Profil transkriptoma i lipidoma ljudskih mezenhimalnih matičnih ćelija sa smanjenim starenjem i povećanom sposobnošću diferencijacije trilinea nakon liječenja lijekovima

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

SAŽETAK

Ljudske mezenhimalne matične ćelije (hMSC) su multi-potencijalne ćelije koje se široko koriste u ćelijskoj terapiji. Međutim, često pojavljivanje starenja i smanjenje sposobnosti diferencijacije ograničilo je široku primjenu MSC-a. Nekoliko strategija kao što je tretman malim molekulima je široko proučavano i korišteno za poboljšanje karakteristika stabljike zaobilaženjem starenja, ali tačni mehanizmi za smanjenje starenja nisu u potpunosti proučavani. U ovoj studiji, hMSC su tretirani rapamicinom, oltiprazom, metforminom i vitaminom C u naznačenom vremenu i ove ćelije su podvrgnute evaluaciji starenja i trilinijskoj diferencijaciji. Nadalje, skupovi podataka o transkriptomiji i lipidomici hMSC nakon liječenja lijekovima analizirani su kako bi se protumačili biološki putevi odgovorni za njihove efekte protiv starenja. Iako su četiri lijeka pokazala značajnu aktivnost u promicanju osteogene diferencijacije MSC-a, metformin je optimalan lijek za promicanje trilinijske diferencijacije. GO termini su ilustrovali da su efekti lijekova protiv starenja uglavnom povezani sa ćelijskim starenjem, procesima mitoze i mejoze. Biosinteza fosfatidilholina (PC) i fosfatidiletanolamina (PE) je inhibirana dok je aktivirana proizvodnja fosfatidilinozitola (PI) i zasićenih masnih kiselina (SFA)/mono-nezasićene masne kiseline (MUFA). Masne kiseline bez srednje količine (FFA) povećane su u hMSC s različitim fenotipovima protiv starenja. Stoga smo uspostavili sveobuhvatnu metodu za procjenu intervencije lijeka na osnovu rezultata transkriptomike i lipidomike. Metoda se može koristiti za proučavanje različitih bioloških fenotipova nakon intervencije lijeka u MSC što će proširiti kliničku primjenu hMSC-a.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

UVOD

Starenje, proces ovisan o vremenu, će uzrokovati fiziološku disfunkciju. Starenje je primarni faktor rizika za mnoge bolesti, uključujući rak, neurodegenerativne bolesti i dijabetes. Iscrpljenost matičnih ćelija i ćelijsko starenje su jedan od obeležja koji određuju fiziološki fenotip tokom starenja [1]. Ljudske mezenhimske matične ćelije (hMSC) su multi-potencijalne ćelije predstavljene u koštanoj srži, masnom tkivu, posteljici, pupčanoj vrpci, mišićima i mnogim drugim tkivima [2-6]. U medijumu specifičnom za lozu, hMSC se mogu podvrgnuti diferencijaciji u adipocite, osteoblaste i hondrocite, kao i druge ćelijske loze in vitro. Stoga hMSC igraju važnu ulogu u regenerativnoj medicini i ćelijskoj terapiji. Međutim, klinička upotreba MSC ograničena je starenjem tokom duže kulture in vitro. Starenje hMSC-a obično je bilo povezano s promjenom dužine telomera, gustine ćelije, potencijala proliferacije, potencijala diferencijacije tiline, epigenetike, mitohondrijalne funkcije i sekretoma [7]. Stoga, prevazilaženje starenja MSC-a zahtijeva dublje studije kako bi se istražile strategije za inhibiciju starenja hMSC-a. Metformin (TAME) je prvi lijek koji je odobren u kliničkom ispitivanju za odlaganje starenja [8], a također je i lijek prve linije koji je odobrila FDA za liječenje dijabetes melitusa tipa e 2 [9].cistanchSmatra se da je agonizirajući put Nrf2 osnovni mehanizam za metformin koji posreduje u produžetku životnog vijeka [10]. Oltipraz, antišistosomski agens, također je korišten za inhibiciju progresije raka putem NRF2 puta u modelu glodara [11, 12]. Također je objavljeno da je oltipraz pokazao učinak protiv starenja potiskivanjem antioksidativnog NRF2 puta [13]. Osim toga, rapamicin (Sirolimus) se koristio za oblaganje koronarnih stentova, sprječavanje odbacivanja transplantata organa i liječenje limfangioleiomiomatoze [14]. Prijavljeno je da rapamicin može inhibirati aktivaciju T ćelija i B ćelija putem inhibicije mTOR [15], što je dalje potvrđeno pogoršanjem nedostatka matičnih ćelija [16]. Vitamin C je dobro poznati reduktor i za koji se navodi da ublažava starenje u modelu matičnih ćelija sa Wernerovim sindromom[17]. Međutim, ostaje nejasno da li su dijelili slične puteve za vršenje svoje uloge u borbi protiv starenja i specifične mehanizme za suzbijanje ćelijskog starenja kod ljudi. Nadalje, transkriptom i lipidom za ove MSC tretirane sa četiri lijeka nisu u potpunosti istraženi, što nas je podstaklo da izvedemo dolje navedene eksperimente kako bismo odgovorili na ova važna pitanja.

Cistanche može protiv starenja

U ovoj studiji, metformin, oltipraz, rapamicin i vitamin C korišteni su za liječenje hMSC-a koštane srži (BM-hMSC). Prvo, fenotipovi diferencijacije hMSC-a nakon tretmana su okarakterisani kako bi se ilustrovao njihov potencijal protiv starenja. Transkriptomska i lipidomička analiza izvršena je na stanicama tretiranim lijekom. Nakon toga je provedena GO analiza zasnovana na skupu podataka transkriptomike kako bi se usidrili signalni događaji odgovorni za starenje i aktivnosti protiv starenja. Sprovedeno je metaboličko profilisanje i analiza puteva koji ilustruju fluktuaciju proizvodnje lipida tokom terapije lekovima. Sve u svemu, uspostavili smo sveobuhvatni sistem evaluacije intervencije lijekova na starenje hMSC-a. Sistem se može koristiti za proučavanje različitih bioloških fenotipova nakon intervencije lijeka u MSC što će proširiti kliničku primjenu hMSC-a.

REZULTATI

BM-hMSC podliježe starenju nakon dugog vremena kulture in vitro

BM-hMSC su multipotentne matične ćelije sa zajedničkim karakteristikama samoobnavljanja i diferencijacije u različite tipove ćelija. Međutim, sa povećanjem prolaznosti in vitro, ćelije su postepeno podložne starenju i izgubiće većinu svojih sposobnosti diferencijacije. Status BM-hMSC je analiziran na različitim pasusima (P2, P8, P13) i stanje ćelije se pogoršavalo, što je dokazano usporavanjem ćelijske proliferacije, povećanjem smrti i produžavanjem morfologije (Slika 1A). Nadalje, testirane su i sposobnosti diferencijacije trilojnica P8 BM-hMSC. Kao što je prikazano na slici 1B, u poređenju sa onim iz naših prethodnih studija [18], sposobnost diferencijacije P8 BM-a je smanjena, ali se i dalje može razlikovati na osteoblaste, adipocite i hondrocite u indukcijskom mediju.cistanche AustraliaPrema in vitro modelu starenja MSC-a kao što je objavljeno [18], dalje smo tretirali BM-hMSC sa četiri kandidata za lijekove s ciljem da intervenišu u starenju in vitro. Kao što je prikazano na slici iC, ćelije su postavljene u 24-ploču sa gustinom od 60 posto, a lijekovi su dodani ćelijama nakon 48 sati. Supernatant ćelija je sakupljen svaka tri dana sedam puta. 21. dan nakon droge

(Dopunska slika 1A). Oltipraz, rapamicin i vitamin C mogu efikasno poboljšati potencijal diferencijacije koji je bio direktno proporcionalan antagonizmu starenja (dodatna slika 1B). Zanimljivo je da je samo oltipraz pokazao pozitivan učinak na medij za diferencijaciju adipocita (dodatna slika 1C,1D).cistanche pogodnosti,Ukratko, oltipraz je najbolji lijek za poboljšanje sposobnosti trilinijske diferencijacije, rapamicin i vitamin C mogu učinkovito poboljšati potencijal osteogene i hondrogene diferencijacije, dok metformin pokazuje samo ograničen pozitivan učinak na osteogenu diferencijaciju.

Transkriptomski profil BM-hMSC-a tretiranih lijekovima S obzirom na to da bi sva četiri lijeka mogla suprotstaviti starenju BM-hMSC-a s različitom efikasnošću, zatim smo pokušali istražiti osnovne mehanizme za njihov poseban učinak istražujući transkriptomski profil BM-hMSC-a nakon liječenja lijekovima. . Izračunali smo fold-promjenu ekspresije gena između svakog para lijek-kontrola. Za svaki par lijek-kontrola, odabrani su različito eksprimirani geni (DEG) sa promjenom nabora iznad 2, koji sadrže i upregulirajuće i niže regulirane gene (dodatna tabela 1). Dobili smo ukupno 1758 gena nakon analize svih DEG-ova iz BM-hMSC-a tretiranih lijekovima (Slika 3A). Da bismo istražili funkcije DEG-ova, identificiramo pojmove obogaćene genske ontologije (GO) ("p<0.01) based="" on="" each="" drug's="" degs="" [19](supplementary="" table="" 2).="" these="" enriched="" go="" terms="" represent="" the="" functions="" influenced="" by="" the="" drugs.="" furthermore,="" we="" plot="" the="" venn="" diagram="" to="" study="" the="" similarity="" and="" specificity="" of="" the="" enriched="" go="" terms.="" as="" shown="" in="" figure="" 3b,="" although="" each="" drug="" has="" its="" unique="" regulated="" go="" terms,="" the="" drugs="" also="" share="" a="" common="" go="" which="" suggests="" that="" there="" are="" common="" functions="" influenced="" by="" all="" four="" drugs.="" these="" common="" go="" terms="" may="" associate="" with="" the="" effects="" of="" the="" drug="" on="" senescence="" alleviation="" and="" trilineage="" differentiation="">

Dvanaest zajedničkih GO pojmova dijelila su četiri lijeka (Slika 3B, 3D), od kojih su uglavnom obogaćeni negativnom regulacijom pokretljivosti stanica (Slika 3E), pozitivnom regulacijom organizacije strukture aktomiozina, regulacijom ćelijskog procesa i organizacije ćelijskih komponenti, organizacijom citoskeleta , katabolički proces makromolekula, regulacija ćelijske proliferacije, katabolički proces proteina i transdukcija signala posredovana malom GTPazom (Slike 3C, 3E). Ove funkcije su usko povezane sa ćelijskom sudbinom, posebno fenotipovima povezanim sa starenjem.

Nakon analize zajedničkih GO pojmova između metformina i oltipraza, otkrili smo da oni dijele istu funkciju kao i NRF2 agonisti. Kao što je prikazano na slici 3F, funkcija ćelijskog ciklusa, kataboličkog procesa makromolekula i organizacije nuklearnog omotača su poboljšane. Štaviše, funkcija za kretanje komponenti, migraciju/adheziju ćelija i odgovor na vitamin E/organsko ciklično jedinjenje/lipid je smanjena (slika 3G). Ovi rezultati sveukupno ukazuju da metformin i oltipraz mogu uticati na sposobnost diferencijacije ćelija, sudbinu ćelije i metabolizam ćelije. Kako je oltipraz najbolji lijek za poboljšanje sposobnosti diferencijacije trilojnica, dalje smo nastojali identificirati specifične puteve koje mijenja oltipraz. Zanimljivo je da su obogaćeni 85 GO termini uglavnom bili povezani sa ćelijskim starenjem, ćelijskim ciklusom, procesom mitoze i mejoze, ćelijskim odgovorom na lijekove, vitaminom, cAMP, stimulansom oštećenja DNK, nutritivnim i osmotskim stresom (dodatna slika 2A, 2B). Lipidomički profil BM-hMSC-a tretiranih lijekovima Da bi se istražila globalna fluktuacija lipida u pogledu osteogene diferencijacije BM-hMSC-a nakon liječenja lijekovima, sprovedena je analiza profila lipidomika zasnovana na LC-MS. Ukupno 139 vrsta lipida je identificirano u ćelijskom lipidomu, uključujući lizofosfatidiletanolamine (LPE), 21 PE, 4 PE-Os, 4 fosfatidilinozitola (PI), 5 fosfatidilserina (PS), 8 ceramida (Cer), 4 Cerys, 11 sfingomijelina (SM), 6 diacilglicerida (D) 8 TG) i 20 slobodnih masnih kiselina (FFA) (Slika 4A-4M). Prema materiji grupiranja, ćelije tretirane oltiprazom pokazale su najveće varijacije lipida, što je bilo u skladu sa njegovim najboljim učinkom na ublažavanje starenja ćelija i poboljšanje diferencijacije trilinijskih linija. Detaljnije, monofosfatidilgliceroli LPC su bili povećani u grupi koja je primala oltipraz u poređenju sa kontrolnom, dok su njihovi analogni PC i PE bili smanjeni (Slika 4B, 4D, 4E). Nivoi PI i SFA su takođe povišeni, dok je nivo Ceres i MUFA smanjen (Slika 4F, 4L, 4H, 4M). Ovi rezultati

Analiza puteva zasnovana na lipidomici i transkriptomiji kod hMSC-a liječenih lijekovima

Da bi se dalje istražili osnovni mehanizmi za poboljšanje trilinijske diferencijacije pomoću oltipraza, izvršena je analiza puta na osnovu lipidomskih i transkriptomskih skupova podataka. Kao što je prikazano na slici 5A, CDP-diacilglicerol sintaza 1 (CDS1) je bio jedini enzim koji je bio pojačano reguliran u stanicama tretiranim oltiprazom, što bi mogao biti razlog za povećanje PI i smanjenje PC-ja. Međutim, nisko regulirana lecitin kolesterol acil transferaza (LCAT) i nepromijenjena lizofosfatidilholin aciltransferaza3 (LPCAT3) nisu bile u skladu s povećanim LPC, što sugerira da se prekomjerno proizvedeni LPC možda neće sintetizirati iz PC/Pes (Slika 5A). Zanimljivo je da se očigledna konverzija može uočiti između SFA i MUFA (Slika 5B). Povećanje zasićenih masnih kiselina (SFA) i smanjenje MUFA može biti rezultat smanjene regulacije stearoil-CoA desaturaze (SCD). Ovaj raspored ima tendenciju da otkrije mehanizam za smanjenu aktivnost lipogeneze nakon tretmana oltiprazom. Iako bi tretman oltiprazom mogao smanjiti proizvodnju Ceresa, konverzije posredovane automobilima nisu značajno izmijenjene (slika 5C).

Globalni profili vrsta lipida u supernatantu hMSC-a nakon liječenja lijekovima

Nadalje, okarakterisane su lipidomske promjene u mediju kako bi se temeljno istražio utjecaj lijekova na hMSC. Kao što je prikazano u Dodatnoj tabeli 3, klasterska analiza je pokazala da su lipidi klasifikovani u dva klastera, tj. većina FFA i drugih lipida (ne-FFA).cistanche holesterolKao što je prikazano na slici 6, u četiri grupe, FFA su pokazale očigledne promjene u različitim periodima tretmana. Nasuprot tome, ne-FFA su pokazali blage fluktuacije u četiri grupe (Slika 6A-6D). FFA su bile značajno povišene u ranim fazama u svim grupama (Slika 6E-6H).nuspojave cistanche deserticolaŠtaviše, FFA u ćelijama inducirane metforminom (slika 6E), oltiprazom i vitaminom C brzo su se povećale od 2. vremenske tačke do 3. vremenske tačke. Međutim, u ćelijama tretiranim rapamicinom, FFA su bile povišene sa liste na 2. vremensku tačku (slika 6F-6H). Zanimljivo je da su FFA u ćelijama tretiranim metforminom pokazale veći pad nego u ostale tri grupe (Slika 6E). Zatim su se mogli vidjeti blagi porast FFA u grupi koja je primala oltipraz i vitamin C, dok su od 4. do 5. vremenske tačke, FFA pokazale blagi pad u grupi koja je primala metformin (Slika 6E, 6F, 6H).

U ćelijama tretiranim rapamicinom, nivoi FFA su se u osnovi održavali od 3. do 5. vremenske tačke. Konkretno, kao što je prikazano na Dodatnoj slici 3 i Dodatnoj tabeli 4, obrasci promjene FFA mogu se dalje klasificirati u 8 klastera. Pri tome, klaster 6 koji se uglavnom sastoji od SFA pokazao je isti raspored kao oni prikazani u grupi oltipraza i vitamina C, dok je klaster I bio u osnovi isti kao grupa rapamicina. Općenito, srednja-FFA u svim grupama osim metformina bila je globalno povećana zajedno sa inducicijom, što sugerira povezanost između FFA u internom kulturnom okruženju i starenja stanica. Ćelije inducirane metforminom i vitaminom C doprinijele su sličnom utjecaju na SFA u unutrašnjem okruženju u poređenju sa indukcijom rapamicinom (Slika 6A,6D,6E,6H).

Opća strategija za proučavanje efekata lijekova protiv starenja u hMSC-ima

Da sumiramo, kao što je prikazano na Slici 7, da bi se okarakterisali efekti protiv starenja četiri leka u hMSC-ima, sprovedena je sistematska studija zasnovana na radionici koja se sastojala od karakterizacije fenotipa, transkriptomike, ćelijske lipidomike i analize lipidomike srednje količine. Oltipraz je ublažio starenje i poboljšao efikasnost diferencijacije trilinea promovišući proizvodnju PI, inhibirajući biosintezu PC/PE i blokirajući konverziju iz SFA u MUFA. GO termini su također ilustrirali fenotip povezan sa ćelijskim starenjem, procesom mitoze i mejoze, ćelijskim odgovorom na stimulans oštećenja DNK, amonijum jonima i nivoima kiseonika. Zanimljivo je da je put NRF2 reguliran i oltiprazom i metforminom kako bi promovirao diferencijaciju stanica u različitim stupnjevima. U međuvremenu, raspored lipidomike medija pokazao je kritičnu ulogu srednjih FFA u diferencijaciji MSC u više tipova ćelija. Stoga, multidimenzionalna strategija pruža višestruke perspektive za tumačenje različitih efekata intervencije lijekova na starenje hMSC-a. Ova metoda se može koristiti za proučavanje različitih bioloških fenotipova nakon intervencije lijeka u MSC što će proširiti kliničku primjenu hMSC-a.

DISKUSIJA

Nova bolest korona virusa 2019 (COVID-19) je prerasla u globalnu vanrednu situaciju u javnom zdravstvu. Trenutno ne postoje specifični lijekovi za zaštitu pacijenata od imunomodulatornog djelovanja. Prijavljeno je da primjena MSC-a u teškim slučajevima COVID-19 poboljšava ishod pacijenata regulacijom upalnog odgovora tijela i promoviranjem popravke i regeneracije plućnog tkiva [20]. Međutim, česta pojava starenja hMSC-a tokom dužeg vremena kulture in vitro ometa kliničku primjenu hMSC-a. U ovoj studiji uspostavljamo in vitro sistem skrininga lijekova zasnovan na fenotipu starenja BM-hMSCs [21]. Mnoge studije su sprovele interventno istraživanje vezano za starenje za hMSC zasnovano na manipulaciji TF [22-27] i primjeni različitih lijekova [10. 13,17,28,29].Međutim, mi smo prvi koji je temeljno procijenio efekat protiv starenja različitih lijekova na BM-hMSC iz perspektive aktivnosti SA- -gala i efikasnosti diferencijacije. Rapamicin, oltipraz, metformin i vitamin C su četiri tradicionalna lijeka koji su prvi put korišteni za intervenciju starenja hMSC-a. Iako sva četiri lijeka suprotstavljaju starenje BM-MSC, tačni efekti i osnovni mehanizam četiri lijeka u promoviranju diferencijacije stanica bili su različiti. Što je još važnije, uspostavljamo i sveobuhvatni sistem evaluacije intervencije lijeka integriranom analizom transkriptomskih i lipidomičkih profila u ćelijskim supernatantima i lizatima. Detaljno, transkriptomski podaci su u potpunosti analizirani u kombinaciji s fenotipom matičnih ćelija nakon tretmana lijekovima kako bi se istražio izmijenjeni put i osnovni mehanizmi na koje je utjecao liječenje lijekovima. Štaviše, uzorak promjene lipida u ćelijama tretiranim različitim lijekovima u različitim vremenskim točkama određen je LC-MS. Nadalje, kroz integraciju podataka transkriptomike i metabonomije lipida, analizirani su i sažeti metabolički putevi specifični za lijek i promjene lipida koje se odnose na lijek.

Oltipraz je najbolji lijek za poboljšanje sposobnosti diferencijacije BM-hMSC među četiri lijeka. DEG-ovi na koje utiče tretman oltiprazom uglavnom su obogaćeni ćelijskim starenjem, ćelijskim ciklusom i ćelijskim odgovorom na lekove, cAMP i tako dalje. Ove promjene igraju ključnu ulogu u ćelijskom starenju. Međutim, oltipraz i metformin, inhibitori Nrf2 puta, utjecali su na uobičajene regulatorne puteve [30], koji su uglavnom obogaćivali sposobnosti diferencijacije stanica, ćelijsku sudbinu i ćelijski metabolizam. Kao inhibitor mTOR puta, rapamicin bi mogao spriječiti ćelijsko starenje [31, 32] Dosljedno, otkrili smo da rapamicin igra najbolju ulogu u promicanju osteogene diferencijacije koja uglavnom reguliše put metaboličkih procesa spojeva koji sadrže fosfate, organizaciju ćelijskih komponenti, ćelijska komunikacija, transdukcija signala, proces biosinteze makromolekula, metabolički proces ćelijskih proteina i razvoj skeletnog sistema. Vitamin C je dobro poznati reduktor i igra najbolju ulogu u promociji ćelijske proliferacije u poređenju sa ostala tri lijeka, ali nije bilo značajnog efekta u poboljšanju sposobnosti diferencijacije trilojnica MSC. Ovi fenotipovi mogu biti uzrokovani odgovorom na citokinski/lipidni/oksidativni stres i pozitivnom regulacijom katalitičke aktivnosti (dodatna slika 4).

Dokazano je da lipidi igraju nezamjenjivu ulogu u diferencijaciji matičnih stanica [33]. Ranije smo otkrili da je povećanje membranskih glicerofosfolipida, uključujući PC i PE, što je znak starenja, globalno opaženo kod starijih MSC-a[18]. U trenutnoj studiji, smanjenje PCs i PE je uočeno u ćelijama tretiranim oltiprazom koji je najbolje pokazao odlaganje starenja MSC. PC i PE su lipidi sa najvećim sadržajem u izgradnji eukariotskih membrana 34]. Povećani nivoi PC-a i PE u serumima su prikazani kod starijih osoba u poređenju sa mlađim osobama [34]. Zanimljivo je da su PI bili manji GPL-ovi smanjeni kod starijih MSC-a u našim prethodnim zapažanjima. U ovoj studiji, PI su dramatično povišeni u svim indukovanim ćelijama. Mehanički, analiza puteva je sugerirala da povećanje PI može biti povezano sa aktiviranom CDS1. CDS1 kinazom dokazano je da učestvuje u regulaciji ROS signalizacije i dalje utiče na ekspresiju gena koji su funkcionisali u oksidativnoj rezistenciji [35]. Još jedan značajno blokiran metabolički tok je konverzija iz SFA u MUFA posredovana SCD. Kao biobarometar lipogeneze, aktivirana SFA/MUFA je uočena u nizu bolesti kao što su rak i nealkoholna bolest masne jetre (NAFLD)[36,37] Slični rezultati su također uočeni kod starijih miševa, što odražava abnormalni metabolizam lipida u jetri tokom starenja [38]. Sveukupno, naša strategija se može koristiti u skriningu lijekova protiv starenja i istraživanju molekularnih mehanizama nakon liječenja lijekovima u matičnim stanicama i raku. Kombinovanjem strategije sa sistemom evaluacije, možemo vršiti praćenje u realnom vremenu na osnovu statusa matičnih ćelija vezanih za starenje kako bismo otkrili nove lekove koji će se koristiti u terapijama matičnim ćelijama.

Ovaj članak je preuzet sa www.aging-us.com