Ukupni glikozidi Cistanche Deserticola potiču oporavak neuroloških funkcija indukcijom neurovaskularne regeneracije putem Nrf- 2/Keap-1 puta u MCAO/R pacovima-Ⅱ

TG-ovi promovišu neuronsko remodeliranje kod I/R ozlijeđenih pacova

Prema brojnim studijama, neurogeneza nakon moždanog udara može značajno poboljšati funkcionalni oporavak. Sinaptofizin (SYN), proteini postsinaptičke gustine 95 (PSD-95) i protein 2 povezan sa mikrotubulama (MAP-2) korišteni su kao markeri za ispitivanje neuronske plastičnosti u ishemijskoj polusjeni korteksa. Da bi se procijenili efekti tretmana TG, PS i OS na neurogenezu kod I/R povrijeđenih pacova, izvršena je imunofluorescencija i western blot za ekspresije SYN, PSD95 i MAP-2. Kao što je prikazano na slikama 9 i 10, nivoi ekspresije SYN, PSD95 i MAP{10}} kod I/R štakora nakon 14 dana reperfuzije su se smanjili u poređenju sa NOR štakorima, dok bi izlječenje TGs i PSs moglo značajno povećati- regulišu nivoe njihove ekspresije. Grupa OS nije imala značajne promjene u poređenju sa grupom MOD. Podaci su pokazali da je izlječenje TG i PS bilo u stanju dramatičnopromoviraju neuralno remodeliranje nakon I/R ozljede. 

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZAŠTITU OD ISHEMIJSKOG MOŽDA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TGs Alter Nrf-2 i Keap{1}} ekspresije kod I/R ozlijeđenih pacova

Oksidativni stres je glavni patogeni mehanizam u I/R ozljedi. Studije su potvrdile da je Nrf-2 glavni regulator antioksidativnih reakcija. Da bismo istražili oksidativne odgovore posredovane Nrf-2 i Keap-1 nakon I/R ozljede, procijenili smo citoplazmatski

izraz kao i nuklearna translokacija Keap-1. U međuvremenu, ekspresija Nrf-2 u moždanim tkivima pacova povređenih I/R je takođe analizirana (Slike 10 i 11). Prema imunofluorescentnoj analizi, utvrđeno je da se Nrf-2 uglavnom nalazi u citoplazmi u NOR grupi. U grupi TGs, ekspresija Nrf-2 u citoplazmatskoj lokalizaciji je smanjena, ali povećana u jezgru, a također je uočena smanjena Keap{6}} ekspresija. Podaci su pokazali da se zaštita mozga TG može povezati sa modulacijom Nrf-2 i Keap-1.

TGs ublažavaju oksidativni stres moždanog tkiva kod I/R ozlijeđenih štakora

Da bi se potvrdili antioksidativni efekti TG, aktivnosti SOD, CAT, GSH-Px i MDA su evaluirane kod I/R povrijeđenih pacova. Na slici 12, sadržaj MDA je značajno povećan u MOD grupi, a istovremeno je smanjena aktivnost SOD, CAT i GSH-Px u odnosu na normalne pacove. Suprotno tome, tretman TG je doveo do značajnog smanjenja sadržaja MDA i povećanja aktivnosti SOD, CAT i GSH-Px. Ovi rezultati su dodatno potvrdili antioksidacionu aktivnost TG.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA LIJEČENJE ISHEMIJSKOG MOŽDA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

DISKUSIJA

Mnoga istraživanja sugeriraju da TCM C. deserticola ima ekstenzivne biološke aktivnosti, npr. poboljšava sposobnost učenja, pamćenja i imuniteta. Međutim, aktivne komponente C. deserticola za neuroprotekciju ostaju nejasne. Trenutni rad ima za cilj da prikaže aktivne komponente izC. deserticola protiv ishemijskog moždanog udarana modelu MCAO/R. Tri ekstrakta iz C. deserticola (TG, PS i OS) korištena su za procjenu njihovog djelovanja na MCAO/R pacove, kao i mogućih mehanizama.

Moždani udar je uobičajena akutna cerebrovaskularna bolest. Epidemiološke studije pokazuju da je moždani udar češći kod muškaraca nego kod žena. Tako su u našem eksperimentu za testove usvojeni mužjaci pacova. Naši rezultati su dokazali da indukcija I/R ubrzava oksidativni stres i volumen infarkta, razbijajući BBB i dovodi do ozljeda živaca i cerebrovaskularnih bolesti. Nakon skrininga, utvrđeno je da TG smanjuju volumen infarkta i potiču neuralno remodeliranje i angiogenezu. Štaviše, uočeno je da TG održavaju integritet BBB nakon I/R ozljede. Naprotiv, PS i OS ne donose značajno ublažavanje povreda I/R. Stoga se TG-ovi smatraju glavnom aktivnom frakcijom C. deserticola za neuroprotekciju, potencijalno kroz promoviranje neuralnog remodeliranja, angiogeneze i integriteta BBB-a putem aktiviranja Nrf- 2/Keap-1 puta.

Sve veći dokazi ukazuju na to da je uspostavljanje efikasne kolateralne cirkulacije značajno važno za izbjegavanje nastanka infarkta i ishemijske polusjenice, te je kritičan tretman u ranoj fazi ishemijskog moždanog udara. Proliferacija vaskularnih endotelnih ćelija i glatkih mišićnih ćelija nakon ishemijskog infarkta određuje uspostavljanje kolateralne cirkulacije. Međutim, modeli ishemije imaju zajednički fenomen - to jest, oksidativni stres široko postoji u mikrovaskulaturi mozga. Podaci istraživanja su pokazali da veliki broj antioksidansa može poremetiti funkciju BBB i svojstva angiogeneze. CD31 i a-SMA su markeri vaskularnih endotelnih ćelija, kao i ćelija glatkih mišića, respektivno. Da bismo istražili učinak gore spomenute ćelijske proliferacije ekstrakata iz C. deserticola, ispitali smo ekspresiju CD31 i a-SMA u cerebralno ishemijskom penumbra homogenatu. Naši podaci su pokazali da TG upadljivo pojačavaju ekspresiju CD31 i a-SMA. Međutim, nije bilo značajnih razlika između PS i OS grupa. Stoga smo zaključili da TG mogu smanjiti oštećenje mozga promicanjem angiogeneze povećanjem ekspresije CD31 i a-SMA, dok PS i OS ne pružaju takvu zaštitu od oštećenja mozga. Ovi rezultati su dalje potvrdili da samo TG mogu spriječiti cerebralnu I/R ozljedu.

Ishemijski moždani udar može se smatrati rezultatom cerebralne ishemije uzrokovane oštećenjem neuronske plastičnosti ili remodeliranjem područja mozga. Većina pacijenata sa moždanim udarom pati od neuroloških deficita. Aktiviranje neurogeneze je obećavajuća strategija za pacijente s moždanim udarom za poboljšanje njihovih neuroloških funkcija. Neurogeneza direktno sudjeluje u oporavku neuroloških funkcija nakon I/R ozljede mozga. Prethodna istraživanja pokazuju da TG mogu poboljšati stopu preživljavanja hipokampalnih piramidalnih stanica i inducirati neurogenezu. Oksidativni stres uzrokuje gubitak neurona tokom mnogih bolesti, kao što su Parkinsonova bolest, moždani udar i tako dalje. Nrf-2 transkribuje mnogo gena povezanih sa neuro-zaštitom u njihovoj promotorskoj regiji, uglavnom uključujući SOD, MDA, CAT i g-glutamil cistein ligaze, itd. SYN, PSD-95 i MAP{{ 4}} proteini, koji su blisko povezani sa sinaptičkim formiranjem i neurotransmisijom, mogu se smatrati markerima istraživačke neuronske plastičnosti u regiji ishemijske penumbre. Nakon proučavanja, otkrili smo da lijek sa TG može značajno povećati ekspresiju PSD95, SYN i MAP-2, što ukazuje da je cerebralna zaštita TG-a bila u korelaciji sa poboljšanom plastičnošću neurona tokom I/R. Međutim, šteta je što ne postoji očigledna razlika između PS-ova i OS grupa. Ovi rezultati su pokazali da TG mogu poboljšati neuroplastičnost nakon cerebralne I/R ozljede.

Slikovno istraživanje pacijenata sa moždanim udarom pokazalo je da se disfunkcija BBB može smatrati upečatljivim atributom periishemijskog mozga (Bang et al., 2007). TJ, koji se sastoje od citoplazmatskih proteina, transmembranskih proteina i spojnih adhezionih molekula između kapilarnih endotelnih ćelija, vrlo su važni u održavanju integriteta BBB (Ye et al., 2019). Među njima, ZO-1, claudin-5 i okludin su najvažniji proteini u TJ. Sve veći dokazi pokazuju da povećana permeabilnost BBB izazvana ishemijom generalno korelira sa promenama ZO-1, claudin-5 i okludina (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017.; Liu et al., 2018.). U ovom radu, rezultati su pokazali da iako TG mogu značajno povećati ekspresiju proteina ZO-1, claudin-5 i okludina u moždanim tkivima izazvanim MCAO, ni PS ni OS to nisu učinili. BBB se sastoji od cerebralnih endotelnih ćelija i usko je povezan sa pericitima (Nyul-Toth et al., 2016). Periciti su vitalni za integritet BBB (Bell et al., 2010). Ishemijski moždani udar izaziva smrt pericita i odvajanje od endotelnih stanica mozga u akutnoj fazi, destabilizirajući tako mikrovaskulaturu i mijenjajući svojstva BBB (Zechariah et al., 2013). Naši podaci su pokazali da TG mogu povećati pokrivenost pericita na kapilarama i povećati nivoe ekspresije ZO-1, claudin-5 i okludina. Ovi fenomeni su dokazali da TG mogu efikasno zaštititi integritet BBB nakon cerebralne I/R ozljede. Ukratko, TG mogu ublažiti cerebralnu ozljedu na više načina, kao što je promoviranje angiogeneze, poboljšanje plastičnosti neurona i održavanje integriteta BBB-a.

Zatim smo istražili signalni put kako bismo istražili mehanizam koji leži u osnovi zaštite TG mozga. Proces I/R ozljede je multifaktorski, te su stoga brojni mehanizmi uključeni u patogenezu. Oksidativni stres je osnovni faktor rizika koji doprinosi I/R-induciranoj ozljedi mozga, kao što je oštećenje BBB strukture, vaskularna endotelna disfunkcija i pogoršanje ishemijske neuronske ozljede. Stoga je oksidativni stres postao atraktivna terapijska meta kod ozljeda mozga izazvanih I/R. Enzimi faze 2, koji su posredovani nuklearnim faktorom E2-srodnim faktorom-2 (Nrf-2), smatraju se važnim sredstvom pomoću kojeg se neuroni štite od oksidativnog stresa. Sve više dokaza ukazuje da je aktivacija Nrf-2 tokom I/R potencijalna terapijska meta za neuroprotekciju. Nrf-2, kao važan regulator endogene antioksidativne odbrane, posreduje u nivou hem oksigenaze 1 (HO-1) i drugih antioksidativnih enzima, kao što je NAD(P)H kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH i MDA. Štaviše, Nrf-2 igra važnu regulatornu ulogu u angiogenezi. Ova studija pokazuje da se Nrf-2 može značajno poboljšati i aktivirati u procesu vaskularnog razvoja.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA ANTIISHEMIJSKI MOŽDANI UDACI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kao što je prethodno opisano, TG sadrže mnogo bioaktivnih spojeva, na primjer, ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izoakteozid i 2'-acetilakteozid, a neki od njih su pokazali neuroprotektivne funkcije nakon cerebralne I/R ozljede. Ehinakozid ima mnogo farmakoloških efekata, kao što su antioksidacija, anti-senescencija, neuroprotekcija, anti-inflamacija, promocija cikatrizacije, hepatoprotekcija, promocija formiranja kostiju i antitumorska aktivnost. Nedavno je ehinakozid identifikovan kao snažan antioksidans u centralnom nervnom sistemu. Ehinakozid može smanjiti sadržaj MDA i poboljšati aktivnosti SOD i GSH-Px kod ishemijske ozljede mozga, a molekularna analiza je pokazala da se ehinakozid može vezati za Keap-1, što dovodi do nuklearne translokacije Nrf-2. Studija koju je sprovela Xia pokazala je da akteozid može smanjiti volumen infarkta i sadržaj vode u mozgu kako bi poboljšao neurološki deficit kod MCAO/R pacova ublažavanjem oksidativnog stresa. Druge studije su pokazale da izoakteozid može povećati aktivnosti ćelijskih antioksidativnih enzima, SOD i CAT u V79-4 ćelijama tretiranim H2O2-. Na osnovu gornjih izvještaja o aktivnim jedinjenjima sadržanim u TG-ovima, moguće je zaključiti da bi TG-ovi moglištite od ishemijskog moždanog udara putem antioksidacijskih puteva.

Li je izvijestio o neuroprotektivnim efektima feniletanoidnih glikozida (PhG) na H2O2-indukovanu apoptozu na PC12 stanicama putem Nrf2/ARE puta (Li et al., 2018). Ovi PhG su značajno potisnuti pokretanjem nuklearne translokacije Nrf2 i povećanjem ekspresije HO-1, NQO1, katalitičke podjedinice glutamat cistein ligaze (GCLC) i podjedinice modifikatora glutamat-cistein ligaze (GCLM) (Li et al., 2018). Gong et al., 2019.). Stoga, ovi nalazi sugeriraju da put Nrf-2/ARE igra ključnu ulogu u zaštitnim efektima posredovanim PhGs na neuronske ćelije. Slično, u ovoj studiji smo otkrili da TG mogu smanjiti nivo MDA i povećati nivoe SOD, CAT i GSH-Px kod I/R štakora. U međuvremenu, TG bi mogli povećati ekspresiju Nrf2 u jezgru, smanjiti odgovarajuću ekspresiju u citoplazmi i značajno smanjiti Keap{16}} ekspresiju. Stoga, put Nrf-2/Keap-1 može biti uključen u neuroprotektivne efekte posredovane TG. Dalja validacija ovog puta će se vršiti in vitro ćelijskom kulturom sa modelima deprivacije kiseonika i glukoze/reoksigenacije u budućnosti. Štaviše, ekstrakti C. deserticola su davani u našoj studiji 14 dana u kontinuitetu. Pošto bi neurogeneza odraslih uticala na tumačenje neuroprotektivnih efekata tokom 14 dana reperfuzije, neurogeneza se ne može isključiti iz našeg trenutnog dizajna eksperimenta u istraživanju neuroprotektivnog efekta CT-a. Ovo je ograničenje našeg istraživanja.

U zaključku, TG iz C. deserticola mogupojačavaju angiogenezu i neurogenezukao i održavanje integriteta BBB kod pacova sa I/R povredama, ali ne i PS i OS. Efekti bi mogli biti posredovani aktivacijom Nrf-2/Keap-1 puta.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA LIJEČENJE ISHEMIJSKOG MOŽDA PHGS75% ECH 30% ACT 12%