Proučavanje mehanizma glikozida Cistanchea sličnog estrogenu pomoću metabolomike

Uvod

Estrogeni igraju važnu ulogu u mnogim razvojnim, fiziološkim i srodnim procesima, uključujući razvoj materice.1–3 Međutim, dugotrajna upotreba estrogena može imati mnoge nuspojave, kao što je povećanje rizika od raka dojke, raka endometrijuma i drugih ginekoloških tumora.4,5 Stoga su se istraživači obavezali da traže zamjene za estrogen koji bi mogli izbjeći ove nuspojave, poznate kao selektivni modulatori estrogenskih receptora, od kojih fitoestrogeni čine važnu kategoriju.6 Jedinjenja fitoestrogena se prirodno javljaju u biljkama sa estrogenom snagom i mogu se vezati za estrogenske receptore kako bi izvršili svoju aktivnost. Stoga bi fitoestrogeni mogli stimulirati rast materice kombinacijom sa obilnim estrogenskim receptorima u materici, što znači da bi se uterotrofni test mogao koristiti za preliminarni skrining i evaluaciju fitoestrogena.

Cistanchedeserticola (CD), poznata kao Rou Cong-Rong u Kini, navodno je efikasna za reprodukciju, razvoj i funkcije plodnosti, a koristi se kao tonik više od 1800 godina.8,9 Nedavno su farmakološke studije pokazale da je ovaj tonik ima široke medicinske funkcije, kao nprregulacija hormona, aperientna, imunomodulatorna, antioksidativna, antiapoptotička, neuroprotektivna, antinociceptivna, protuupalna, protiv umora i estrogena aktivnost.10 Glikozidi cistanhe (GC) ekstrahovani iz CD su među glavnim aktivnim komponentama i pokazuju različite biološke aktivnosti.11 Iako su aktivni sastojci CD-a prethodno razjašnjeni,12 mehanizam sličan estrogenu GC nikada nije istražen.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREVENCIJU OSTEOPOROZE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

U ovoj kontinuiranoj studiji, imali smo za cilj da potvrdimo moguću upotrebu GC-a kao fitoestrogena i izvršimo analizu metabolizma kako bismo istražili mehanizam GC-a sličan estrogenu. Prvo, korišteni su uterotrofni test i histološka analiza da se potvrdi estrogena aktivnost GC. Ono što je najvažnije, fokusirali smo se na metaboličke promjene u serumu i urinu štakora koristeći UPLC-MS/MS metabolomičku analizu. Zbog nedostataka neciljane metabolomike, poput ponovljivosti i kompliciranog utjecaja matrice, korištena je pseudo metoda zasnovana na MRM modu za posebno praćenje metabolita i indeksa (uključujući energetski metabolizam, oksidativni stres, metabolizam lipida i metabolizam aminokiselina) vezan za estrogene efekte, rast i razvoj odabran je kao biomarker za detekciju. Naši rezultati bacaju svjetlo na mehanizam GC-a sličan estrogenu, koji će pomoći razvoju i korištenju GC-a.

Eksperimentalno

Reagensi

L-leucin, L-kinurenin, L-triptofan, 5-HTP, holna kiselina, Nfenilacetilglicin, 5-HT, glutation (GSH) i 2,4-dinitrofenilhidrazin (99 USD.{{ 8}}%, HPLC) kupljeno je od Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, Kina). N-etilmaleimid ($98%, HPLC), L-glutation oksidirani (GSSG, $98%, HPLC) i 1,1,3,3-tetraetoksipropan (TEP) kupljeni su od Sigme (Madrid, Španija). L-fenilalanin (Prsten-D5, 98%, DLM-1258-5) je nabavljen od Cambridge izotopskih laboratorija (MA, SAD). MS metanol i acetonitril su nabavljeni od ACS (Hjuston, SAD). Dietilstilbestrol (čistoća, $99.0%), mravlja kiselina, glacijalna sirćetna kiselina i hematoksilin i eozin (H&E) su nabavljeni od Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, SAD). Naringenin (čistoća, 98% (HPLC)) je kupljen od Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Šangaj, Kina). GC su pripremljeni u našoj laboratoriji, a njihova čistoća je utvrđena na 60% ultraljubičastom spektrofotometrijom uz korištenje akteozida kao markera za određivanje.

Priprema GC-a

briey,cistanche prah(100 g) je natopljeno u 75% etanolu (1000 mL) 1 h, zatim reux ekstrahirano 2,5 h tri puta. Supernatant je koncentrisan pod vakuumom da bi se dobioekstrakt cistanche(23,3 g). Ekstrakt je razrijeđen vodom do koncentracije od 0.5 g mL- 1 (topljivost određena sa sirovim lijekom). Nakon adsorpcije sa AB-8 makroporoznom smolom tokom 8 h, kolona je eluirana uzastopno sa vodom i 85% etanolom. Eluent od 85% etanola je koncentrisan da se dobije etanolni ekstrakt (8,4 g). Ekstrakt etanola (0.02 g) je tačno izmjeren i otopljen u 50% metanola (10 mL). Alikvot rastvora od 1 mL razblažen je do 100 mL sa metanolom u volumetrijskom testu. Konačno, razrijeđena otopina je izmjerena na 330 nm ultraljubičastom spektrofotometrijom. Apsorpcija ultraljubičastog zračenja bila je 0,341, a linearni odnos za akteozid prema UV bio je y=24,905X + 0,0426 (R2=0,9982). Kada je sadržavao 5,04 g GC, stopa prečišćavanja je bila 60% (akteozid je korišten kao marker za određivanje GC). Procjena otiska prsta GC-a prikazana je na ESI slici S1.

Eksperimenti na životinjama i prikupljanje uzoraka

Ženke SD pacova seksualne nezrelosti (45-60 g) i seksualne zrelosti (320-380 g) obezbijedio je Centar za životinje Medicinskog univerziteta Harbin, dozvola za laboratorijske životinje, SCXK- (vojska): 2013-001. Životinje su smještene u SPF laboratorijskim uvjetima i snabdjevene su standardnom laboratorijskom ishranom izmijenjenom vodom iz slavine ad libitum. Svi postupci na životinjama odobreni su u skladu sa Smjernicama za dobrobit i njegu životinja provincije Heilongjiang i izvedeni prema smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje u vezi sa principima brige o životinjama (2004). Svi pacovi korišćeni u ovom eksperimentu aklimatizovani su na gore navedeno okruženje nedelju dana.

Polno nezreli SD pacovi su nasumično podijeljeni u tri grupe od 10 pacova: prazna grupa, dietilstilbestrol grupa i GC grupa. U međuvremenu, 10 SD štakora polne zrelosti odabrano je kao kontrolna grupa. Dietilstilbestrol grupi je ig davan dietilstilbestrol (0,35 mg kg- 1, 1 mL/100 g), GC grupi je davan ig GC rastvor (30 g kg- 1, 1 mL/100 g ), a slepa grupa i kontrolna grupa su dobijale destilovanu vodu iste zapremine dva puta dnevno (ujutro i uveče) tokom 3 dana. Trećeg dana, pacovi su smešteni u metaboličke kaveze nakon davanja, a uzorci urina su kontinuirano prikupljani tokom 24 sata. Štakori su anestezirani pentobarbitalom i uzorci krvi su uzeti i sakupljeni iz abdominalne aorte i centrifugirani na 3000 × g (15 min, 4. C) da se dobije serum. Svi uzorci su pohranjeni na - 20. C. Nadalje, materica je odvojena, izmjerena i pregledana korištenjem 10% formalina.

Histološka analiza

Iz materice su izrezana serijska tkiva debljine 5 mm. Isječci tkiva su zatim umetnuti u parafin, obojeni H&E rutinskim metodama i posmatrani optičkim mikroskopom (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japan). Visina epitelnih ćelija materice merena je mikrometrom pod mikroskopom.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA PROMOVISANJE RASTA DOJKI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metabolomics

Priprema seruma očišćenog od aktivnog uglja

Specijalni slijepi serum pripremljen je od seruma štakora koji je bio lišen endogenih materijala korištenjem praha aktivnog uglja. Aktivni ugalj u prahu (6 g) je dodat u serum štakora (100 mL) mućkanog 2 h na sobnoj temperaturi i centrifugirano na 4°C. C i 13 500 o/min 20 min. Supernatant je izmijenjen korištenjem Millipore express PES membrana (Merck Millipore, Ltd.) pričvršćenih na špric od 20 mL u sljedećem redoslijedu: 5 mm, 1,2 mm i 0,45 mm. LC-MS/MS potvrdio je da "ogoljeni" serum ne sadrži biomarkere.

Priprema standardnih rastvora

L-triptofan (Try), L-kinurenin (Kyn), GSSG, N-fenilacetilglicin (N-Phe), 5- HTP, L-leucin (Leu), 5-HT i holna kiselina ( CA) osnovne otopine (1 mg mL- 1) ​​pripremljene su korištenjem 100% metanola. GSH je pripremljen u količini od 0,5 mg mL- 1 u 10 mM NEM PBS puferu i pohranjen na - 40. C u smeđim bocama. Kalibratori su generirani korištenjem kombinovanog L-triptofana, L-kinurenina, GSSG, N-fenilacetilglicina, 5-HTP, L-leucina, 5-HT, holne kiseline i GSH-NEM koji su serijski razrijeđeni destiliranim vode. IS osnovni rastvor L-fenilalanina-d5 (d5-Phe) je pripremljen u 100% metanolu, a radni rastvor d5-Phe (10 ng mL- 1) je pripremljen u 100% metanolu i pohranjen na - 40. C.

Tokom analize, korak derivatizacije je bio neophodan kako bi se izbjegla degradacija GSH, što je poboljšalo stabilnost za detekciju i kvantifikaciju GSH. GSH je određen nakon reakcije sa NEM.15,16 Prema prethodnom izvještaju, 50 mM NEM je odabran za GSH.

Priprema uzorka

Za uzorke seruma, 10 mM NEM (200 mL) je dodato uzorku (200 mL), a zatim metanol (1000 mL koji sadrži IS Phe-d5 u 10 ng mL- 1), i inkubirano 20 minuta na { {9}}. C. Nakon centrifugiranja na 4. C i 12 000 o/min tokom 10 min, supernatanti (1000 mL) su prebačeni u centritube od 2 mL i ispareni do suva. Osušeni ostatak je rekonstituisan u destilovanoj vodi (100 mL) nakon centrifugiranja 15 minuta na 4°C. C i 13 500 o/min, a alikvot od 10 mL supernatanta je ubrizgan za analizu.

Za uzorke urina, 100 mL uzorka stavljeno je u epruvetu od 2 mL, a svakom uzorku mokraće je dodana 1 zapremina PBS (m/v) koja sadrži 50 mM NEM. Zatim je dodan metanol (1000 mL koji sadrži IS u 10 ng mL- 1) i uzorak je inkubiran na - 20. C 20 min, a zatim centrifugirano na 12 000 o/min 10 min na 4 . C. Supernatant (1000 mL) je uparen do suha pod laganom strujom azota na sobnoj temperaturi, a zatim je ostatak otopljen u 60 mL mobilne faze i vorteksiran 1 min prije centrifugiranja na 13 500 o/min i 4 . C 15 min. Za analizu je ubrizgan alikvotni supernatant od 10 mL.

Validacija metodologije

Validacija testa je izvršena u skladu sa "Vodič za industriju: Validacija bioanalitičke metode" (Food and Drug Administration, septembar 2013). Kalibratori su generirani korištenjem surogat matrice za Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe i CA iz standardnih radnih otopina u "skidanom" serumu. Svaki kalibrator koncentracije je dupliciran. Standardna kriva izračunata je linearnom regresijom kalibratora standardne krive 1/X ponderisane najmanjih kvadrata i omjera površina vrha za analit prema IS.

Test preciznosti i tačnosti

Preciznosti analize prikupljenih QC uzoraka i neobrađenih QC uzoraka seruma/urina pacova procijenjene su korištenjem jedne unutardnevne i tri međudnevne analitičke serije. QC uzorci sa tri različite koncentracije generirani su dodavanjem L-triptofana, L-kinurenina, GSSG, N-fenilacetilglicina, 5-HTP, L-leucina, 5-HT, holne kiseline i GSH-NEM standardne otopine za "skinuti" serum/PBS, koji su zatim obrađeni na isti način kao i in vivo uzorci. Pokušajte, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu i CA standardne osnovne otopine (1 mg mL- 1) pripremljene su u 10 0% metanola, osim GSH, koji je pripremljen u količini od 0,5 mg mL- 1 u 10 mM NEM PBS puferu. Standardne krive pri osam različitih koncentracija generirane su na isti način kao i QC uzorci i analizirane linearnom regresijom 1/X ponderisane najmanjih kvadrata. Za studiju validacije metode, druga QC metoda je izvedena istovremeno korištenjem prikupljenog seruma/urina (50 mL) iz svakog uzorka kontrolne grupe ili grupe modela da bi se dobio QC uzorak i zatim obrađen kao uzorci in vivo. Serija QC uzoraka i standardnih krivulja rađena je za svakih 50 životinjskih uzoraka.

Matrični efekti

Varijacija matrice, definisana kao varijacija u tačnosti testa za različite serije matrice, procenjena je korišćenjem šest različitih dijagrama seruma/urina štakora sa šiljcima za analizu i procenu naglog oporavka.17 Evaluacija celokupnog efekta matriksa za analizu endogenog jedinjenja je izazovna. . Jedan od načina da se testira da li test ima bilo kakav (ukupni) efekat matriksa je procijeniti nagli oporavak. Ekstrakcioni test uključuje dodavanje analita u uzorke pre ekstrakcije, što se razlikuje od testa matriks faktora (MF), koji uključuje dodavanje analita u uzorke nakon ekstrakcije.18 MF je izračunat kao površina vrha analita u prisustvo biološke matrice u poređenju sa onim u odsustvu biološke matrice. Korišten je IS-normalizirani MF: MF ¼ omjer površina vrha/IS u prisustvu matrice naspram omjera površine pika/IS u odsustvu matrice.

UPLC-MS/MS analiza

MS oprema opremljena Waters X BridgeTM BEH C18 analitičkom kolonom XP (2,5 mm, 3.0 × 100 mm; Waters, Torrance, CA) korištena je za LC-MS /MS analiza. Q linearni gradijent mobilna faza sastavljena od 0.1% vode mravlje kiseline (rastvarač A) i metanola (rastvarač B) korištena je prema sljedećem gradijentnom programu: 0–3.0 min (0–1% B); 3.0–10.0 min (1–3% B); 10.0–14.0 min (3–50% B); 14.0–18,0 min (50–95% B); 18,0–22,0 min (95–0% B), vrijeme zaustavljanja je 25 min. Zapremina injekcije bila je 10 mL, a brzina 0,6 mL min{42}}. Završna metoda koristila je sljedeće parametre: tip skeniranja, MRM; jonski mod, elektrosprej jonizacija (ESI) u pozitivnim i negativnim ionskim modovima; napon jonskog spreja, ± 4500 V; plinska zavjesa, 20; temperatura 450 C; izvor jona gas 1, 40; ion izvor gasa 2, 40. Svi UPLC-MS podaci su dobijeni korištenjem softvera AB Analyst (verzija 1.6.2), a m/z 171.1–125.2 za interni standard d5-Phe (DP, 63 V; CE , 8 V, 21 V, 24 V) i detaljni MS uslovi su prikazani u tabeli S1;

Statistička analiza

Sve vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SD. Značajnost razlika među grupama je upoređena putem jednosmjernog ANOVA testa praćenog Dunnettovim testom korištenjem programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). Prag značajnosti je u ovom testu postavljen na p < 0,05.

Rezultati i diskusija

Učinak GC-a na matericu

Težina materice i histološka analiza korišteni su za procjenu učinka GC-a na matericu. Težina materice je značajno povećana u dietilstilbestrolu, GC i kontrolnim grupama u odnosu na slijepu grupu (P < {{0}}.01). U slijepoj grupi, epitel endometrija je bio nisko stupasti sa malim žlijezdama, žljezdasti epitel kubičnog oblika i bez intersticijskih inflamatornih stanica. U skupini koja je primala dietilstilbestrol, žljezdani epitel i endometrij su bili visoko stupasti i pokazivali su hiperplaziju, s puno intersticijskih inflamatornih stanica. U GC grupi, žljezdani epitel i endometrijum su bili visoko stupasto nazubljeni i pokazivali su hiperplaziju s puno intersticijskih inflamatornih stanica i zadebljanja intime. U kontrolnoj grupi, endometrijum je bio visoko stupasti, a žljezdani epitel nisko stupasti, s malo intersticijalnih inflamatornih stanica. U poređenju sa slijepom grupom, visina epitelnih ćelija materice je značajno povećana u ostalim grupama (P < 0,01) (Sl. 1).

Metoda validacije otkrivenog biomarkera pomoću UPLC-MS/MS

Linearnost i raspon kalibracije

Za svako merenje konstruisana je linearna kalibraciona kriva sa težinskim faktorom 1/X u proučavanoj matrici. Kalibracione krive za analize u serumu analizirane su u različite dane. Opsezi kalibracije za analize raspoređeni su duž sedam kalibracionih tačaka, kao što je prikazano u tabeli 1.

Tačnost i preciznost. Metoda se pokazala odgovarajućom, u smislu tačnosti i preciznosti, kako između dana tako i unutar dana, za sve proučavane uzorke. Vrijednosti ovih parametara bile su manje od 5% pri zadatim koncentracijama za GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, holnu kiselinu, 5-HT i N-fenilacetilglicin, sa tri ponavljanja svake analizirane koncentracije. Podaci koji odgovaraju međudnevnim i unutardnevnim vrijednostima točnosti i preciznosti prikazani su u ESI tabeli S2.

Matrični efekti

Kao što je prikazano u ESI Tabeli S3,† povećani oporavak je bio 92,5–118,1% kada se doda 1000 ng mL- 1 GSH, 2000 ng mL- 1 GSSG, 1000 ng mL- 1 Leu , 6000 ng mL- 1 Trp, 50 ng mL- 1 Kyn, 2 ng mL- 1 5-HTP, 400 ng mL- 1 holne kiseline , 8 ng mL- 1 5-HT, i 2500 ng mL- 1 N-fenilacetilglicina u tri različite grafike seruma štakora, i kada se doda 100 ng mL- 1 GSH, 200 ng mL- 1 GSSG, 1000 ng mL- 1 Leu, 6000 ng mL- 1 Trp, 50 ng mL- 1 Kyn, 2 ng mL{ {37}} od 5-HTP, 400 ng mL- 1 holne kiseline, 8 ng mL- 1 5-HT, 2500 ng mL- 1 N -fenilacetilglicina u tri različite grafike urina štakora sa različitim osnovnim nivoima. CV-ovi izmjerenih koncentracija Trp i Kyn iz ovih serija bili su #10% (n=5). Ovi rezultati su pokazali da različite matrice nisu značajno uticale na test.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA PREVENCIJU RAKA UTERICE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza profilisanja metabolita pseudo-ciljanom metodom

Pseudociljana metoda je korištena za istraživanje prolinga MRM-a u serumu i urinu u četiri grupe (prazno, dietilstilbestrol, kontrolna i GC).

Prvo, PCA model je napravljen da pokaže metaboličku razliku između četiri grupe. Iz multivarijantne analize, postojale su očigledne metaboličke razlike između GC grupa (uključujući dietilstilbestrol i kontrolne grupe) i slijepe grupe. Uzorci QC su se čvrsto grupirali na grafikonu rezultata PCA, što je pokazalo da je stabilnost sistema bila akomodativna za ovu metabolomičku studiju (slika 2).

Zatim je kritična P-vrijednost postavljena na 0.05 za značajno diferencijalne metabolite u ovom istraživanju. Shodno tome, kao što je prikazano u Tabeli 2, diferencijalni metaboliti u poređenju sa slijepom grupom su probno identificirani na sljedeći način: 17 u uzorcima seruma i

12 u uzorcima urina za GC grupu, 15 u uzorcima seruma i 9 u uzorcima urina za dietilstilbestrol grupu, 12 u uzorcima seruma i 11 u uzorcima urina za kontrolnu grupu, te 11 u uzorcima seruma i 7 u uzorcima urina koji su istovremeno prisutan u GC, dietilstilbestrolu i kontrolnim grupama. Da bi se dalje razumjele metaboličke razlike između različitih grupa, generirana je toplotna mapa klastera za sve diferencijalne metabolite, pokazujući relativno povećanje (crveno) ili smanjenje (zeleno) (slika 3).

Osamnaest diferencijalnih metabolita istovremeno prisutnih u GC, dietilstilbestrolu i kontrolnim grupama opisano je kao

slijedi: glukoza, limunska kiselina, prolin, betain, ornitin, N-fenilacetilglicin, fenil pirogrožđana kiselina, inozin, C16:0LPC, kreatinin i ksantozin u serumu i benzen acetil glicin, piroglutaminska kiselina, acetilkarnitinska kiselina, Primećeno je da je N6-acetil lizin u urinu značajno smanjen (P < 0.05); dok su taurin, ornitin, a-ketoglutarna kiselina i spermidin u urinu značajno povećani (P < 0.05). Dodatno, taurin (serum) je značajno povećan, dok su a-ketoglutarna kiselina (serum), C18:0LPC (serum) i betain (urin) značajno smanjeni u dietilstilbestrol i GC grupama (P < {{ 19}}.05); L-kinurenin (serum) je bio pojačano regulisan u dietilstilbestrol grupi, ali smanjen u GC grupi (P < 0,05); piroglutaminska kiselina (serum) i prolin (urin) su bili smanjeni, a limunska kiselina (urin) i nikotinamid (urin) su značajno povećani u kontrolnoj i GC grupi (P < 0,05); a fenilalanin je bio smanjen u GC grupi (P < 0,05).

U ovoj studiji ispitivani su efekti GC-a na matericu nezrelih pacova. Uterus je najosetljiviji organ za ispitivanje efekata hemikalija zavisnih od ER.Herba Cistanchesprijavljeno je da indukuje povećanje težine materice povećanjem funkcije oslobađanja lutropina hipotalamus-hipofize-jajnika,20 što je također uočeno za GC u ovoj studiji. Ovo ukazuje da GC imaju aktivnost sličnu estrogenu. Nedavno su se izvještaji uglavnom fokusirali na preovlađujući mehanizam kojim se estrogenski efekti izražavaju kroz vezivanje za ER,21-23, ali metabolički mehanizam nije detaljno proučavan. U ovoj studiji korišćena je pseudometabolomska metoda da se istraži mehanizam sličan estrogenu GC.

Metabolički intermedijari sekvencijalnog niza reakcija su se promijenili na izraženiji način od enzimske kinetike ili individualiziranja.24 Sedamnaest metabolita u serumu, uključujući glukozu, limunsku kiselinu, taurin, prolin, betain, ornitin, piroglutaminsku kiselinu, a-ketoglutarnu kiselinu, N fenilacetilglicin, fenilpiruvatna kiselina, inozin, C18:0LPC, C16:0LPC,

kreatinin, fenilalanin, L-kinurenin i ksantozin i 12 metabolita u urinu, uključujući benzen acetil glicin, betain, taurin, limunsku kiselinu, ornitin, piroglutaminsku kiselinu, acetilkarnitin, N6-acetil-nikoketina lizin, a Utvrđeno je da su kiselina, spermidin i prolin uključeni u estrogenski mehanizam GC. Nekoliko izmijenjenih metabolita bilo je od posebnog interesa jer su bili prisutni i u serumu i u urinu. Na primjer, limunska kiselina, nastala kondenzacijom acetil koenzima A i oksalooctene kiseline i koja igra važnu ulogu u ciklusu limunske kiseline u vezi s energetskim metabolizmom,25 je bila smanjena u serumu GC grupe, ali povećana u urinu. . Nadalje, a-ketoglutarna kiselina s glutaminskim ugljičnim okvirom, koja može održavati ukupnu ravnotežu dušika i promovirati sintezu proteina, i koja je središnji materijal ciklusa limunske kiseline, bila je smanjena u serumu GC grupe, ali je regulirana naviše. u urinu.26 Ciklus limunske kiseline nije samo konačni metabolički put tri glavna hranjiva sastojka (ugljikohidrati, lipidi i aminokiseline), već i veza između metabolizma šećera, lipida i aminokiselina, te glavni način dobivanja energije. za tijelo.27,28 Ovo je pokazalo da je mehanizam GC sličan estrogenu povezan sa energetskim metabolizmom, koji je isti kao dietilstilbestrol. Stoga je postojala jasna veza između ciklusa limunske kiseline i povećanja težine materice kod nezrelih pacova tretiranih GC. Kao važan donator metila, betain igra važnu ulogu u rastu i razvoju fetusa, što ukazuje na to da je betain uključen u povećanje težine materice.29 Zanimljivo je da je taurin bio pojačan u serumu i urinu, što bi moglo potaknuti varenje i apsorpciju lipida. , te uzimanje i korištenje glukoze stanicama promicanjem metabolizma glukoze. Prijavljeno je i da nedostatak taurina dovodi do gubitka težine kod mladih životinja, što sugerira da taurin igra važnu ulogu u rastu i razvoju.30 Štaviše, regulacijski učinak betaina i taurina od strane GC prati isti trend koristeći dietilstilbestrol, ali sa pojačanim efekat u poređenju sa dietilstilbestrolom.

Nadalje, brojne aminokiseline su značajno izmijenjene. Naši rezultati sugeriraju da GC izazivaju metaboličke abnormalnosti u aminokiselinama. Metabolizam aminokiselina mogao bi se koristiti za sintezu specifičnih proteina, peptida i drugih dušikovih jedinjenja, ili dekarboksilaciju deaminacijom, transaminacijom, u kombinaciji sa razgradnjom amonijaka, ili za oslobađanje energije kroz ciklus limunske kiseline.31,32 Stoga, promjene ovih spojevi mogu biti uključeni u važne signalne događaje koji pokreću povećanje težine materice.

Štoviše, za detaljnu analizu puta, diferencijalni metaboliti su kategorizirani u nekoliko glavnih puteva uključujući ciklus citrata (TCA ciklus), metabolizam glutationa,

Metabolizam arginina i prolina, metabolizam D-glutamina i D-glutamata, biosinteza fenilalanina, tirozina i triptofana, metabolizam fenilalanina i drugi putevi koristeći Pathway Analysis softvera MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst), kako je prikazano na slici 4. Put vezan za energetski metabolizam, uključujući TCA ciklus i metabolizam glutationa (i u serumu i u urinu), bio je jedan od glavnih ciljeva estrogenih efekata. Kritična uloga estrogenih hemikalija u energetskom metabolizmu potvrđena je ER-ima koji regulišu gene potrebne za mitohondrijalnu funkciju, TCA ciklus i više, prema prethodnim studijama.33,34 Moglo bi se zaključiti da je mehanizam GC sličan estrogenu bio sličan na onaj dietilstilbestrola, pri čemu su oba povezana, u određenoj mjeri, s TCA ciklusom i metabolizmom glutationa, ali s GC-ima koji imaju bolji učinak od dietilstilbestrola.

Iako mogući mehanizmi nisu mogli biti razjašnjeni u ovoj studiji, odabrani su neki metaboliti koji bi se mogli koristiti za istraživanje drugih estrogenih mehanizama GC u maternici u budućnosti. Stoga, kako bi se bolje istražio mehanizam, u budućim istraživanjima će se primijeniti druge tehnologije, poput proteomike.

Zaključci

Da rezimiramo, pseudociljana metabolomska metoda seruma i urina zasnovana na UPLC-QTRAP MS je uspostavljena za istraživanje mehanizama GC sličnih estrogenu, što je dalo robusne i pouzdane rezultate. Koristeći uspostavljeni pseudociljani pristup, otkriven je holistički pogled na promjene u metabolomici seruma i urina estrogenskog mehanizma (GC).

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%