Theaflavin regulirani Imd kondenzati kontroliraju crijevnu homeostazu i starenje drozofile, 2. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Pozadina:Fibroza je jedna od najčešćih patoloških karakteristika procesa starenja bubrega, a fibroza u bubrezima starenja također pogoršava proces kronične bubrežne bolesti (CKD). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) je botanička droga koja se najčešće koristi u kineskom folkloru. Međutim, nekoliko studija je prijavilo njegove farmakološke učinke. Ova studija je imala za cilj istražiti učinak ekstrakta etanola CF na fibrozu bubrega kod SAMP8 miševa i identificirati potencijalno aktivna jedinjenja.

Metode:Kao životinjski modeli korišteni su 8 miši sklone starenju s ubrzanim starenjem (SAMP8), a različite doze CF su davane putem sonde tokom jednog mjeseca. Za posmatranje stepena bubrežnog starenja kod miševa korišćenjem bojenja -galaktozidazom. Massonovo bojenje i nivoi ekspresije Col-lI, a-SMA i FN korišteni su za procjenu bubrežne fibroze kod miševa. Izmjereni su nivoi ekspresije proteina Nrf2 puta i Wnt/-catenin/RAS puta u bubrezima. I -galaktozidaza ( -gal) inducirala NRK-52E ćelije kao in vitro model za skrining aktivnih komponenti CF.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Rezultati:Ekstrakt etanola CF značajno je inhibirao aktivnost renalne galaktozidaze i nivoe ekspresije Coll, a-SMA i FNin SAMP8 miševa i poboljšao Massonovo bojenje kod SAMP8 miševa. CF je značajno smanjio urinarni protein, kreatinin, dušik uree i nivoe TNF-a i IL-1 u serumu kod SAMP8 miševa i značajno povećao nivoe SOD i GSH-Px. Štaviše, CF je aktivirao Nrf2 put i blokirao Wnt/-catenin/RAS put u bubrezima miševa. Osim toga, 3,4-dihidroksi fenil etanol (SDC-0-14,16) i (3,4-dihidroksi fenil etanol-8-O-[4-O-trans -kafeoil- -D-apiofuranozi-(1→3)- -D-glukopiranozil (1→6)]- -D-glukopiranozid (SDC-1-8) su izolovani iz CF , što je smanjilo starenje NRK-52E ćelija, a možda i aktivni sastojci CF koji igraju ulogu protiv starenja.

Zaključci:Naši eksperimenti su osvetlili da ekstrakt CF etanola može poboljšati renalnu fibrozu kod SAMP8 miševa putem Wnt/-catenin/RAS puta. A SDC-0-14,16 i SDC-1-8 mogu biti materijalna osnova za CF za ispoljavanje efekata koji se odnose na starenje bubrega.

Ključne riječi:Starenje, Corallodiscus flabellata, bubrezi, fibroza bubrega, SAMP8, starenje, Wnt/ -catenin/RAS

Uvod

Globalna prevalencija hronične bolesti bubrega (CKD) raste sa starenjem stanovništva i predstavlja značajan teret za društvo [1-3]. Najčešća patološka manifestacija CKD je neki oblik renalne fibroze[4]. Isto tako, renalna fibroza je također jedan od znakova starenja bubrega [2]. Studije su pokazale da su oksidativni stres, upala, Wnt/-katenin, renin-angiotenzin-aldosteronski sistem (RAS) i rapamicin (mTOR) signali povezani sa CKD izazvanom starenjem [5]. Bubrežna fibroza u bubrezima koji stare, usko je povezana sa aktivacijom Wnt/-katenina i RAS signalnog puta [6]. Nakon aktivacije Wnts-a, -katenin u citoplazmi se translocira u jezgro, gdje se vezuje za faktor vezivanja limfoidnog pojačivača (LEF)/faktor transkripcije T-ćelija (TCF) i pokreće transkripciju nizvodnih ciljnih gena. Zanimljivo je da promotorska regija gena RAS također sadrži LEF/TCF vezujuća mjesta, što omogućava -catenin da promovira vezivanje LEF-1 za ova mjesta[7].cistanche holesterol,Stoga bi ciljanje na signalni put Wnt/-catenin/RAS moglo biti potencijalna terapijska strategija za bubrežnu fibrozu [8,9]. Posljednjih godina, zamjenska terapija bubrežne fibroze prirodnim proizvodima privukla je pažnju mnogih naučnika [10]. . Xiaoyan Shen i saradnici su otkrili da ginsenozid Rgl poboljšava glomerularnu fibrozu tokom starenja bubrega inhibirajući aktivaciju NLRP3 inflamasoma kod SAMP8 miševa [11]. Ova studija je istraživala efekat ekstrakta C. flabellate(CF) na fibrozu bubrega kod SAMP8 miševa iz Wnt/-catenin/RAS puta.

Cistanche može protiv starenja

CF kao ljekovita biljka u Kini je prvi put zabilježena u "Dian Nan Ben Cao". Cijela biljka se obično koristi za liječenje dizenterije, prerane ejakulacije, bolesti sjemenih mjehurića i bolesti bubrega u etničkim manjinskim područjima Kine [12]. Trenutno , malo je izvještaja o CF u modernim istraživanjima Farmakološke studije u našoj laboratoriji su otkrile da ekstrakt CF ima diuretičko djelovanje i poboljšava zatajenje jetre uzrokovano lipopolisaharidom/D-galaktozaminom i oštećenje mozga kod pacova [13, 14] I fitokemijske studije na otkrilo je da su feniletanoidni glikozidi i flavonoidi glavne hemijske komponente CF [15,16] Cilj ove studije bio je istražiti učinak ekstrakta CF na bubrežnu fibrozu kod SAMP8 miševa i razjasniti njen mogući mehanizam, kako bi se osiguralo eksperimentalni dokazi za liječenje bolesti bubrega s CF opisani u drevnim knjigama.

materijali i metode

Sakupljanje i ekstrakcija biljnog materijala

"Yunnan Chinese Herbal Medicine" bilježi da se CF može sakupljati tokom cijele godine. Biljke CF korištene u ovom eksperimentu ubrane su u okrugu Xixia, provincija Henan, Kina u septembru. Identifikovao ga je profesor Suiqing Chen sa Univerziteta kineske medicine Henan, a uzorci su pohranjeni u biblioteci laboratorijskih uzoraka.nuspojave cistanche deserticolaBiljke (1 kg) su refluksovane sa 50% etanolom (3×12 L, svaki 1 h), a smeša je filtrirana sa 16 slojeva gaze. Kombinirani filtrati su osušeni rotacijskim isparavanjem upotrebom sušača smrzavanjem. Konačno, postotak prinosa 50 posto etanolnog sirovog ekstrakta CF bio je 15,5 posto. Osušeni ekstrakt čuvan je u frižideru do dalje upotrebe. Dodatni materijali navode relevantne podatke o oznaci sastojka ekstrakta CF.

U ovoj studiji je korišten još jedan proces odvajanja koji je ranije objavljen da bi se dobila elucijska frakcija vode, 20 posto eluciona frakcija etanola, 30 posto eluciona frakcija etanola i 40 posto eluciona frakcija etanola iz CF [13]. Frakcija od 40 posto etanola je odvojena korištenjem Sephadex LH-20 i kolone silika gela i pročišćena polupreparativnom tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) da bi se konačno dobila jedinjenja kao što su SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(p-hidroksi benzil alkohol).

Životinje i administracija

Šestomesečni mužjaci SAMP8 i miševi 1(SAMR1) otporni na starenje sa ubrzanim starenjem iz Prve pridružene bolnice Univerziteta tradicionalne kineske medicine u Tianjinu (Tianjin, Kina) korišćeni su u ovoj studiji. Životinje su bile smještene pod kontroliranim svjetlom (12-h svjetlo/tamni ciklus), temperaturom (23-25 stepen C) i vlažnošću (45-55 procenata) i dobile su standardnu ​​ishranu i oglas za vodu libitum. Ukupno 48 miševa SAMP8 podijeljeno je u četiri eksperimentalne grupe (n=12/grupa): SAMP8 model miševa (M), SAMP8 miševi tretirani niskim dozama ekstrakta CF etanola (CF-L, 387,5 mg/kg, intragastrično), srednjim dozama miševa SAMP8 tretiranih CF ekstraktom etanola (CF-M, 775 mg/kg, intragastrično) i SAMP8 miševa tretiranih visokim dozama ekstrakta etanola CF (CF-H,1550 mg/ kg, intragastrično). Miševi u SAMRI kontroli (Con, n=10) i SAMP8 model grupama (M) tretirani su fiziološkom otopinom (0,9 posto). Svi miševi su liječeni oralno tokom 1 mjeseca. Sve eksperimente na životinjama odobrila je etička komisija Univerziteta kineske medicine Henan i izvedena prema institucionalnim smjernicama (Henan, Kina broj odobrenja: HACTCM-2018009060-19). Tokom eksperimenta, došlo je do smrti jednog miša u svakoj od Con i M grupa, a dva miša su umrla u CF-H grupi.

Sakupljanje uzoraka

Na kraju eksperimenta, miševi su smješteni pojedinačno u metaboličke kaveze za 12-h kolekcija urina. Miševi su zatim anestezirani izofluranom, a uzorci krvi su sakupljeni retro-orbitalnim krvarenjem. Bubrezi svakog miša su zatim hirurški uklonjeni i držani na 80 stepeni do analize.

Ćelijska kultura i in vitro studija

NRK-52E ćelije kupljene od Banke ćelija Kineske akademije nauka (Šangaj, Kina) uzgajane su kako bi se istražio efekat ekstrakta CF na starenje ćelija uzrokovano D-galaktozom (D-gal, S11050, Yuanye, Šangaj, Kina). NRK-52E ćelije su uzgajane u Dulbecco-ovoj modifikaciji Eagleovog medijuma Dulbecco (DMEM,12,100,046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) snabdjevenog 10 posto fetalnog goveđeg seruma u inkubatoru na 37 stepeni C i u prisustvu procenata , CO.ćelije su uzgajane u 96-pločama ili 6-pločama za jažice do 80-85 posto konfluencije i zatim tretirane sa podlogom za rast koja sadrži različite kombinacije lijekova: Mediji plus D-gal ( 20 mg/mL）, Mediji plus D-gal plus CF (10, 25,50, 100 ug/mL) ili Medij plus D-gal plus monomerno jedinjenje (10 μM) 48 h. Nakon toga, metil tiazolil tetrazolijum( MTT) test je korišten za otkrivanje vitalnosti stanica, a bojenje -galaktozidazom je korišteno za promatranje starenja stanica.

Bojenje galaktozidazom povezano sa starenjem

Zamrznuti bubrezi miševa izrezani na 10-μm debele dijelove i NRK-52E ćelije obojeni su -galaktozidazom povezanom sa starenjem (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina) slijedeći protokole proizvođača.

Histološka analiza

Presjeci bubrega su fiksirani sa 4 posto puferovanog paraformaldehida, a 10-μm debeli parafinski dijelovi obojeni su Massonovim trihromom (G1006, Service, Wuhan, Kina) i posmatrani mikroskopski. Plavo obojene oblasti u Massonovim trihromom obojenim presecima izmerene su kvantitativno iz šest nasumično odabranih polja i analizirane pomoću softvera Image-Pro Plus 6.0.

Biohemijska merenja

Uzorci seruma i homogenata bubrega su odmrznuti do sobne temperature, a nivoi superoksid dismutaze (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Kina), glutation peroksidaze (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina), interleukin-1 (IL-1, RK00006, ABclonal, Wuhan, Kina), faktor nekroze tumora- (TNF- , RK00027, ABclonal, Wuhan, Kina), dušik uree (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina), kreatinin (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina) u serumu miša, ukupni proteini u urinu (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Kina) u urinu miša i nivoima ekspresije kolagena tipa I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Kina), -aktina glatkih mišića (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Kina), fibronektina (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Kina) u tkivima bubrega miša mjerena su uzastopno prema protokolu proizvođača kompleta za analizu.

Imunohistohemijska analiza

Imunohistohemijska analiza obavljena je rutinskom metodom [17]. Korištena antitijela uključivala su sljedeće: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin(17565-1-AP,Proteintech,Chicago, USA), receptore angiotenzina II tipa 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, SAD), p-nuklearni faktor eritroidni 2-srodni faktor 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, UK), pc-Fos(ab27793, Abcam, Cambridge, UK ), faktor rasta vezivnog tkiva (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Kina). Sekcije su posmatrane pod mikroskopom (Olimp, Tokio, Japan).cistanche dosage redditIzmjerite površinu i integrisanu optičku gustinu (IOD) područja sa ekspresijom preplanulog boje pomoću softvera Image-Pro Plus 6.0 i izračunajte srednju optičku gustinu (MOD, MOD=IOD/područje) za polu -kvantitativna analiza.

Western blot analiza

Western blot test je proveden kako je opisano u prethodnoj studiji [18]. Ukratko, tkiva bubrega su homogenizovana u puferu za lizu i kvantifikovana korišćenjem Bradfordovog kompleta za analizu proteina (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Kina). Homogenati su zatim podvrgnuti elektroforezi na natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu, prebačeni na poliviniliden fluoridnu membranu i blokirani u puferu za blokiranje (4 procenta nemasnog suvog mleka) tokom 90 minuta. Zatim su inkubirani sa primarnim antitelima (Wnt4; renin; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; Kelch-u sličan ECH povezan protein 1 (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Kina); -aktin (AC026, Abclonal, Wuhan, Kina); i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Kina)) preko noći na 4 stepena, nakon čega slijedi inkubacija sa odgovarajućim sekundarnim antitijelom konjugiranim sa fluo-prisutnošću 1 h na sobnoj temperaturi . Proteini od interesa su skenirani Odyssey IR skenerom (LI-COR Biosciences, Nebraska, SAD), a intenziteti signala su kvantificirani pomoću softvera Image Studio. Nivoi proteina su normalizovani u odnosu na -aktin ili GAPDH.

UPLC-Q-TOF-MS analiza za uzorke bubrega

Bubrežna tkiva su izvagana i homogenizovana u ledeno hladnom fiziološkom rastvoru (w/v=1:1). Zatim je 1 mL acetonitrila dodat u 200 μL uzoraka homogenata tkiva, nakon čega je uslijedila ultrazvučna ekstrakcija tijekom 30 minuta. Ekstrakt je centrifugiran na 12,000 g i 4 stepena 10 min. Supernatant je uzet u bočicu za analizu. Kromatografsko odvajanje je izvedeno na tečnoj hromatografiji ultraperformanse (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, SAD), sa LC sistemom koji se sastoji od kolone Acclaim RSLC 120 C18 (2,2 μm, 2,1×10 mm) Thermo Scientific).prednosti ekstrakta cistancheMobilna faza se sastojala od rastvarača A (acetonitril) i vode sa {{0}}.1 posto mravlje kiseline (B). Razdvajanje je izvršeno elucijom gradijenta na sljedeći način:10-70 procenat A od 0 do 3 min,70-78 procenat A od 4 do 13 min,78-90 procenat A od 14 do 15 min, 90 posto -10 posto A od 15 do 16 min, i 10 posto A od 16 do 20 min. Volumen ubrizgavanja testnog uzorka bio je 2μL. Masena spektrometrija (MS) analiza je izvršena korištenjem ESI izvora pod sljedećim uvjetima: kapilarni napon u pozitivnom modu je bio 3,5 kV, a kapilarni napon u negativnom modu bio je 3,2 kV. Pritisak nebulizatora je bio 2,0 bara, temperatura suvog gasa je bila 230 stepeni, a brzina protoka je bila 8 L/min.

Statistička analiza

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; jednosmjerna analiza varijanse korištena je za poređenje između grupa. AP vrijednost manja od 0,05 smatra se statistički značajnom.

Rezultati

CF je poboljšao starenje i fibrozu bubrega kod SAMP8 miševa

Da bi se istražio učinak CF na bubrege SAMP8 miševa, mjerena je aktivnost SA- -gal u bubrezima. Na slici la, aktivnost SA- -gal u tkivima bubrega značajno je povećana u M grupi (plavo pojačanje). Primjena CF-L i CF-M značajno je inhibirala aktivnost -galaktozidaze u bubrezima SAMP8 miševa dok poboljšanje CF-H nije bilo značajno. Takođe, indeks bubrega modelne grupe bio je značajno niži od indeksa kontrolne grupe (Sl. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

CF je poboljšao funkciju bubrega, oksidativni stres i nivoe upale kod SAMP8 miševa

Pored toga, ispitivani su indikatori bubrežne funkcije svake grupe miševa, koji su uključivali volumen urina kod miševa tokom 12 h, nivoe Cr i ureje azota u serumu, te nivoe proteina u urinu. Kao što je prikazano na slici 2a-d, nivoi proteina u urinu, Cr u serumu i azota ureje u serumu u modelnoj grupi bili su značajno viši od onih u kontrolnoj grupi (Sl. 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche genghis khanZatim je istraženo da li CF blagotvorno modulira oksidativni stres i upalu u bubrezima brzo ostarjelih miševa. Kao što je prikazano na slici 2e-h, nivoi SOD i GSH-Pxin u bubrezima M grupe su bili značajno niži od onih u Con grupi, a nivoi IL-1 su bili značajno viši od onih u Con group. Nakon tretmana CF, gore navedeni pokazatelji su poboljšani, a posebno je bolji efekat poboljšanja CF-L i CF-M.

CF je aktivirao Nrf2 put u bubrezima SAMP8 miševa

Nivo ekspresije p-Nrf2 meren je u tkivima bubrega da bi se ispitalo da li je put Nrf2 uključen u zaštitni efekat CF (Slika 3a-c) u ovoj studiji. Nivo ekspresije p-Nrf2 značajno je smanjen samo u SAMP8 grupi (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF oslabljen Wnt/-catenin/RAS signalna aktivacija u bubrezima SAMP8 miševa

U cilju daljeg istraživanja potencijalnog mehanizma CF koji ima antifibrozni efekat. Lokalizacija proteina izvršena je imunohistohemijskim ispitivanjem. Kao što je prikazano na slici 4a, nivo ekspresije Wnt4 i

-katenin je induciran pretežno u bubrežnim tubularnim ćelijama. Slični rezultati su uočeni kada su AGTR1, ciljevi nizvodnog puta Wnt signalizacije, procijenjeni (slika 4a). Nakon toga je kvantificiran nivo ekspresije proteina, a rezultati su pokazali da su proteini Wnt4, -katenin, renin i AGTR1 akumulirani u tkivu bubrega miševa u modelnoj grupi, dok je CF značajno inhibirao te promjene (slika 4b-f ). Nadalje, lociran je i kvantitativno analiziran nivo ekspresije CTGF-a. U skladu sa gore navedenim rezultatima, CTGF je uglavnom bio eksprimiran u bubrežnim tubulima, a CF je značajno inhibirao aktivnost CTGF (Slika 4d g).

CF i njegova jedinjenja inhibirali su starenje NRK-52E ćelija izazvano D-gal

NRK-52E ćelije izazvane D-galom korištene su za skrining određenih aktivnih sastojaka u CF, da bi se utvrdila materijalna osnova za liječenje senilnih bubrega ekstraktom CF. Rezultati su pokazali da CF povećava vitalnost stanica na način ovisan o dozi i spojevima

SDC-0-14,16 i SDC-1-8 izolovani iz CF imali su bolje efekte na proliferaciju ćelija. Osim toga, 25 ug/mL CF i jedinjenja SDC-0-14,16 i SDC-1-8 svi su pokazali efekat inhibicije aktivnosti -galaktozidaze (Sl.5).

CF poboljšana PCA analiza tkiva bubrega kod SAMP8 miševa Urađena je analiza glavnih komponenti (PCA) kako bi se istražili efekti CF na SAMP8 miševe. Kao što je prikazano na slici 6a, postojalo je očigledno grupisanje između kontrolne i modelske grupe (R2X=0.542; Q2=0.38), što sugerira da su endogeni metaboliti SAMP8 miševa različiti od SAMR1 miševa, što uzrokuje njihovo odstupanje od SAMR1 grupe. Kao što je prikazano na slici 6b, različite CF grupe su se takođe grupirale u različite klase iz kontrolne grupe i grupe modela, a grupe CF su se približile kontrolnoj grupi, što ukazuje da

endogeni metaboliti SAMP8 miševa sa CF-om bili su slični onima kod SAMR1 miševa.

Diskusija

Starenje igra važnu ulogu u napredovanju CKD [19]. Kako fibroza CKD napreduje, stare ćelije eksprimiraju i luče profibrotičke faktore (TGF-, CTGF i tako dalje) i proinflamatorne faktore (IL-1, IL-6, TNF- i tako dalje ), koji su sekretorni fenotipski faktori povezani sa starenjem, čime se ubrzava bubrežna fibroza [20, 21]. Trenutno je tradicionalna kineska medicina postigla dobre rezultate u liječenju renalne fibroze s manje nuspojava [22]. Ova studija je istraživala interventne efekte ekstrakta CF na fibrozu bubrega kod SAMP8 miševa. Soj miša odabran za ovu studiju bio je SAMP8, koji je razvijen na osnovu životnog vijeka, starenja i patoloških fenotipskih ocjena AKR/ miševa i bio je model ubrzanog starenja isključivo genetskog porijekla [23,24]. Istraživanja su pokazala da promjene u bubrežnoj patologiji SAMP8 miševa (9 mjeseci) uključuju tubulointersticijsku fibrozu i fokalnu segmentalnu glomerulosklerozu [25]. Utvrđeno je da je bubrežna fibroza kod SAMP8 miševa povezana sa uzrastom [6]. Stoga smo testirali aktivnost -galaktozidaze i

nivo renalne fibroze kod SAMP8 miševa i otkrili da CF-L i CF-M poboljšavaju fibrozu bubrega i aktivnost -galaktozidaze kod SAMP8 miševa (Sl.1). Testirali smo i izlučivanje urina kod miševa. U skladu s prethodno objavljenim studijama koje su pokazale da CF dobiven dvama različitim procesima ima diuretičke efekte [13], ekstrakt značajno povećava volumen urina kod SAMP8 miševa. Takođe, ova studija je pokazala da suplementacija sa CF poboljšava bubrežnu funkciju, aktivnost antioksidativnih enzima i nivoe inflamatornih faktora kod SAMP8 miševa (Sl.2).

Keap1-Nrf2 sistem je privukao pažnju mnogih naučnika posljednjih godina zbog svojih antioksidativnih i antiinflamatornih svojstava. Njegov farmakološki potencijal u liječenju bubrežnih bolesti opsežno je proučavan u nekliničkim i kliničkim studijama [26]. Nrf2 je glavni regulator transkripcije za gene povezane sa redoks statusom i antioksidativnim efektima [27]. Studije su pokazale da je fosforilacija potrebna za aktivaciju Nrf2 i indukciju ciljnog gena [28]. Aktiviranje Nrf2 poboljšalo je napredovanje CKD-a sprečavanjem oksidativnog stresa i održavanjem ćelijske redoks homeostaze [29]. Kao ključni faktor transkripcije, Nrf2 igra ključnu ulogu u obrani od oksidativnog stresa regulacijom svojih nizvodnih antioksidansa i enzima za detoksikaciju [30]. Kim et al. izvijestili su da resveratrol, kao moćan aktivator Nrf2, ublažava progresivno oštećenje bubrega povezano sa starenjem [31]. U ovoj studiji, CF je poboljšao slabljenje Nrf2 u bubrezima SAMP8 miševa bez uticaja na nivo ekspresije Keapl, što sugeriše da CF sirovi ekstrakt može poboljšati oksidativno oštećenje u bubrezima aktivacijom Nrf2 puta (slika 3).

Renalnu fibrozu karakterizira prekomjerno taloženje ekstracelularnog matriksa (ECM) što dovodi do stvaranja ožiljaka u bubrežnom parenhima [32]. Smatra se da je transformirajući faktor rasta (TGF- ) ključni citokin u hiperaktivaciji fibroblasta [33, 34]. Naravno, ciljanje samo na TGF-signalni put nije dovoljno za smanjenje bubrežne fibroze. Neke studije su pokazale da su CTGF, Wnt/-katenin, sistem renin-angiotenzin, oksidativni stres, i tako dalje, umiješani u fibrozu bubrega [35-37]. Wnt/-katenin je evolucijski očuvan signalni put uključen u regulaciju homeostaze tkiva, razvoj organa i popravku ozljeda[38]. Cisternas et al. raspravljali su o profibroznom efektu Wnt signalizacije iu skeletnim mišićima i u bubrezima [39]. Sve više dokaza je pokazalo da signalni put Wnt/-catenin igra ključnu ulogu u regulaciji razvoja i progresije bubrežnih fibroznih lezija nakon ozljede [40-42]. Signal Wnt/-catenin je relativno tih u bubrezima zdravih odraslih osoba i aktivira se nakon što su bubrezi podvrgnuti različitim vrstama oštećenja [43].

Kod sisara, porodica Wnt ima najmanje 19 članova porodice kritičnih za razvoj bubrega. I najmanje 15 od ovih članova porodice je različito regulirano u bubrezima koji stare, uključujući Wnt4 [6]. Rezultati ove studije su pokazali da je nivo ekspresije Wnt4 proteina u bubrezima SAMP8 miševa bio značajno veći nego kod SAMR1 miševa, što je potvrđeno i Western blot i imunohistohemijskim analizama (sl. 4a, d i f). Slučajno, nivo ekspresije proteina -katenin je takođe povećan. Takođe, i Wnt4 i -katenin su eksprimirani u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama, što je otkriveno imunohistohemijskom analizom (sl.4a i f). Wnt/-katenin je izazvao fibrozu bubrega indukcijom više fibrogenih gena kao što su komponente RAS, matriks metaloproteinaza-7 (MMP-7), inhibitor aktivatora plazminogena 1 (PAI-1) i puž [37 ]. Zhou et al. opisao je Wnt/-katenin kao glavni uzvodni regulator, koji kontroliše ekspresiju svih testiranih komponenti RAS u bubrezima [44]. Zhou et al. koristili su model štakora 5/6 nefrektomije (5/6 NX) kako bi pokazali nivoe ekspresije glavnih komponenti RAS-a u mozgu i bubrezima, kao što su angiotenzinogen, enzim koji konvertuje angiotenzin i angiotenzin II AT{{25 }}receptor je značajno povećan. Povećani nivo ekspresije bio je inhibiran centralnim blokatorom Wnt, koji je bio adeno-povezani virusni vektor koji prekomjerno eksprimira DKK1 gen [45]. Slično, ova studija je otkrila da je AGTR1 još uvijek eksprimiran u bubrežnom tubularnom epitelu, a nivoi ekspresije renina i AGTRl u tkivima bubrega SAMP8 miševa bili su značajno veći od onih kod SAMR1 miševa (sl. 4a i dg). Ovi rezultati su pokazali da je signalni put Wnt/-catenin/RAS aktiviran u bubrezima SAMP8 miševa, a CF je efikasno inhibirao aktivaciju ovog puta.

CTGF ima višestruke biološke funkcije, uključujući promociju mitoze hemotaktičkih ćelija, indukciju adhezije i promociju ćelijske proliferacije i sinteze ECM [35,46]. CCN2(CTGF) je modulirao Wnt signalizaciju vezivanjem za protein 5/6 povezan sa receptorom lipoproteina niske gustine (LRP5/6) kako bi dalje posredovao u fibrozi [39, 47]. Druge studije su koristile utišavanje gena kako bi otkrile i potvrdile da Nrf2 reguliše Wnt put regulacijom nivoa ekspresije CTGF-a, utičući na bubrežnu intersticijsku bolest. Takođe, Nrf2 je regulisao nivo transkripcije CTGF uglavnom preko CTGF transkripcionog regulatora c-Fos [48]. Imunohistohemijska analiza je otkrila da su CTGF i pc-Fos eksprimirani uglavnom u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama, a pc-Fos su takođe raspoređeni u glomerulima. Kvantitativna analiza je pokazala da su nivoi ekspresije oba proteina inhibirani CF (slike 3b i e i 4a i c). Konačno, PCA analiza je korištena za daljnju potvrdu da je CF poboljšao oštećenje bubrega kod SAMP8 miševa (slika 6). Ova studija je pružila dokaze da CF ne samo da je aktivirao Nrf2 signalizaciju već se i oslanjao na Nrf2 da uravnoteži oksidativni stres i upalu, inhibirao Wnt/-catenin/RAS signalizaciju i poboljšao starenje bubrega i bubrežnu fibrogenezu. Međutim, također smo otkrili nekonzistentno poboljšanje u efektu CF na Massonovo i SA{27}}gal bojenje u ovom eksperimentu. Nagađa se da bi to moglo biti zbog nedosljednog napredovanja bubrežnog starenja i renalne fibroze kod SAMP8 miševa. Stepen starenja bubrega kod miševa u ovom eksperimentu može biti ozbiljniji od fibroze. Stoga, poboljšanje efekta CF-H na starenje bubrega kod SAMP8 miševa nije bilo tako očigledno kao kod renalne fibroze.

Kao redukcijski monosaharid, D-galaktoza se široko koristi kod raznih bolesti povezanih sa starenjem in vivo i in vitro. Utvrđeno je da D-gal uzrokuje starenje i ozljede u NRK-52E ćelijama [49], inducira starenje proksimalnih tubularnih epitelnih ćelija ljudskog bubrega (HKC-8 ćelije) i povećava nivoe ekspresije dvaju bubrežnih proteini markeri fibroze FN i a-SMA [6]. U ovoj studiji, D-gal je korišten za indukciju NRK-52E ćelija in vitro. Koristeći MTT test i bojenje -galaktozidazom za otkrivanje jedinjenja izolovanih iz CF, otkriveno je da SDC-0-14,16 i SDC-1-8 poboljšavaju vitalnost ćelija izazvanu D-gal i inhibiraju D-gal-indukovanu ćelijsko starenje (Sl.5). Ovo sugerira da SDC-0-14,16 i SDC-1-8 mogu biti materijalna osnova za CF za odlaganje starenja bubrega. SDC-1-8 je jedan od feniletanoidnih glikozida. Utvrđeno je da feniletanoidni glikozidi produžuju životni vijek Caenorhabditis Elegans [50], sa anti-aging efektima [51] i neuroprotektivnim efektima [52-54]. Oni daju smjernice za našu daljnju studiju o farmakološkim efektima CF.

Zaključci

U zaključku, in vivo studije su pokazale da CF smanjuje fibrozu bubrega kod starijih miševa. Neki potencijalni aktivni sastojci pronađeni su in vitro eksperimentima. Ovi nalazi su pružili farmakološku podršku za liječenje bolesti bubrega primjenom CF i smjer za daljnja istraživanja aktivnih sastojaka CF.

Ovaj članak je preuzet iz Cao et al. BMC komplementarna medicina i terapije (2022) 22:52