UMOD mutacije u kroničnoj bubrežnoj bolesti na Tajvanu

sažetak:UMODje prvi identificirani i najčešće mutirani gen koji uzrokuje autosomno dominantnutubulointersticijalna bolest bubrega(ADTKD). Nedavne studije su pokazale da ADTKD-UMODje relativno čest uzrokhronična bolest bubrega(CKD). Međutim, status ADTKD-UMODna Tajvanu ostaje nepoznat. U ovoj studiji identifikovali smo tri heterozigotaUMODmissense varijante, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) i c.817G > T (p.Val273Phe), u ukupno 221 odabranoj porodici CKD (1,36%). Dvije od ovih missense varijanti, p.Cys41Arg i p.Gly60Asp, nisu ranije prijavljene. In vitro, studije su pokazale da obje varijante uromodulina imaju defekte u prometu ćelijske membrane i izlučivanju u medijum kulture. Model strukture predviđa izmijenjeno formiranje disulfidne veze u obje varijante, ali je predviđeno da samo p.Gly60Asp uzrokuje destabilizaciju proteina. Naši nalazi proširuju spektar mutacija i ukazuju da ADTKD-UMODdoprinijelo malom, ali značajnom uzroku CKD-a u populaciji Tajvana.

Ključne riječi: uromodulin;hronična bolest bubrega(CKD); autosomno dominantni tubulointersticijskibolest bubrega(ADTKD); zatajenje bubrega (KF).

KLIKNITE OVDJE DA PREUZMETE CISTANCHE BILJNE DODATKE ZA BOLESTI BUBREGA

1. Uvod

ADTKD je rijetka dominantna nasljedna bolest uzrokovana heterozigotnim mutacijama u UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] i SEC61A1 [5]. UMOD je prvi identifikovani i najčešći uzrok ADTKD-a i bio je predmet opsežnog istraživanja [1,6]. Iako rijedak, ADTKD je treći najčešći monogenbolest bubreganakon ADPKD i kolagen tipa IV nefropatije, ali prevalencija ADTKD-UMOD ostaje nejasna, a nedavne studije pokazuju da predstavlja do 2% pacijenata sa KF ili 0.3% svih osoba sa CKD [7, 8]. UMOD kodira uromodulin i najzastupljeniji je protein u ljudskom urinu [9]. Uromodulin je protein specifičan za bubrege koji proizvode epitelne ćelije debelog uzlaznog ekstremiteta Henleove petlje i ranog dijela distalnog uvijenog tubula [10], a formira se kao polimer visoke molekularne težine preko svoje zone. pellucida domena [11]. Štaviše, uromodulin je visoko glikoziliran protein, sa sedam mjesta N-glikozilacije i cijepanjem na kraju C-terminala pomoću serin proteaze hepsina, prije nego što se izluči u tubularni lumen [9,12,13]. Funkcija uromodulina uključuje zaštitu od kristalizacije kalcijum oksalata [14], odbranu od infekcija urinarnog trakta od uropatogenih bakterija [15–18] i regulaciju Ca2+-K+ jonskog kanala [19]. Učinak UMOD mutacija je odloženo sazrijevanje, zadržavanje u endoplazmatskom retikulumu (ER), smanjena ekspresija na plazma membrani i smanjeno izlučivanje urina, što dovodi do ER stresa i nesavijenog proteinskog odgovora [20–22].

Klinički fenotipovi ADTKD-UMOD su nespecifični i uključuju CKD, giht, hiperurikemiju, normalnu do blagu proteinuriju, prisustvo ili nedostatak porodične anamneze i većinu pogođenih osoba koje ulaze u KF u dobi između 30 i 50 godina [23]. Histologija bubrega pokazuje tubularnu dilataciju ili atrofiju, poništavanje ili zadebljanje tubularne bazalne membrane, intersticijalnu fibrozu i akumulaciju mutiranog uromodulina kao polimorfnih nestrukturiranih materijala otkrivenih PAS bojenjem [24,25].

Tajvan ima najveću učestalost i prevalenciju CKD i KF na osnovu međunarodnih poređenja izvještaja USRDS [26]. Međutim, nijedna studija se nije fokusirala na status ADTKD-UMOD u populaciji CKD na Tajvanu. U ovoj studiji smo ispitali prevalenciju ADTKD-UMOD mutacija u odabranoj kohorti CKD u jednom tercijarnom centru na Tajvanu.

2. Materijali i metode

2.1. CKD pojedinci i priprema DNK

Ova studija je regrutovala 221 porodicu sa CKD (228 pojedinaca) iz programa nege CKD Medicinske univerzitetske bolnice Kaohsiung. Kriterijumi za uključivanje uključivali su epizode gihta ili hiperurikemiju sa eGFR manjim od 90 mL/min/1,73 m2 prije 40. godine života. Uzorci krvi, podaci o pedigreu i pristup rezultatima laboratorijskog rada dobiveni su od pojedinaca nakon davanja informiranog pristanka. Studija je sprovedena nakon Helsinške deklaracije i odobrena od strane Institucionalnog odbora za reviziju KMUH-a (KMUHIRB-G(II)-20160024). DNK iz uzoraka periferne krvi ekstrahirana je standardnom metodom.

2.2. Sekvenciranje egzoma i bioinformatička analiza

Nextera Flex for Enrichment and Exome panel (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, USA) korišten je za kreiranje exome biblioteke. Odabir veličine, hvatanje sekvence, obogaćivanje i eluiranje obavljeni su prema uputama proizvođača. Distribucija veličina DNK biblioteka je zatim izmjerena korištenjem TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, Kalifornija, SAD), nakon čega je uslijedilo sekvenciranje na Illumina NovaSeq 6000 sa 150 bp uparenih očitavanja. Dobijeni fastq podaci su usklađeni sa referentnom sekvencom ljudskog genoma (GRCh37/hg19) i izvršili smo pozivanje nukleotidne varijante koristeći DRAGEN Bio-IT platformu (Illumina). VCF fajl je analiziran u CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, SAD). Identificirane varijante su označene kao patogene/vjerovatno patogene, varijante neizvjesnog značaja (VUS) ili benigne, prema klasifikaciji Američkog koledža za medicinsku genetiku i genomiku (ACMG), koristeći softver VarSome, a mi smo uporedili varijante koje su postojale u ClinVar-u. , HGMD i dbSNP baze podataka. Detektovane patogene, vjerovatno patogene i VUS varijante potvrđene su Sangerovim sekvenciranjem. Za Sanger sekvenciranje, PCR proizvodi su pročišćeni tretmanom alkalne fosfataze/egzonukleaze I škampa (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, Kalifornija, SAD), a zatim podvrgnuti sekvenciranju s oba kraja termociklerskim sekvenciranjem pomoću BigDye® terminatora 3.1. komplet (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) nakon analize na ABI 3730XL DNK analizatoru (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Analiza segregacije je izvršena ako je DNK bio dostupan od članova porodice. Eksoni 2, 3, 4 i 5 UMOD-a su pregledani Sangerovim sekvenciranjem u probandu od 221 porodice CKD, osim porodice DY5, koja je dobila sekvenciranje egzoma. NCBI Ref sekvenca NM_003361.4 se koristi za UMOD. Standardna nomenklatura koju je preporučilo Društvo za varijacije ljudskog genoma (http//www.hgvs.org/; pristupljeno 18. jula 2022.) korištena je za numerisanje nukleotida i imenovanje mutacija ili varijanti.

2.3. Ćelijska kultura i prolazna transfekcija

HEK293 ćelije (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, SAD) uzgajane su u Kaighnovoj modifikaciji Hamovog F-12 medijuma (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, SAD) sa dodatkom 10% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD), 100 jedinica/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina (10378016, Gibco Fisher, Thermo Fisher) ), i 10 jedinica/mL interferona (IF002, Merck/Millipore Sigma). Ćelije su održavane na 37 ◦C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2.

Prolazna transfekcija ćelija HEK293 izvedena je upotrebom Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Ukratko, 2,5 µL Lipofectamine 2000 je dodano direktno u 100 µL Optimum medijuma (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) i inkubirano 5 minuta na sobnoj temperaturi. Ukupno 1 µg DNK je dodat u Lipofectamine 2000-Optimum mješavinu i inkubiran još 20 minuta. Smjesa DNK je dodana u kapima na pločice za ćelijsku kulturu sa medijumom bez seruma na kraju inkubacije. Za zdravstveni status ćelija nakon prolazne transfekcije, koristili smo LUNA-II™ automatizovani brojač ćelija (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Koreja) da bismo otkrili vitalnost ćelija obojene tripan plavim u različitom vremenskom trenutku, i većina transficirane ćelije su ostale žive nakon različite prekomerne ekspresije uromodulina (podaci nisu prikazani).

2.4. Site-Directed Mutagenesis

HA-označeni vektor divljeg tipa uromodulin je dobijen od dr. Rampoldija [27]. Mutacijski konstrukti p.Cys41Arg i p.Gly60Asp kreirani su korištenjem QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (200523, Agilent) prema uputama proizvođača. Mutacije su potvrđene Sangerovim sekvenciranjem

2.5. ELISA i frakcioniranje

Prazni vektor, divlji tip uromodulin, p.Cys41Arg uromodulin i p.Gly60Asp uromodulin ekspresijski konstrukti su prolazno transficirani u ćelije HEK293. Nakon prolazne transfekcije, medij kulture je sakupljen u 8, 24 i 32 h, a zatim pohranjen na -80 ◦C prije mjerenja. Za imunoblotiranje, medij kulture je kondenziran pomoću Centri con (YM3, ikona, Merck/Millipore Sigma) prije SDS-PAGE elektroforeze. ELISA je korišćena za merenje uromodulina u medijumu kulture prema uputstvima proizvođača (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Ukratko, podloga za kulturu i standardi razrijeđeni su u razblaživaču za analizu koji se nalazi u kompletu i dodani u jažice u duplikatu. Nakon 2,5 h inkubacije na sobnoj temperaturi, jažice su isprane PBS-om i dodano je biotinilirano uromodulin antitijelo. Nakon 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi, jažice su ponovo isprane i dodano je sekundarno antitijelo na streptavidin-peroksidazu rena. Nakon 45 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, jažice su ponovo isprane, a boja je razvijena dodavanjem rastvora TMB supstrata i inkubacijom u mraku na sobnoj temperaturi 30 minuta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem otopine za zaustavljanje isporučenog u kompletu, nakon čega je odmah uslijedilo očitavanje OD450 i OD550. Koncentracija uromodulina u mediju kulture određena je interpolacijom na standardnoj krivulji.

Nakon što je medij za kulturu sakupljen, ćelije pričvršćene na posudu za kulturu su nastavile sa frakcionisanjem pomoću kompleta za frakcionisanje subćelijskih proteina (78840, Thermo Fisher Scientific) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, prikupili smo jednake količine tri različite vrste lizata ćelija uromodulin i uklonili sav supernatant dok se ne osuši što je više moguće. Dodali smo ledeno hladan citoplazmatski pufer za ekstrakciju koji sadrži inhibitore proteaze u ćelijsku peletu, inkubiran na 4 ◦C 10 min uz lagano miješanje, zatim centrifugiran na 500× g 5 min. Odmah smo uklonili supernatant (citoplazmatski ekstrakt) u čistu prethodno ohlađenu epruvetu na ledu i dodali pufer za ekstrakciju ledeno hladne membrane koji sadrži inhibitore proteaze u pelet. Dio membrane je vorteksiran 5 s na najvišoj postavci i inkubiran na 4 ◦C 10 minuta uz lagano miješanje. Prebacili smo supernatant (ekstrakt membrane) u čistu prethodno ohlađenu epruvetu na ledu nakon centrifugiranja na 3000 × g tokom 5 minuta. Subcelularna membrana i citoplazmatski protein analizirani su Western blottingom.

2.6. Imunoblotting analiza

Uzorci proteina su sakupljeni iz ćelija pomoću RIPA pufera (R0278, Merck/Millipore Sigma) ili korakom frakcionisanja. Nakon toga, koncentracija proteina je određena korištenjem boje za ispitivanje proteina (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) i pristupa jednakoj količini proteina, a zatim razdvojena elektroforezom na SDS-PAGE. Nakon što su proteini prebačeni na poliviniliden difluorid (PVDF) membrane (1620177, BIO-RAD), PVDF membrana je uronjena u 5% obrano mlijeko na 1X TBST, blokirajući 1 h na sobnoj temperaturi, i isprana tri puta sa 1X TBST za 5 min. Zatim smo inkubirali PVDF membranu sa primarnim antitelom na 4 ◦C preko noći, isprali je tri puta sa 1X TBST tokom 5 minuta i inkubirali je sa sekundarnim antitelom 1 h na sobnoj temperaturi. Opran je tri puta sa 1X TBST tokom 5 minuta nakon sekundarne inkubacije antitela, zatim smo dodali supstrat kit za poboljšanu hemiluminiscenciju (ECL) (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) i detektovali proteinski signal pomoću rendgenskog procesora (MXP{{ 19}}, KODAK, Rochester, NY, SAD) na rendgenskom filmu (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Primarna i sekundarna antitijela su razrijeđena sa 5% obranog mlijeka u 1X TBST, a detaljne informacije su sljedeće 1:2000 za uromodulin (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) i 1:20,000 za zeca HRP 2. antitijelo (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, Kalifornija, SAD).

2.7. Predviđanje strukture proteina

Dinamit je primijenjen za predviđanje 3D strukture divljeg tipa i mutantnog uromodulina (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; pristupljeno 15. juna 2022.) koristeći strukturu pune dužine prirodnog ljudskog uromodulina (protein Banka podataka: 7PFP) [28]. DiANNA je korištena za predviđanje disulfidne veze (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; pristupljeno 16. juna 2022.) divljeg tipa i mutantnog uromodulina [29–31].

2.8. Statistička analiza

Softver za analizu ImageJ analizirao je i kvantificirao western blot trake. Statističke analize i grafikoni su obavljeni i pripremljeni pomoću softvera GraphPad Prism8 (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, USA), a prikazana je srednja vrijednost ± SEM. Za poređenje dvije grupe primijenjen je neupareni t-test. Statistički rezultati su označeni na sljedeći način: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Svaki eksperiment je ponovljen najmanje tri puta.

Služba podrške:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Prodavnica:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop