Novi efekti kombinovane terapije kroz inhibiciju piroptoze izazvane kaspazom-1/Gasdermin D u lupus nefritisu

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang i Jin Lin

SAŽETAK

Ciljevi: Kombinovana terapija sa mikofenolat mofetil, takrolimusom i steroidima je efikasna u postizanju potpune remisije ulupus nefritis(LN). Kombinovana terapija je jedinstveno smanjila regulaciju kaspaze-1 u poređenju sa monoterapijom, koja može cijepati gasdermin D (GSDMD) i nedavno je identificirana kaopiroptozadželat. Stoga smo istražili da li je kombinovana terapija omogućila supresiju kaspaze-1/GSDMD posredovanepiroptozau LN (lupus nefritis).

Click to cistanche deserticola ma za nefritis

Metode: Ekspresija i aktivacija GSDMD otkrivena je u uzorcima bubrega čovjeka i miša sa LN (lupus nefritis) korištenjem imunohistohemijskog bojenja i imunoblotinga. Primarni podociti izolovani iz MRLlpr miševa inkubirani su sa LPS plus ATP i prethodno tretirani monoterapijom ili kombinovanom terapijom. Inhibicija kaspaze-1/GSDMD izazvanapiroptozakombinovanom terapijom je procijenjen kod MRLlpr miševa i ljudskih uzoraka. Pregledan sam pomoću FAM kaspaze-1 kompleta i protočne citometrije. Korelacija izmeđupiroptozau perifernoj krvi i analiziran je indeks aktivnosti bolesti sistemskog eritematoznog lupusa (SLEDAl).

Rezultati: Uzorci tkiva bubrega iz LN (lupus nefritis) pacijenti i miševi su pokazali značajno povećane nivoe ekspresije i cijepanje GSDMD. U kultivisanim podocitima, kombinovani tretman je značajno potisnuo aktivaciju NLRP3 i kaspaze-1 i smanjio nivoe GSDMD N-terminala. Kombinovana terapija potisnula je progresiju bolesti inhibicijom kaspaze-1/GSDMD posredovanepiroptozai kod ljudi i kod MRL/LPR miševa. Broj pozitivnih ćelija kaspaze-1/PI u perifernoj krvi bio je u pozitivnoj korelaciji sa SLE-DAl. LN (lupus nefritis) pacijenti sa potpunom i djelomičnom remisijom imali su značajno smanjen broj kaspaza-1/PI pozitivnih ćelija u poređenju sa početnom linijom. Ac-FLTD-CMK, inhibitor GSDMD, spriječio je razvoj LN (lupus nefritis).

Zaključak: Kombinirana terapija potisnula je kaspazu-1/GSDMD posredovanupiroptozain vitro i in vivo i smanjena progresija bolesti.

Ključne riječi:lupus nefritis, piroptoza, kaspaza-1, gasdermin D, terapija

Terapija za liječenjepiroptoza

UVOD

Lupusni nefritis(LN) je upala bubrega koja nastaje kao posljedica autoimune bolesti sistemski eritematozni lupus (SLE).LN (lupus nefritis) je glavna manifestacija kod pacijenata koji pate od SLE. Oko 60 posto pacijenata razvije ovo stanje, a otprilike 20 posto napreduje u završnu bolest bubrega (ESRD)(1). Kombinovana terapija sa mikofenolat mofetil (MMF), inhibitorima kalcineurina (CNI) i steroidima proizvodi komplementarne efekte i minimizira toksičnost (2). Ova terapija se preporučuje kao početni tretman za LN (lupus nefritis) i proizvodi bolju efikasnost i potpuniju remisiju u poređenju sa intravenskim ciklofosfamidom (IVCY) i steroidima (3-5).

Da bi se istražili molekularni i stanični mehanizmi kombinovane terapije, upotrebljena je sveobuhvatna transkriptomska analiza u mišjem modelu LN. (lupus nefritis). MRL/LPR miševima je davan sam MMF, takrolimus ili prednizon kao monoterapija ili kombinacije trostrukih lijekova. Profili ekspresije gena u bubrezima miševa sa LN (lupus nefritis)otkrili su potencijalne mehanizme koji bi mogli objasniti aditivne i sinergističke efekte kombinovane terapije u poređenju sa monoterapijom. Jedan od 45 gena smanjene regulacije koji su jedinstveno modulirani kombinovanom terapijom je kaspaza-1 (6). Aktiviraju ga inflamasomi, koji su multiproteinski oligomeri koji se sastoje od NLRP3, pro-kapaze-1 i proteina nalik na tačku (ASC) povezanog s apoptozom, s integriranom domenom afiniteta kaspaze. NLRP3/ASC/caspase-1 inflamasom je prepoznat kao ključni faktor koji doprinosi patogenezi LN (lupus nefritis). NLRP3 inflamasom pokreće autoinflamatorne poremećaje aktiviranjem kaspaze-1, inicirajući stvaranje proinflamatornih citokina, npr. IL-1, za koje se zna da izazivaju disfunkciju podocita u LN(7-9).

Aktivna kaspaza-1 cijepa gasdermin D(GSDMD) unutar veze njegovih N- i C-terminalnih domena. Zatim, N-terminalni domen olakšava stvaranje pora u ćelijskoj membrani, stimuliše ćelijupiroptozai proizvodnja citokina IL-1 i IL-18(10). Nove studije su pokazale da je GSDMD posredovanpiroptozaučestvuje u napredovanju bolesti uključujući autoimuni encefalomijelitis (11), multiplu sklerozu (12), alkoholni hepatitis (13) i inflamatornu bolest crijeva (14). Osim toga, genetska ili farmakološka inhibicija kaspaze-1/GSDMD ima dokazano je da štiti bubrege od ozljeda na mišjim modelima dijabetesne bolesti bubrega (15, 16), kao i nakon akutne povrede bubrega (17-19). Kako god,piroptozau LN (lupus nefritis)je do danas još uvijek slabo definiran(20). Pretpostavili smo da kombinovana terapija daje korisne efekte u LN (lupus nefritis)) inhibicijompiroptozainducirano kaspazom-1/GSDMD.

U ovoj studiji, ispitivana je aktivacija kaspaze-1 i GSDMD u tkivima bubrega, kao i efekti kombinovane terapije na kaspazu-1/GSDMD zavisnupiroptozainhibicija kod MRL/LPR miševa i pacijenata sa LN (lupus nefritis). Potencijalne korelacije odpiroptozasa indeksom aktivnosti SLE bolesti (SLEDAI) i odgovori na tretman su takođe procenjeni.

Tretman zapiroptoza

MATERIJALI I METODE

Studijska populacija

Ispitivana kohorta se sastojala od pacijenata kojima je biopsijom dijagnosticiran LN (lupusnefritis) Manje ili jednako 6 mjeseci prije upisa. Starost pacijenta je bila 18-65 godina i svi su ispunjavali kriterije klasifikacije Američkog koledža za reumatologiju za SLE (2l, 22) i Međunarodnog društva za nefrologiju/renalnu patologiju (2003). Pacijenti su regrutovani sa Medicinskog fakulteta Univerziteta Zhejiang i Medicinskog fakulteta Univerziteta Nanjing koji su imali proteinuriju (veću ili jednaku 1,5 g/d) i koncentraciju kreatinina u serumu manju ili jednaku 265,2 umol/L. Kriterijumi isključenja uključivali su: pacijent je prethodno bio liječen visokim dozama metilprednizolona; biološki lijekovi (usmjereni na specifične patogene molekule) ili kombinirana terapija; trenutna plazmafereza ili liječenje intravenskim globulinom unutar 12 sedmica od skrininga; abnormalne funkcije jetre; trenutne aktivne infekcije; i maligni tumor unutar 4 sedmice od početka studije. LN (lupusnefritis) pacijenti su primali pulsnu terapiju metilprednizolonom tokom 3 dana u dozi od 0,5 g/d. Kada je završena pulsna terapija metilprednizolonom, kombinovana grupa sa prednizonom (0,6 mg/kg/d), MMF (0,5 g, dvije doze/d) i takrolimusom (2 mg, dvije doze/d) davane su ukupno 4 sedmice. Zatim su doze prednizona, koje su i dalje bile u kombinaciji sa MMF (0.5 g, dvije doze/d) i takrolimusom (2 mg, dvije doze/d), smanjene za 5 mg/d svake 2 sedmice do postignuta je doza održavanja od 10 mg/d(4). Potpuna remisija (CR) je uzeta kao 24-h koncentracija proteina u urinu manja ili jednaka 0,4 g, odsustvo aktivnih sedimenata urina, koncentracija albumina u serumu veća ili jednaka 35 g/L i normalan kreatinin (23). Djelomična remisija (PR) je uzeta kao smanjenje koncentracije proteina u urinu za više od ili jednako 50 posto na manje od ili jednako 3,5 g, koncentracija albumina u serumu veća ili jednaka 30 g/ L, i normalno ili manje ili jednako 25 posto povećanja koncentracije kreatinina u serumu u odnosu na početnu vrijednost. Naš institucionalni odbor za reviziju odobrio je studiju (br. IIT20200410A) i svi pacijenti su dali pismeni pristanak prije upisa.

Životinjski modeli

Ženke MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) miševa isporučene su od SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Šangaj, Kina), svi miševi su nasumično podijeljeni uz pomoć generatora slučajnih brojeva, po 5 miševa u svakoj grupi i svakom kavezu . Liječeni su u dobi od 8 sedmica oralno, kombinacijom 0.5 mg/kg takrolimusa (MCE HY-13756), 50 mg/kg MMF(MCE HY-B0199) i 1 mg/ kg prednizona (MCE HY-B0214) ili nosača dnevno tokom ukupno 8 sedmica kao što je prethodno opisano(6). Ac-FLTD-CMK je sintetizovan pomoću MCE i 10 mg/kg je ubrizgano ip dnevno. Svi tretmani su bili slijepi za učesnike odgovorne za sljedeću detekciju. Odnos albumina i kreatinina u urinu (UACR) određen je korištenjem Albuwell M i Creatinine Companion (Excell, Phil, US). Uzorci bubrega su fiksirani u 4 posto paraformaldehida prije histološkog i imunohistokemijskog bojenja i ekstrahovani korteks bubrega za analizu imunoblotinga. Korištenje miševa je odobrio naš Institucionalni komitet za njegu i korištenje životinja (br..2019-883).

Izolacija glomerula miševa i kultura podocita

Glomeruli su pročišćeni iz bubrega 12-nedeljnih ženki C57 i MRL/LPR miševa kao što je opisano ranije(24). Anestezirani miševi su perfuzirani sa 37 stepeni C prethodno zagrijanim magnetnim perlicama. Bubrezi su uklonjeni i usitnjeni na ledu na 1 mm³. Zatim su bubrežna tkiva digestirana na 37 stepeni sa 1 mg/ml kolagenaze i 100 U/ml DNaze I tokom 30 minuta, a zatim dva puta filtrirana sa 100- μm Falcon cell cjedila (431752, BD). Nakon nekoliko ispiranja sa 4 stepena rastvora HBSS (H1025, Solarbio) i laganog centrifugiranja na 200 g tokom 5 minuta, glomeruli koji sadrže kuglice su sakupljeni pomoću magnetnog postolja (HY-K0200, MCE) i isprani rastvorom HBSS tri puta. Izolovani glomeruli su kultivisani na posudama obloženim kolagenom tipa I (C3867, Sigma-Aldrich) u 5% CO, na 37 stepeni prema metodi koju je opisao Jeffrey (25). Podociti pasaža 2 korišteni su u in vitro eksperimentu.PiroptozaIndukcija, citotoksičnost i detekcija sekrecije IL-1

Podociti iz MRL/LPR miševa su prajmirani sa 1 mg/ml LPS (tell-pb5lps, In InvivoGen) rastvorenim u Opti-MEM tokom 4 sata, a zatim je usledila stimulacija 5mM ATP(tlrlatpl, In Vivo gen). Podociti iz C57 miševa su odvojeni kao normalna kontrola. Monoterapije, takrolimus (10 μM), MMF (luM) i prednizon (10 μM) ili kombinovana terapija je prethodno inkubirana sa ćelijama 1 h prije LPS prajminga. Citotoksičnost nakon stimulacije određena je korištenjem kompleta za detekciju citotoksičnosti (11644793001, Roche) prema uputama proizvođača. Supernatant nakon stimulacije je sakupljen i mjeren korištenjem IL-1 mišjeg ELISA kompleta (BMS6002, Invitrogen) prema uputstvima proizvođača.

Antitijela i reagensi

Nivoi kaspaze-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) su procijenjeni prema uputstvima proizvođača.Piroptozau perifernoj krvi je mjerena pomoću FAM FLICAMCaspase-1 kompleta (Bio-Rad, SAD) protočnom citometrijom.

Statistička analiza

Statističke analize su obavljene korištenjem GraphPad Prism (verz. 8.0) i podaci su dati kao srednje vrijednosti ± SD. Urađena su dva grupna poređenja koristeći Studentov t-test i korelacione analize koristeći Pearsonovu korelaciju. Dvostrani p<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tretman zapiroptoza ulupus nefritis (LN)

REZULTATI

GSDMD-posredovanoPiroptozaAktivira se u bubrezima zahvaćenim LN (lupusnefritis)

Da bi se istražilo da li je GSDMD doprinio patogenezi LN (lupusnefritis), prvo smo testirali nivo ekspresije proteina GSDMD u uzorcima bubrega uzetim iz LN (lupusnefritis) pacijenti. Imunohistohemijska analiza otkrila je značajno povećan nivo ekspresije GSDMD u uzorcima biopsije bubrega uzetim iz LN (lupusnefritis) pacijenti sa tipom IV, V, I plus Vand IV plus V, u poređenju sa zdravim ispitanicima. GSDMD je bio univerzalno izražen u glomerularnim podocitima, tubularnim stanicama i infiltriranim intersticijskim stanicama u LN (lupusnefritis) pacijenti. Područje sa pozitivnim (crvene strelice) i negativnim bojenjem (crne strelice) je povećano (slika 1A). Zatim je procijenjen postotak GSDMD-pozitivnog područja u bubregu (Slika 1B). Slični rezultati pronađeni su u bubrezima MRL/LPR miševa i kontrola divljeg tipa. Imunobloting analiza potvrdila je značajno povećanu ekspresiju i cijepanje GSDMD u uzorcima bubrega MRL/LPR miševa (Slika 1C). GSDMD u glomerularnim podocitima, tubularnim ćelijama i infiltriranim intersticijskim ćelijama bio je povišen kod MRL/LPR miševa u poređenju sa kontrolnim miševima (Slika 1D). Ovi podaci sugeriraju da je GSDMD posredovan u bubrežnom tkivu zahvaćenom LN (lupusnefritis).

SLIKA 1|GSDMD je snažno povišen i cijepan u bubrezima pacijenata i miševa zahvaćenih LN (lupus nefritis).

(A) Imunohemijsko bojenje GSDMD u uzorcima bubrega uzetim od zdravih subjekata i LN (lupusnefritis) pacijenata, pozitivno (crvene strelice) i negativno bojenje (crne strelice) su uvećane.

(B) Kvantifikacija GSDMD pozitivnih područja prikazana je u tipu III plus V, IV, IV plus V, V LN (lupusnefritis) pacijenti i zdravi subjekti.

(C) Imunoblot analiza pune dužine, cijepanog N-terminalnog domena i C-terminalnog domena GSDMD u korteksu bubrega od tri para kontrolnih i MRL/LPR miševa.

(D) Imunohemijsko bojenje GSDMD u uzorcima bubrega uzetim od kontrolnih i MRL/LPR miševa.

*p < {{0}}.05,="" **p="">< 0.01.="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; FL, puna dužina; NT, N-terminalni domen; CT, C-terminalni domen.

Kombinirani tretman potiskuje GSDMD-posredovanoPiroptozaAktivacija u primarnim podocitima in vitro

Istražiti inhibitorne efekte kombinovane terapije napiroptoza, primijenili smo metodu LPS plus ATP stimulacije za indukcijupiroptozau podocitima MRL/LPR miševa, uzimajući podocite divljeg tipa C57 miševa kao normalnu kontrolu. Podociti iz MRLlpr miševa su pripremljeni 4 h LPS-om i zatim 4 h tretirani ATP-om, često korištenim stimulusom za GSDMD posredovanpiroptozaaktivacija(26). U poređenju sa normalnom kontrolom, podociti su nakon toga pokazali piroptotičke morfološke karakteristike kao što su oticanje ćelija i bubrenje. Prethodno liječenje kombinovanom terapijom značajno je poboljšalo piroptotičke morfološke karakteristike i citotoksičnost (slika 2A). LPS plus ATP indukovana citotoksičnost podocita. Uporedivo, kombinovana terapija je značajno smanjila citotoksičnost i sekreciju IL-1 u supernatantu izazvanu LPS plus ATP stimulacijom (Slike 2B, C). Da bi dalje provjerili aktivaciju GSDMD posredovanepiroptoza, analizirali smo kanonske inflamasome i aktivaciju GSDMD pomoću imunoblotinga. U skladu sa piroptotičkim morfološkim promjenama i citotoksičnošću, LPS plus ATP značajno je aktivirao NLRP3, kaspazu-1 i cijepao GSDMD u podocitima (Slika 2D). Kombinirano liječenje je značajno potisnulo aktivaciju NLRP3 i kaspaze-1 i smanjilo nivo GSDMD N-terminala. Posebno, monoterapije sa takrolimusom, MMF-om ili prednizonom suprimirale su LPS plus ATP stimulirale ćelijsku citotoksičnost i lučenje L-1, ali je kombinovana terapija pokazala značajniji inhibitorni efekat na kaspazu-1 i GSDMD. Ovi rezultati su pružili dokaze koji podržavaju stav da je kombinovano liječenje poboljšalo GSDMD posredovanopiroptozapotiskivanjem aktivacije NLRP3 i kaspaze-1.

SLIKA 2|Kombinirano liječenje poboljšava piroptozu u podocitima in vitro.

(A) Piroptotičke karakteristike su bile prikazane u kultivisanim primarnim podocitima nakon inkubacije sa LPS plus ATP i prethodno tretiranih kombinovanim tretmanom. Strelice su pokazivale ćelije koje pokazuju piroptotičke karakteristike.

(B) Supernatanti iz izazvanih ćelija su analizirani na smrt ćelije, mjereno lučenjem LDH.

(C) Supernatanti iz izazvanih ćelija su analizirani na oslobađanje IL-1b.

(D) Imunobloting analiza NLRP3, kaspaze-1, GSDMD-NT i ASC ekspresije nakon takrolimusa, MMF-a, prednizona ili kombinovanog tretmana nakon aktivacije inflamasoma NLRP3.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0,001;="" ****p="">< 0,0001.="" ldh,="" laktat="">

DSMO, dimetil sulfoksid, FK506, takrolimus; MMF, mikofenolat mofetil; PNS, prednizon; COM, kombinovana terapija; ASC, protein u obliku tačkice povezan sa apoptozom.

Kombinirani tretman potisnut kaspazom-1/GSDMD-induciranPiroptozau MRL/LPR miševima

Osmonedeljni MRL/LPR miševi dobili su kombinaciju MMF, takrolimusa i prednizona ili kontrole vehikuluma. U skladu sa prethodnom studijom (6), nakon tretmana u trajanju od 8 sedmica, nije pronađena razlika u mortalitetu ili tjelesnoj težini između terapijskih grupa i grupa kombiniranog liječenja. Za razliku od grupe koja je primala vehikulum, kombinovana terapija je bila vrlo efikasna u prevenciji proteinurije, glomeruloskleroze i infiltracije bubrežnih intersticijalnih imunih ćelija (dopunska slika 1).

Zatim smo ispitali nivoe ekspresije kaspaze-1 i GSDMD u kombinovanoj terapiji i kontrolnim grupama vehikuluma. Imunohistohemijska analiza je otkrila da je glomerularna i renalna intersticijska kaspaza-1 i ekspresija GSDMD značajno smanjena u grupi koja je primala kombinovanu terapiju (slika 3A). Imunobloting analiza je također otkrila smanjenu ekspresiju i cijepanje kaspaze-1 i GSDMD u korteksu bubrega grupe za kombinovano liječenje (Slika 3B). Štaviše, dvostruko pozitivne ćelije kaspaze-1/propidijum jodida (PI) su izbrojane pomoću protočne citometrije ipiroptozaFAM Caspase{0}}komplet. Rezultati su otkrili značajno smanjenje broja ćelija periferne krvi kaspaze-1*/PI' kod MRL/LPR miševa koji su primili kombinovani tretman u poređenju sa MRL/LPR miševima tretiranim vehikulom. (Slike 3C,D). Pored toga, kombinovani tretman je takođe značajno smanjio koncentraciju Ii u serumu (Slika 3E). Stoga smo zaključili da kombinovano liječenje potiskuje kaspazu-1/GSDMD-indukovanupiroptozau bubrezima i krvnim ćelijama LN (lupusnefritis) miševi.

SLIKA 3|Kombinirani tretman oslabio je piroptozu posredovanu kaspazom-1/GSDMD kod MRL/LPR miševa.

(A) Imunohemijsko bojenje GSDMD i kaspaze-1 u MRL/LPR uzorcima bubrega miševa. U poređenju sa kontrolom vehikuluma, ekspresija kaspaze-1 i GSDMD su bile značajno inhibirane u grupi sa kombinovanim tretmanom.

(B) Imunoblot analiza pune dužine i cijepanje GSDMD i kaspaze-1 u uzorcima korteksa bubrega MRL/LPR miševa; poređenje rezultata iz vehikuluma i kombinovanog tretmana.

(C) FACS dvostruko pozitivnih ćelija kaspaze-1/PI u perifernoj krvi MRL/LPR miševa koji su primili ili nisu primili kombinirano liječenje.

(D) Kvantifikacija kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih ćelija u perifernoj krvi MRL/LPR miševa koji su primili ili ne primili kombiniranu terapiju.

(E) Kvantifikacija serumskih koncentracija IL{{0}}b kod MRL/LPR miševa koji su primili ili nisu primili kombinovani tretman. ####P < 0,0001.="" facs,="" fluorescentno="" aktivirano="" sortiranje="" ćelija;="" ct,="" kombinovana="">

Kombinovana terapija potisnuta kaspazom-1/GSDMD-induciranomPiroptozau LN (lupusnefritis) Pacijenti

U periodu od januara 2020. do juna 2020., 47 pacijenata sa LN (lupusnefritis) su bili upisani i 43 završene 24-sedmice kombinovane terapije. Osnovna bolest i demografija upisane kohorte su navedeni u Dodatnoj tabeli 1. Kvantifikacija kaspaze-1/propidijum jodida (PI dvostruko pozitivne ćelije sprovedene su kod pacijenata sa LN (lupusnefritis) tip III, IV, V, III plus V, IV plus V i kod zdravih kontrola koristeći apiroptozaFAM Caspase-1 komplet i protočna citometrija. U poređenju sa zdravim kontrolama, povećan je broj dvostruko pozitivnih ćelija kaspaze-1/PI u perifernoj krvi (Slike 4A, B). Također smo ispitali kaspazu-1/PI dvostruko pozitivne ćelije nakon 24-nedjelja terapije i na početku. Nakon 24-nedjelje indukcione terapije, incidencija CR i PR bila je 39,5 posto (17/43) i 32,6 posto (14/43), respektivno. Broj dvostruko pozitivnih ćelija kaspaze-1/PI u perifernoj krvi pacijenata sa CR i PR je značajno smanjen u poređenju sa početnom linijom (Slika 4C). Također smo identificirali korelaciju između indukovane kaspazom{19}}piroptozai SLEDA; podaci su jasno pokazali da je pozitivni omjer kaspaze-1/PI u perifernoj krvi bio u pozitivnoj korelaciji sa SLEDAI (slika 4D). Ac-FLTD-CMK, GSDMD-izveden inhibitor, spriječio je razvoj LN (lupusnefritis).

SLIKA 4|Kombinovana terapija je oslabila piroptozu posredovanu kaspazom-1- kod pacijenata sa LN (lupus nefritis).

(A) FACS kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih ćelija u perifernoj krvi LN (lupusnefritis) pacijenti liječeni sa ili bez kombinirane terapije.

(B) Kvantifikacija kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih ćelija u perifernoj krvi tipa III, IV, V, III plus V i IV plus V LN (lupusnefritis) pacijenti i zdravi subjekti.

(C) Kvantifikacija kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih ćelija u perifernoj krvi LN (lupusnefritis) pacijenti na početku, CR, PR i bez remisije nakon kombinovane terapije.

(D) Analiza korelacije omjera dvostruko pozitivnih ćelija kaspaza-1/PI sa SLE-DAI.

**p < 0.01.="" facs,="" fluorescentno="" aktivirano="" sortiranje="" ćelija;="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; CR, potpuna remisija; PR, djelomična remisija; SLE-DAI, indeks aktivnosti bolesti sistemskog eritematoznog lupusa.

Nedavna studija je otkrila da su GSDMDhmice razvili povećano odlaganje C3 i IgG u bubrezima, težu ozljedu bubrega i povećanu smrtnost u modelu SLE izazvanog imikvimodom.17 Da bi se dodatno razjasnila uloga GSDMD u LN (lupusnefritis), MRL/LPR miševi su tretirani Ac-FLTD-CMK21 počevši od 8-nedjelje, sa vehikulumom kao kontrolom. Nakon 8-nedjelje tretmana, nije pronađena razlika u mortalitetu ili tjelesnoj težini između te grupe i grupe tretirane Ac-FLTD-CMK. U poređenju sa miševima kontrole nosača, miševi MRL/LPR tretirani Ac-FLTD-CMK imali su niži omjer albumin-kreatinina u urinu (slika 5A), nižu koncentraciju kreatinina u serumu (slika 5B), smanjenu glomerulosklerozu (slika 5C) i CD3 , CD4 i CD68 pozitivna ćelijska infiltracija (slika 5D). Imunohistohemijski rezultati su pokazali smanjenu ekspresiju GSDMD (slika 5D) i potisnutu serumsku sekreciju IL-1 utvrđenu ELISA testom (slika 5E). Zbirno, podaci sugeriraju da Ac-FLTD-CMK inhibirapiroptozau bubrezima zahvaćenim LN (lupusnefritis).

SLIKA 5|Ac-FLTD-CMK, inhibitor GSDMD, spriječio je razvoj LN (lupus nefritis).

(A) Odnos albumina i kreatinina u urinu izračunat je kod MRL/LPR miševa koji su primili ili nisu dobili GSDMD inhibitor.

(B) Kreatinin u serumu kod MRL/LPR miševa kojima je dat ili nije dat GSDMD inhibitor.

(C) Reprezentativne slike uzoraka bubrega obojenih periodičnom kiselinom-Schiffom (PAS) i kvantifikacija procenta glomeruloskleroze.

(D) Imunohemijsko bojenje CD3, CD4, F4/80 i GSDMD. (E) Kvantifikacija serumskih koncentracija IL-1b kod MRL/LPR miševa koji su primili ili ne primili GSDMD inhibitor.

Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

DISKUSIJA

Kombinovana terapija je obećavajuća strategija zbog veće CR i ukupne stope odgovora, kraćeg vremena do remisije i manje nuspojava. Do sada, osnovni molekularni mehanizmi kombinovane terapije nisu bili poznati. Nedavno su Fu i saradnici (6) tretirali MRL/LPR miševe monoterapijom ili kombinovanom terapijom i izvršili sveobuhvatnu transkriptomsku analizu na cijelim bubrezima. Zanimljivo je da su otkrili da kombinovana terapija, ali ne i monoterapije, specifično i jedinstveno potiskuju ekspresiju kaspaze-1.

Inflamasom NLRP3/ASC/caspase-1 sada je prepoznat kao ključni faktor koji doprinosi patogenezi LN (lupusnefritis). NLRP3 inflamazomi u podocitima se aktiviraju kod miševa sklonih lupusu, kao i kod pacijenata sa LN (lupusnefritis). Kada su inflamazomi NLRP3 suprimirani inhibitorom kaspaze-1, pronađeno je da su proteinurija, histološke lezije bubrega i brisanje podocitnog stopala poboljšani kod miševa sklonih lupusu(8). Huang et al. (27) su izvijestili da je NLRP3 eksprimiran u tubularnim ćelijama LN (lupusnefritis) klase IV i da je aktivacija NLRP3 bila u pozitivnoj korelaciji sa indeksom aktivnosti kod pacijenata sa LN. Dokazano je da kaspaza-1 igra vitalnu ulogu u lupusu i vaskularnoj disfunkciji, te je stoga potencijalna meta za nove terapijske intervencije(28). Novi eksperimentalni lijekovi kao što su RIP3(29), antagonisti receptora P2X7(30), inhibitori GSK-3 (31) i agonist Nrf2 (32) inhibirali su razvoj LN (lupusnefritis) kod MRL/LPR miševa modulacijom aktivnosti inflamasoma NLRP3/ASC/caspase-1, što naglašava važnost i kritičnost inflamasoma NLRP3/ASC/caspase-1 u LN. Povišene koncentracije IL-18 u serumu su u korelaciji sa težinom bolesti i stepenom oštećenja/zahvaćenosti bubrega kod pacijenata sa SLE(33). Koliko nam je poznato, čini se da bi porodica gasdermina mogla biti ključna za razvojpiroptoza, ali postoji malo dokaza o prisutnosti GSDMD/GSDME kod pacijenata sa SLE.

Sve u svemu, ispitali smo aktivaciju i ekspresiju GSDMD u uzorcima biopsije bubrega uzetim iz LN (lupusnefritis) pacijenata i MRL/LPR miševa. GSDMD je snažno induciran i cijepan u glomerularnim podocitima i tubularnim stanicama i infiltriranim intersticijskim stanicama. Nakon toga, MRL/LPR miševima je data kombinacija MMF, takrolimusa i prednizona ili vehikuluma. U poređenju sa kontrolnom grupom sa vehikulumom, aktivacija kaspaze-1 i GSDMD je smanjena u grupi sa kombinovanim tretmanom. Stepenpiroptozau perifernoj krvi je također bio mnogo niži u LN (lupusnefritis) pacijenti nakon primjene kombinovane terapije. Štaviše,piroptozau perifernoj krvi bila je u pozitivnoj korelaciji sa SLEDAI, što sugerira dapiroptozau perifernoj krvi može djelovati kao značajan marker za aktivnost SLE. Stoga smo pretpostavili da bi kombinovana terapija mogla dati korisne efekte u LN (lupusnefritis) inhibicijompiroptozainducirano kaspazom-1/GSDMD. Prethodne studije kristalne strukture kaspaze-1 u kompleksu sa Ac-FLTD-CMK otkrile su mnoge interakcije enzim-inhibitor koje su spriječile prepoznavanje GSDMD od strane kaspaze-1. Međutim, otkrili smo da Ac-FLTD-CMK, koji djeluje kao inhibitor GSDMD, inhibirapiroptozau LN (lupusnefritis), što može biti izazvano drugačijim mehanizmom.

Nedavno, u TLR7-indukovanom mišjem modelu SLE(34), GSDMD-/-miševi su razvili veći stepen oštećenja bubrega i povećali mortalitet, što je u početku sugerisalo da bi delecija GSDMD imala zaštitni efekat i bila povezana sa sistemska upala i proizvodnja autoantitijela s povezanim povećanim mortalitetom. Miševi s nedostatkom GSDMD razvijaju izraženije taloženje glomerularnog imunološkog kompleksa u uzorcima bubrega i veću proteinuriju u usporedbi s miševima divljeg tipa. Pojačano izlučivanje ekstracelularnog HMGB1 je također pronađeno u GSDMD-/limfocitima što sugerira da nekroza/piroptozadogodio kada je GSDMD bio odsutan.

Caspase-1 okidačipiroptozaGSDMD cijepanjem. Nasuprot tome, u GSDMD-deficijentnim ili GSDMD-niskim ćelijama, kaspaza-1 pokreće apoptozu, a zatim GSDME zavisnu sekundarnu nekrozu ipiroptoza. Kada aktivnost GSDMD izostane nakon terapije, GSDME bi možda mogao prebaciti apoptozu posredovanu kaspazom-3- napiroptoza(35,36). Osim toga, aktivacija kaspaze-8 je bila znatno pojačana u makrofagima koji su imali GSDMD deficit. Značajna aktivacija kaspaze-8 je također pronađena u TLR7-induciranom GSDMD-deficijentnom LN (lupusnefritis) miševi (34). Dakle, u odsustvu GSDMD-a, vjerovatno je da kaspaza-1 sarađuje sa kaspazom-8 da izazove apoptozu posredovanu kaspazom-3-GSDME-om da se prebaci napiroptozau LN (lupusnefritis), hipoteza koja zahtijeva dalje eksperimentalno istraživanje.

Postoji nekoliko ograničenja u trenutnoj studiji. Prvo, na osnovu trenutnih podataka, potvrdili smo da kombinovana terapija može suzbitipiroptoza, ali drugi tretmani kao što je dvostruka terapija steroidima i MMF-om, steroidima i takrolimusa, ili anti-CD20 antitijela također mogu imati uporedive efekte. Drugo, tačan molekularni mehanizam inhibicionog efekta kombinovane terapije na kaspazu-1 nije dobro istražen. Na kraju, ali ne i najmanje važno, uočavamo odnos kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih ćelija u perifernoj krvi sa SLE-DAI i promjenu prije i nakon tretmana kombinovanom terapijom u retrospektivnom LN (lupusnefritis) kohorta pacijenata. Kliničku prediktivnu vrijednost kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih ćelija za aktivnost bolesti i odgovor na liječenje treba dalje istražiti u većoj prospektivnoj kohorti.

Sve u svemu, utvrdili smo da je kombinovana terapija dala svoje korisne efekte potiskivanjem kaspaze-1/GSDMD-apiroptozau LN (lupusnefritis), koji je pružio novi uvid u uključene ćelijske mehanizme. Zaista, kombinovana terapija je posebno i jedinstveno potisnula ekspresiju kaspaze-1. Farmakološka ili genetska inhibicija NLRP3 i kaspaze-1 poboljšala je funkciju bubrega i potisnula autoimunost u LN (lupusnefritis). Patofiziološka uloga kaspaze-1 u LN (lupusnefritis) je vrijedan daljnjeg proučavanja i terapije usmjerene na GSDMD kod pacijenata sa LN (lupusnefritis) treba vrlo pažljivo procijeniti.

Metoda liječenja zapiroptoza

REFERENCE

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.LupusNefritis: Current Update.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Individualizirajuća terapija uLupusNefritis. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS.Uspješno liječenje klase V plus IVLupusNefritisSa višeciljnom terapijom. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al. Multitargetska terapija za indukcijski tretmanLupusNefritis: Randomizirano ispitivanje, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al. Multitarget terapija za tretman održavanjaLupusNefritis. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. Transkriptomska analiza otkriva nove sinergističke mehanizme u kombinovanoj terapiji zaLupusNefritis. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.LupusNefritis: NLRP3 inflamazom zapaljuje disfunkciju podocita. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9