4085 s i 0,2137 s za direktnu i indirektnu dimenziju. dimenzije, respektivno. Kašnjenje relaksacije je bilo 2 s. Spektralni prozor je bio 16,7 ppm i 93,6 Hz u direktnoj i indirektnoj dimenziji, respektivno. Pojačanje prijemnika je postavljeno na 90,5, a potiskivanje vode je postignuto preko prezasićenja tokom kašnjenja relaksacije, slično kao u 1D NOESY eksperimentu.

Uzorci urina su randomizirani tokom pripreme uzorka tako da su uzorci iz različitih grupa istraživanja i vremenskih tačaka bili ravnomjerno raspoređeni tokom prikupljanja podataka. TSP-d4 je korišten za interno referenciranje hemijskog pomaka.

Deset združenih uzoraka (n=5 od kojih svaki sadrži alikvote uzoraka iz obje vremenske tačke, početne linije i 6. mjeseca) uključeno je kao interne kontrole kvaliteta. Procentualni koeficijent varijacije u PQN-normaliziranom vršnom intenzitetu između baznih uzoraka i 6. mjeseca skupljenih uzoraka izračunat je za svaki označeni 1H-NMR pik (n=208) kako slijedi:

Proračuni su obavljeni odvojeno za osnovnu liniju i za objedinjene uzorke 6 mjeseca, a vrijednosti koeficijenta varijacije za svaki označeni vrh su postavljene na https: //osf.io/vs2dg/ (pristupljeno 15. januara 2022.). Konstruisan je grafikon gustine koji naglašava raspodelu vrednosti koeficijenta varijacije za svaki označeni 1H-NMR pik. X-osa grafikona gustoće je log-transformirana korištenjem 'log1p' transformacije iz R paketa [25]. Ilustrativni dijagrami PQN-normaliziranih spektra skupljenih uzoraka generirani su za određene pikove za koje je utvrđeno da su promijenjeni CSM multivarijantnom analizom korištenjem funkcije 'ROIplot' iz R paketa speaq [26], čime se pokazuje niska varijansa u vršnom intenzitetu između skupljenih uzoraka. .

Da bi se olakšalo označavanje metabolita, skup 2D eksperimenata na odabranim uzorcima nabavljen je na Oxford 800 MHz magnetu opremljenom Bruker Avance III HD konzolom i 3 mm TCI kriosondom. Višestruko uređeni 13C-HSQC-ovi su dobijeni pomoću impulsne sekvence 'hsqcedetgpsisp2.3' koristeći spektralne širine od 20 i 90 ppm u direktnoj i indirektnoj dimenziji, respektivno, prikupljajući 64 skeniranja po inkrementu za ukupno 512 inkremenata i 208 tačaka podataka. Vremena akvizicije bila su 63,9 i 14 ms za direktnu i indirektnu dimenziju, respektivno, a kašnjenje relaksacije je bilo 1,5 s. 1H-1H TOCSY su dobijeni korištenjem pulsne sekvence 'dipsi2esgpph' sa širinama sweep u obje dimenzije od 12 ppm, prikupljajući 16 skeniranja po inkrementu u 512 inkremenata i 8192 tačke podataka. Vremena akvizicije bila su 0,426 s i 26,6 ms za direktnu i indirektnu dimenziju, respektivno. Kašnjenje prijenosa TOCSY iznosilo je 60 ms, a kašnjenje opuštanja između skeniranja bilo je 1 s. 1H-1H-COSY su dobijeni sa sekvencom impulsa 'cosygpppqfpr'. Širina zahvata iznosila je 13,95 ppm u obje dimenzije; Prikupljena su 4 skeniranja po inkrementu za ukupno 1024 inkrementa i 2048 tačaka podataka. Vrijeme akvizicije je 92 ms, a kašnjenje relaksacije 2 s. Svi 2D spektri su referencirani na TSP-d4. Tabele hemijskih pomaka koje prikazuju vrijednosti pomaka 13C-HSQC, 1H-TOCSY i 1H-COSY za sve vrhove (n=475) i za podskup označenih vrhova (n=208) dostupne su na: https ://osf.io/vs2dg/, pristupljeno 15. januara 2022.

4.3. 1H-NMR spektralna obrada

1D NOESY spektri namijenjeni za odabir pikova i multivarijantnu analizu obrađeni su automatskim IVDr AU programom, što znači da su dva puta popunjeni nulom prije Fourierove transformacije u 128.000 tačaka podataka, dodajući 0.3 Hz eksponencijalno proširenje linije i pozivajući se na TSP-d4. Spektri su obrađeni u TopSpin3.5pl7 (Bruker BioSpin, Et tlingen, Njemačka). 1D NOESY spektri su učitani u MATLAB pomoću RBNMR [65]. Bazna korekcija spektra izvršena je zbog visokih koncentracija glukoze u urinu prisutnih u osnovnim uzorcima pomoću naredbe 'msbackadj' sa veličinom prozora postavljenom na 2000, kvantilom na 0,1 i veličinom koraka na 1000 [66 ]. Bazno ispravljeni 1D NOESY spektri i prateći vektor hemijskog pomaka delova na milion (ppm) zajedno sa metapodacima uzorka dostupni su na: https://osf.io/vs2dg/, pristupljeno 15. januara 2022.

Dalja analiza NMR podataka izvršena je korištenjem R statističkog programskog jezika (4.1.1) [67]. Spektri i vrijednosti hemijskog pomaka u ppm su uvezene i obrađene u matricu vršnog intenziteta prema standardnom toku rada koristeći R paket speak [26]. Detekcija pikova je izvedena meksičkom hat wavelet metodom implementiranom funkcijom 'getWaveletPeaks'. Otkriveni vrhovi su poravnati i grupirani u jednu vrijednost indeksa ppm koristeći funkciju 'PeakGrouper'. Dijagrami sirovih spektra, detekcije pikova i grupisanja/poravnanja pikova pomoću speaq-a generisani su korišćenjem funkcije 'ROIplot' i ručno pregledani za svaki vrh od interesa. Ilustrativan primjer jednog takvog dijagrama predstavljen je na slici 9. PDF koji prikazuje dijagrame sirovog spektra, detekcije pikova, poravnanja vrhova i intenziteta pika po grupama za sve označene vrhove (n=208) dostupan je na: https ://osf.io/vs2dg/, pristupljeno 15. januara 2022.

Slika 9. Sirovi spektri i spektralna obrada odabranog pika urinarne 1H-NMR spektroskopije. (A) Sirovi 1H-NMR spektri odabranog pika N-fenilacetilglicina. Svaka linija odgovara spektru jednog uzorka. (B) Detekcija pikova unutar spektra pomoću meksičke hat wavelet transformacije. Svaka tačka predstavlja vršni intenzitet za jedan uzorak. (C) Poravnavanje pikova grupiranjem kako bi se uzeli u obzir pomaci u pikovima između spektra zbog razlika u okruženju uzorka i/ili eksperimentalnim uslovima. Svaka tačka predstavlja vršni intenzitet za jedan uzorak. Ručna inspekcija spektra i spektralna obrada u speaq-u izvršena je kao što je ovdje navedeno za pikove identificirane kao važne za performanse klasifikacije pomoću multivarijantnih modela kako bi se osiguralo da razlike između grupa u identificiranim pikovima nisu artefaktičke i da se mogu pouzdano identificirati u spektrima. 1H-NMR spektroskopija, protonska nuklearna magnetna rezonantna spektroskopija; CSM, kombinovana metabolička hirurgija plus medicinska terapija; CSM0, osnovni uzorci iz CSM grupe; CSM6, 6. mjesec uzorci iz CSM grupe; MTA, samo medicinska terapija; MTA{12}}, osnovni uzorci iz MTA grupe; MTA6, 6. mjesec uzorci iz MTA grupe; PPM, dijelovi na milion kemijskog pomaka u odnosu na TSP-d4.

Vrijednosti siluete su izračunate kao metrika kvaliteta grupiranja vrhova pomoću funkcije 'SilhouetR'. Grupacije vrhova sa vrijednošću siluete manjom od {{0}}}.6 su uklonjene i vrhovi su pregrupisani sa funkcijom 'regroup'-ovaj proces se ponavljao iterativno sve dok sve grupe vrhova nisu imale vrijednost siluete veću ili jednaku 0.6. Popunjavanje pikova je izvršeno da bi se otkrili pikovi koji su možda propušteni tokom prvog kruga detekcije pikova.

Konačno, napravljena je matrica vršnog intenziteta sa grupisanim pikovima (identificiranim njihovim vrijednostima pomaka u ppm) kao kolonama i uzorcima kao redovima. Normalizacija vjerovatnog kvocijenta (PQN) primijenjena je na matricu vršnog intenziteta [68,69], koja je kasnije korištena kao ulaz za multivarijantnu statistiku. Neobrađene i PQN-normalizovane matrice vršnog intenziteta, kao i metapodaci uzorka dostupni su na: https://osf.io/vs2dg/, pristupljeno 15. januara 2022. Anotacija obrađenih spektra je obavljena korišćenjem softvera Chenomx 8.6 (Chenomx Inc.) , Baza podataka ljudskog metaboloma (HMDB; https://hmdb.ca/; pristupljeno 15. januara 2022.), Banka podataka o biološkoj magnetnoj rezonanciji (BMRB; https://bmrb.io/; pristupljeno 15. januara 2022.) i prikupljene 2D NMR podatke za odabrane uzorke [70–72].

4.4. Analiza glavnih komponenti 1H-NMR podataka

Grupiranje pomoću analize glavnih komponenti (PCA) izvedeno je na PQN-normaliziranim NMR vršnim intenzitetima korištenjem funkcije 'prcomp', i iscrtano po fenotipu duž glavnih komponenti 1-3 korištenjem funkcije 'scatter3D' iz R paketa plot3D [73] . Osnovni uzorci iz CSM i MTA krakova su razmatrani zajedno kako bi se povećala jasnoća na PCA dijagramu. Centroidi su izračunati kao srednji rezultati duž glavnih komponenti 1-3 za tri grupe: početnu liniju, MTA6 i CSM6. Elipsoidi su izračunati duž glavnih komponenti 1–3 korištenjem funkcije 'makeEllipsoid' iz R paketa ChemoSpec i nacrtani korištenjem 'scatter3D' [27,73]. Opterećenja su ekstrahirana iz objekta glavne komponente i iscrtana pomoću funkcije 'scatter3D', s odabranim vrhovima označenim [73].

4.5. Fold Change Testing 1H-NMR podataka

Za poređenje između grupa od interesa, izračunata je kratka promjena u PQN-normaliziranom urinarnom 1H-NMR vršnom intenzitetu. Za poređenja između grupa uz korištenje svih dostupnih uzoraka, izvedeni su neupareni t-testovi pomoću statike R paketa kako bi se uporedio intenzitet svakog pika između dvije grupe uzoraka [74]. Za poređenje između grupa koristeći samo uparene uzorke, upareni t-testovi su izvedeni korištenjem R paketa statičkog [74]. p-vrijednosti su višestruko ispravljene za broj poređenja (pikova) korištenjem Benjamini–Hochbergove metode [75]. Za poređenja između grupa koristeći sve dostupne uzorke, srednji vršni intenzitet za svaku grupu je izvučen iz nesparenog t-test objekta. Za međugrupna poređenja uparenih uzoraka, srednji vršni intenzitet po grupama izračunat je korištenjem osnovne R funkcije 'srednja' jer procjene srednje vrijednosti nisu vraćene u uparenim t-test objektima [67]. Log2 puta promjena je izračunata kao:

Rezultati testiranja promjene preklopa za poređenje koristeći sve dostupne uzorke (MTA{{0}} vs. CSM0, MTA0 vs. MTA6, CSM0 vs. CSM6 i MTA6 naspram CSM6) predstavljeni su kao vulkanski dijagrami, sa promjenom log2 puta na x-osi i –log10 p-vrijednosti ispravljene višestruko na y-osi. Vrijednosti promjene log2 puta i pridružene p-vrijednosti za sve dostupne uzorke CSM0 naspram CSM6, uparene uzorke CSM0 naspram CSM6 i poređenja MTA6 naspram CSM6 također su sažeta u tabeli za pikove identificirane kao promijenjene od strane CSM od početne do 6. mjeseca multivarijantnim modelima klasifikacije parcijalnih najmanjih kvadrata (PLS).

4.6. 1H-NMR klasifikacijsko modeliranje

Da bi se razjasnile razlike u metabolomu urina između pacijenata liječenih CSM i MTA, korišten je R paket MUVR za uklapanje serije multivarijantnih modela PLS klasifikacije za usporedbu dvije grupe uzoraka u isto vrijeme [61]. MUVR modeli su ugrađeni u PQN-normalizirane 1H-NMR matrice intenziteta maksimuma (X matrice) koje sadrže relevantne uzorke za svako poređenje [61]. AY vektor odgovora koji ukazuje na dodjelu grupe uzoraka unesen je u svaki nadzirani model.

Grupe uzoraka korištenih za usporedbe ispitivanih MUVR modelima prikazane su u Tabeli 5, zajedno s brojem uzoraka unesenih u svaki model, kao i lokacijom rezultata modela unutar rukopisa. Kao što je navedeno u Tabeli 4 iznad, nisu svi uzorci od početne vrijednosti do 6. mjeseca nužno bili od istih pojedinaca. Kako bi se maksimizirala upotreba uzorka, kao i statistička snaga, primarni PLS modeli su vođeni na svim dostupnim uzorcima (mješavina neuparenih i uparenih uzoraka) za dato poređenje. Kao analize osjetljivosti, PLS modeli su također prilagođeni podskupu uparenih uzoraka istih pojedinaca u obje vremenske tačke za relevantna poređenja. ID-ovi uzorka su uneseni u ove uparene modele uzoraka u nastojanju da se smanji preopterećenost modela osiguravajući da se uzorci iste osobe drže zajedno u segmentima unakrsnog provjere.

Tabela 5. Pregled MUVR modela i lokacija rezultata unutar rukopisa 1 .

1 CSM, kombinovana metabolička hirurgija plus medicinska terapija; CSM0, osnovni uzorci iz CSM grupe; CSM6, 6. mjesec uzorci iz CSM grupe; MTA, samo medicinska terapija; MTA0, osnovni uzorci iz MTA grupe; MTA6, 6. mjesec uzorci iz MTA grupe; MUVR, multivarijantne metode sa nepristrasnom selekcijom varijable u R.

MUVR algoritam minimizira prekomjerno prilagođavanje u multivarijantnom modeliranju izvođenjem rekurzivne eliminacije najmanje informativnih varijabli u ponovljenoj proceduri dvostruke unakrsne validacije [61]. Sljedeći parametri modeliranja su korišteni prema preporuci: nOuter=8 (broj vanjskih segmenata unakrsne validacije, kako bi se osiguralo da su obje klase prisutne u svim segmentima modela), nRep=100 (broj ponavljanja modela, veliki broj je odabran da poboljša reproduktivnost), i varRatio=0.85 (udio varijabli koje se održavaju u podacima po iteraciji modela tokom eliminacije varijable) [61].

MUVR vraća tri konsenzusna modela ('min', 'mid', i 'max') sa sličnom kondicijom [61]. 'max' model, koji uzima u obzir sve relevantne prediktore bez kompromitiranja performansi klasifikacije, odabran je da identifikuje što više urinarnih 1H-NMR pikova koji su relevantni za klasifikaciju uzoraka urina prema grupi. Stabilnost modela kroz 100 ponavljanja osigurana je inspekcijom broja i proporcije odabranih varijabli, kao i broja pogrešnih klasifikacija po ponavljanju i kumulativno; konvergencija se dogodila za 20 ponavljanja za sve modele.

Područje ispod krive radne karakteristike prijemnika (AUC) i brojne pogrešne klasifikacije modela korištene su za procjenu performansi modela. Broj pogrešnih klasifikacija se koristi za procjenu prikladnosti MUVR PLS modela klasifikacije, a ne metrika kao što su R2X, R2Y i Q2 [61]. AUC i pridruženi interval pouzdanosti od 95% izračunati su unosom stvarne klase uzorka uz predviđenu vjerovatnoću klase uzorka (dobijenu iz MUVR modela) u funkciju 'roc' iz R paketa pROC [76]. Krivulje radnih karakteristika prijemnika (ROC) generirane su korištenjem funkcije 'ggroc' iz pROC paketa [76]. Dodatne metrike performansi koje se odnose na klasifikaciju modela, uključujući ukupnu tačnost klasifikacije, Kappa statistiku, osjetljivost, specifičnost, pozitivnu prediktivnu vrijednost i negativnu prediktivnu vrijednost, izračunate su unosom stvarne klase uzorka uz predviđenu klasu uzorka na pragu vjerovatnoće od 50%. (dobijeno iz MUVR modela) na funkciju 'matrica konfuzije' iz R paketa careta [77]. Ove metrike performansi su predstavljene u tabeli za svaki model, pripremljenoj pomoću funkcije 'ggtexttable' iz R paketa ggpubr [78]. Matrica konfuzije je iscrtana za svaki MUVR model sa prikazom broja i udjela ispravnih i netočnih klasifikacija modela korištenjem prilagođene funkcije ggplot2 crtanja [79].