Tirozin kinaza C-Abl pojačava antivirusni imunitet posredovan interferonom putem STAT1 fosforilacije
Nov 06, 2023
SAŽETAK
Interferonom (IFN) indukovana aktivacija transduktora signala i aktivatora porodice transkripcije (STAT) je važan događaj u antivirusnom imunitetu. Ovdje pokazujemo da nereceptorske kinaze c-Abl i Arg direktno stupaju u interakciju sa STAT1 i potenciraju fosforilaciju STAT1 na Y701. c-Abl/Arg bi mogao posredovati fosforilaciju STAT1 nezavisno od Janus kinaze u odsustvu IFNg i potencirati fosforilaciju STAT1 posredovanu IFNg. Štaviše, STAT1 dimerizacija, nuklearna translokacija i nizvodna transkripcija gena su regulirani c-Abl/Arg. Nedostatak c-Abl/Arg (abl1/abl2) značajno potiskuje antivirusne odgovore u ćelijama inficiranim virusom vezikularnog stomatitisa. U poređenju sa nosačem, primena c-Abl/Arg selektivnog inhibitora AMN107 je rezultirala značajno povećanom smrtnošću kod miševa inficiranih virusom humane gripe. Naša studija pokazuje da c-Abl igra bitnu ulogu u signalnom putu aktivacije STAT1 i pruža važan pristup regulaciji antivirusnog imuniteta.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
UVOD
Interferoni (IFN) igraju ključnu ulogu u urođenom imunitetu protiv virusne infekcije i imunološkom nadzoru regulacijom aktivacije Janus kinaza (JAK) i transduktora signala i aktivatora transkripcije (STAT) i reprogramiranjem ekspresije ćelijskih gena (Stark i Darnell, 2012). Vezivanje IFN-a za njihove odgovarajuće receptore rezultira unakrsnom fosforilacijom tri povezana JAK-a (JAK1, JAK2 i TYK2) i regrutacijom STAT-ova, omogućavajući da JAK fosforiliraju pojedinačne ostatke tirozina blizu C-terminalnih krajeva ovih STAT-ova. (Platanias, 2005). Aktivirani STAT se zatim dimeriziraju, migriraju u jezgro i vezuju se za promotore gena koji reagiraju na IFN kako bi indukovali njihovu transkripciju. Tirozinska fosforilacija STAT je bitan korak u JAK-STAT putu IFN signalizacije i uključena je u STAT dimerizaciju, nuklearnu translokaciju i vezivanje DNK (Stark i Darnell, 2012). Dakle, fosforilacija tirozina funkcionira kao STAT aktivacijski prekidač. Dokazi dobiveni ciljanim prekidom gena JAK kod miševa sugeriraju da su JAK najvažnije STAT tirozin kinaze (Villarino et al., 2017). Međutim, pokazalo se da su ostaci tirozina u STAT1, STAT3 i STAT5 fosforilirani u ćelijama sa nedostatkom JAK epidermalnim faktorom rasta i receptorima faktora rasta koji potiču od trombocita sa intrinzičnom aktivnošću tirozin kinaze (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). Osim toga, konstitutivna aktivacija STAT-ova primijećena je u transformiranim stanicama koje eksprimiraju onkogene tirozin kinaze kao što su v-Src, v-Abl i BCR-Abl, ali ostaje da se utvrdi da li su STAT direktni supstrati ovih kinaza (Danial i Rothman , 2000; Reddy et al., 2000). Abelsonova kinaza c-Abl kod sisara koju kodira c-abl (abl1) gen i Abl genski protein Arg kodiran genom arg (abl2) članovi su porodice intracelularnih nereceptorskih tirozin kinaza koje su potrebne za višestruke ćelijske procese, uključujući proliferaciju, apoptozu, adheziju, migraciju ćelija i odgovore na stres (Bradley i Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). Aktivnost kinaze c-Abl je strogo regulisana u normalnim fiziološkim uslovima. Retrovirusna transdukcija i događaji hromozomske translokacije dovode do ekspresije v-Abl ili BCR-Abl, onkogenog oblika Abl, respektivno (Advani i Pendergast, 2002). Osim toga, ciljana delecija c-abl gena kod miševa rezultira pleiotropnim fenotipovima povezanim s imunološkom disfunkcijom, uključujući visoku perinatalni letalitet, atrofiju slezene i timusa, limfopeniju i povećanu osjetljivost na infekciju (Schwartzberg et al., 1991.). Štoviše, liječenje BCR-Abl-pozitivne kronične mijeloidne leukemije (CML) sa Abl inhibitorima STI571 (imatinib) i AMN107 (nilotinib) povezano je sa imunosupresijom u podskupini pacijenata (Dietz et al., 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Prethodne studije su pokazale da cAbl igra ulogu u regulaciji transdukcije signala posredovane TCR (receptor T ćelija) i BCR (receptor B ćelija), razvoju, proliferaciji i proizvodnji citokina (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002 Silberman et al., 2008.). Miševi s nedostatkom Abl također pokazuju smanjeni broj T/B ćelija (Gu et al., 2009; Liberatore i Goff, 2009; Schwartzberg et al., 1991). Međutim, mehanizmi koji leže u osnovi oslabljenog imuniteta koji nastaju u odsustvu ili inhibiciji c-Abl ostaju nedostižni. Široko je objavljeno da je JAK-STAT signalni put bitan za transformaciju izazvanu BCR-Abl (Carlesso et al., 1996; Danial et al., 1998; de Groot et al., 1999). Stoga je vrijedno istražiti da li JAK-STAT također može doprinijeti urođenom imunitetu uzrokovanom c-Abl. Ovdje izvještavamo da STAT1 stupa u interakciju sa c-Abl i fosforilira ga c-Abl na JAK-neovisan način, kojim se reguliraju dimerizacija, nuklearna lokalizacija i nizvodna transkripcija gena STAT1. Ovi nalazi su otkrili da je, pored JAK kinaze, c-Abl neophodan za potpunu aktivaciju STAT1 i naknadne antivirusne odgovore posredovane IFN-om.
Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem
Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity
【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
REZULTATI
Transkripcija nizvodnih gena aktivirane gama interferonom regulirana je Abl kinazom
Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 su identifikovana u c-abl/arg dvostrukim nokautima (DKO) i WT MEF-ovima, od kojih je 960 regulirano naviše, a 784 na niže (Slika 1A, lijevo). Da bismo dalje istražili potencijalne ćelijske funkcije i povezane puteve ovih DEG-ova, izvršili smo analizu genske ontologije (GO) (za termine u biološkom procesu, molekularnoj funkciji i ćelijskoj komponenti) (slika S1A). Geni smanjeni regulacijom c-Abl i Arg uglavnom su bili povezani sa odgovorima odbrane virusa (GO: 0009615, GO: 0051607 i GO: 0045071) i imunološkim odgovorima (GO: 0002376, GO: 0045087). Dalja analiza je pokazala da su geni specifični za IFN (Liu et al., 2012) bili obogaćeni među smanjenim genima (Slike 1A, desno i S1B). Da bi se potvrdili profili diferencijalne ekspresije, nivoi transkripta antivirusnih gena, uključujući cxcl10, psmb9, tap1 i isg15, određeni su kvantitativnim testovima lančane reakcije polimeraze reverzne transkripcije u realnom vremenu (RT-PCR) i normalizovani na nivoe psma5 , koji nije visoko reguliran c-Abl. U poređenju sa WT MEF-ovima, c-abl / arg / MEF-ovi su pokazali značajno niže nivoe transkripta ovih gena, ali DKO-indukovana smanjenja su potpuno preokrenuta spasavanjem c-Abl na način ovisan o dozi (Slike 1B i S1C). Ovi podaci sugeriraju da je panel IFN-induciranih gena reguliran c-Abl i Arg. Da bi se istražili ključni elementi transkripcije regulisane Abl kinazama kao odgovor na IFN, konstruisan je reporterski sistem luciferaze na osnovu tap1/psmb9 zajedničkog dvosmernog promotora regulisanog IFNg (slika 1C). Kao što se očekivalo, c-Abl/Arg-selektivni inhibitor AMN107 značajno je inhibirao transkripcionu aktivnost promotora tap1 (crveno) (slika 1D). Primjetno, za razliku od delecije elemenata koji djeluju na NFkB (plavi) ili IFN konsenzus sekvence (žuti), tretman AMN107 je imao malo ili nimalo efekta na aktivnost promotora tap1 kada je element gama aktivirane sekvence (GAS) (zeleni) obrisan (Slika 1D ). Ovi nalazi ukazuju da je STAT1-ciljani GAS cis-element uključen u c-Abl reguliranu tap1 transkripciju, što snažno sugerira da je STAT1 odgovoran za c-Abl posredovanu regulaciju ekspresije gena koja reagira na IFN.
c-Abl direktno komunicira sa STAT1
IFN-indukovana ekspresija TAP1 regulisana je c-Abl, verovatno preko STAT1, što sugeriše da STAT1 može biti povezan sa c-Abl. Da bi se potvrdila ova hipoteza, lizati MCF-7 ćelija su podvrgnuti anti-c-Abl imunoprecipitaciji nakon čega je uslijedilo imunoblotiranje s anti-STAT1 antitijelom. STAT1 je bio prisutan u anti-c-Abl, ali ne i IgG imunoprecipitatima (slika 2A). Zatim, 293T ćelije su kotransficirane sa Myc-cAbl i Flag-STAT1 ili Flag-Vector kao kontrolom. Prisustvo Myc-c-Abl u anti-Flag imunoprecipitatima pripremljenim od ćelija koje koeksprimiraju Flag-STAT1, ali ne i Flag-Vector, pokazalo je povezanost između ektopično eksprimiranog Myc-c-Abl i Flag-STAT1 (slika 2B, lijevo). Sličan rezultat je također dobiven u recipročnom eksperimentu (slika 2B, desno). Štaviše, drugi član porodice Abl, Arg (Abl2), koji je visoko homologan c-Abl u svom N-terminalnom domenu (NTD), takođe je stupio u interakciju sa STAT1 (slika S2A).
Slika 1. c-Abl reguliše promotere gena koji reaguju na IFN preko GAS elemenata
Zatim, lizati pripremljeni od 293T ćelija koje eksprimiraju Flag-c-Abl inkubirani su sa GST-STAT1 ili samo GST konjugiranim agarozom, a Flag-c-Abl je detektovan u GST-STAT1, ali ne i u GST adsorbatima (Slika 2C). Da bi se isključilo indirektno vezivanje posredovano drugim komponentama u ćelijskim lizatima, anti-Flag imunoprecipitati pripremljeni od 293T ćelija koje eksprimiraju Flag-c-Abl podvrgnuti su SDS-PAGE (elektroforezi u gelu natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid), a proteini su prebačeni u PVDF (poliviniliden fluorid) membranu i zatim blotirati rastvorljivim GST-STAT1 ili GST (kao kontrola). Rezultati su pokazali da GST-STAT1, ali ne i GST, vezuje c-Abl direktno in vitro (slika 2D). Da bi se definirao c-Abl-vezujući domen, agarozno-konjugirani i GST-fuzionirani STAT1 pune dužine ili skraćeni STAT1 (slika 2E, gornji panel) su inkubirani sa lizatima 293T ćelija koje eksprimiraju Flag-c-Abl. Analiza adsorbata imunoblotiranjem sa anti-Flag antitijelom pokazala je da su aminokiseline 577-750 STAT1, koje čine regiju koja sadrži SH2 domen i domen transaktivacije, odgovorne za c-Abl interakciju (slika 2E, donji panel) . Slično, Flag-STAT1 imunoprecipitiran anti-Flag antitelom je frakcionisan pomoću SDS-PAGE i prebačen na PVDF membranu. Zatim je membrana blotirana rastvorljivim GST-c-Abl SH3 ili GST-c-Abl SH2 i samo GST. Rezultat je pokazao da je c-Abl SH3 domen glavni domen odgovoran za STAT1 asocijaciju (slika 2F). Nadalje, in situ interakcija endogenog c-Abl sa STAT1 procijenjena je Duolink proximity ligation testom (PLA). STAT1:c-Abl kompleksi su uočeni uglavnom u citoplazmi, a formiranje ovih kompleksa je značajno potencirano stimulacijom IFNg (Slika 2G). Zajedno, ovi nalazi pokazuju direktnu povezanost između c-Abl i STAT1 i in vitro i in vivo.
Slika 2. c-Abl je u interakciji sa STAT1
c-Abl posreduje fosforilaciju nezavisnu od JAK STAT1
Da bi se istražilo da li je STAT1 supstrat c-Abl, pročišćeni His-označeni STAT1 je inkubiran sa rekombinantnim c-Abl (koji sadrži katalitički domen na amino kiselinama 237-643) u prisustvu ATP-a za in vitro test kinaze. Imunoblotiranje produkta reakcije sa anti-fosfo-tirozinom i anti-fosfo-STAT1 Y701 pokazalo je da je STAT1 direktno fosforiliran c-Abl na ostatku(ima) tirozina, uključujući Y701, in vitro (Slika 3A). Zatim smo otkrili da je Flag-STAT1 eksprimiran u 293T ćelijama fosforiliran tirozinom, posebno na ostatku Y701, pomoću Myc-c-Abl, ali ne i mutanta Myc-c-Abl (K290R) neaktivnog kinaze. Nadalje, nakon tretmana sa c-Abl/Arg-selektivnim inhibitorom AMN107, c-Abl posredovana STAT1 fosforilacija je skoro eliminirana, što ukazuje da fosforilacija tirozina STAT1 ovisi o aktivnosti c-Abl kinaze (slika 3B). Fosforilacija STAT1 posredovana c-Abl bila je značajno poremećena kada je STAT1 Y701 zamijenjen fenilalaninom, što ukazuje da je Y701 glavni fosfozit Abl (slika 3C). Štaviše, STAT1 je takođe fosforiliran Arg (Slika S2B). Da bi se dalje ocrtali specifični STAT1 ostaci fosforilisani sa c-Abl, Flag-STAT1 koeksprimiran sa Myc-c-Abl je podvrgnut tečnoj hromatografiji zajedno sa analizom tandem masene spektrometrije. Pored dobro definiranog i funkcionalno važnog STAT1 fosfozita Y701 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993), dva druga fosfozita, Y106 i Y665, također su identificirana (Slika S4A). U poređenju sa WT STAT1, i Y106F i Y701F mutanti su pokazali kompromitovanu fosforilaciju tirozina (Slika 3C). Međutim, fosforilacija Y106 i Y665 nije značajno uticala na fosforilaciju STAT1 Y701, što ukazuje da Y106 i Y665 mogu igrati različite uloge (Slika S4B). Zajedno, ovi nalazi ukazuju na to da tirozinski ostaci STAT1, uključujući prethodno prijavljeni ostatak Y701, mogu biti fosforilirani kinazama porodice Abl.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
JAK su primarno odgovorni za fosforilaciju STAT1 Y701 izazvanu IFN-om (Villarino et al., 2017). Kao što se očekivalo, STAT1 Y701 fosforilacija je indukovana IFNg i značajno je inhibirana ruksolitinibom, bispecifičnim inhibitorom JAK1 i JAK2 (slika 3D). Značajno, kompromitovana fosforilacija Y701 je također uočena nakon inhibicije Abl (Slika 3D, traka 4), što ukazuje da c-Abl djelimično doprinosi IFNg-indukovanoj STAT1 aktivaciji. Nadalje, STAT1 Y701 fosforilaciju je također inducirao DPH, ćelijski permeabilni c-Abl aktivator, u manjoj mjeri nego IFNg, koji bi mogao biti potpuno poništen pomoću AMN107 (Slika 3E). Da bi se potvrdila aktivacija Abl izazvana DPH, također je otkrivena fosforilacija c-Abl Y412, indikator aktivacije Abl (Slika 3E). Pokazano je da se aktivacija JAK2 javlja prva i da je potrebna za naknadnu aktivaciju JAK1 (Briscoe et al., 1996). Da bismo isključili efekat JAK2 na STAT1 aktivaciju, uspostavili smo jak2-KO MCF-7 ćelijsku liniju putem CRISPR-a. Smanjena, ali detektiva STAT1 Y701 fosforilacija je uočena u jak2-KO MCF-7 ćelijama u poređenju sa onom u roditeljskim MCF-7 ćelijama, koja bi mogla biti na sličan način pojačana u prisustvu Myc-c-Abl ali ne i Myc-c-Abl (K290R) (slika 3F) i dodatno je smanjen nakon tretmana AMN107. U c-abl/arg/ćelijama, IFNg-indukovana fosforilacija STAT1 na Y701 bila je u velikoj mjeri ugrožena na način ovisan o vremenu i dozi (slika 3G). Sva ova zapažanja pokazuju da c-Abl kinaza može direktno fosforilirati i aktivirati STAT1 nezavisno od IFNg-JAK signalnog puta i da, što je važno, ove dvije kinaze mogu imati sinergističke efekte na fosforilaciju STAT1 na Y701.
Slika 3. STAT1 je fosforiliran sa c-Abl
Slika 4. c-Abl potiče formiranje STAT1 dimera i nuklearni uvoz
c-Abl posredovana fosforilacija reguliše aktivnost transaktivacije STAT1
Tirozinska fosforilacija STAT je bitan korak u JAK-STAT putu IFN signalizacije i uključena je u STAT dimerizaciju, nuklearnu translokaciju i vezivanje DNK. Da bi se istražilo da li c-Abl posredovana fosforilacija reguliše STAT dimerizaciju, GFP-STAT1 i Flag-STAT1 su koeksprimirani u 293T ćelijama u prisustvu ili odsustvu Myc-c-Abl. Nivoi GFP-STAT1 u anti-Flag imunoprecipitatima su ispitani kako bi ukazali na dimerizaciju STAT1. Kao što je prikazano na slici 4A, koekspresija c-Abl potencira formiranje STAT1-STAT1 homodimera. Imunofluorescentna mikroskopija MCF-7 ćelija dalje je pokazala da ablacija c-abl/arg ili tretman sa AMN107 značajno poremeti IFNg-indukovanu STAT1 nuklearnu translokaciju (Slike 4B i 4C).
Nadalje, eseji pomaka elektromobilnosti korišteni su za analizu aktivnosti vezivanja promotora STAT1. Biotinom označen IRF1 promotorski region koji sadrži konsenzusnu sekvencu vezivanja STAT1 korišćen je kao sonda za detekciju (Aaronson i Horvath, 2002). Ova sonda je inkubirana sa nuklearnim ekstraktima iz 293T ćelija koje egzogeno eksprimiraju STAT1 sa ili bez c-Abl, koji je uravnotežen na osnovu slike S5A. Kao što je prikazano na slici 4D, brojni kompleksi vezani za IRF1 sondom koji sadrže STAT1 uočeni su u nuklearnim ekstraktima (slika 4D, traka 1). Formiranje kompleksa se neznatno povećalo sa tretmanom IFNg (slika 4D, traka 2) i značajno se povećalo u ćelijama koje ektopično eksprimiraju c-Abl (slika 4D, traka 3). Međutim, u poređenju sa WT STAT1, c-Abl je pokazao mali ili nikakav efekat na vezivanje promotora STAT1 koji sadrži Y701F (Slika 4D, trake 7 i 8), dok mutacije Y106F i Y665F nisu pokazale skoro nikakvu razliku sa WT STAT1. Specifičnost kompleksa koji sadrže STAT1 i sondu za detekciju potvrđena je dodavanjem neoznačene konkurentske sonde (slika 4D, traka 9). Štaviše, dodavanje anti STAT1 antitijela je rezultiralo formiranjem superpomaknute trake (Slika 4D, traka 11). Kada su označene sonde inkubirane sa nuklearnim ekstraktima 293T ćelija kao kontrola, nisu uočeni nikakvi kompleksi (Slika 4D, traka 10). Ovi rezultati pokazuju da c-Abl posredovana STAT1 Y701 fosforilacija potencira vezivanje STAT1 sa njegovim ciljnim promotorima.
Slika 5. c-Abl reguliše ekspresiju gena vezanu za IFN
Zatim je IFNg-indukovana transaktivacija glavnih STAT1-reguliranih gena, uključujući ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 i tap1, procijenjena u WT ili c-abl/ arg DKO MCF-7 ćelije putem RT-PCR. Kao što se i očekivalo, transkripcija gena je bila značajno poremećena smanjenjem c-abl/arg (slika 5A). Štaviše, geni koji su tipično inducirani IFNg i IFNa nisu uspjeli biti stimulirani IFN-ima u prisustvu AMN107 (Slike 5B i 5C). Ovi nalazi pokazuju da je aktivnost transaktivacije STAT1 pozitivno regulirana c-Abl.
c-Abl potiče antivirusne efekte zavisne od IFN-a
TAP1 i PSMB9 su uključeni u proizvodnju i prezentaciju peptida u putu obrade antigena MHC klase I (Ghannam et al., 2014; Vitale et al., 1998). U skladu sa prethodnim nalazima, prezentacija antigena ovalbumina od strane JAWS II ćelija u B3Z ćelijama bila je značajno potisnuta od strane AMN107 zbog smanjene proizvodnje IL2 (slika 6A). Da bi se dalje procijenile antivirusne biološke posljedice STAT1 regulacije pomoću c-Abl, WT i c-abl / arg / MEF-ove prethodno tretirane sa ili bez serijski razrijeđenog IFNg inficirane su virusom vezikularnog stomatitisa (VSV). VSV infekcija izazvala je težu ćelijsku smrt u c-abl / arg / MEF-ovima i WT ćelijama tretiranim AMN107 nego u WT MEF-ovima tretiranim nosačima (Slika 6B). Tretman IFNg je značajno smanjio ćelijsku smrt uzrokovanu virusnom infekcijom, ali je imao daleko manje izražen učinak u prisustvu AMN107. U skladu sa ovim nalazom, ablacija c-abl/arg u MEF-ovima rezultirala je neosjetljivošću na stimulaciju IFN-om, ali je ovaj efekat značajno poništen spašavanjem c-Abl (Slika 6B). Zatim, ćelije A549 tretirane sa ili bez AMN107 bile su inficirane virusom Newcastle bolesti (NDV) koji eksprimira GFP, a rezultati su otkrili da je replikacija virusa također potencirana tretmanom AMN107, ali potisnuta ekspresijom c-Abl (slika 6C). U skladu sa nalazom da transfekcija DNK dovodi do aktivacije endogenog IFN odgovora (Park et al., 2003), transfekcija pcDNA vektorom inhibira proliferaciju virusa. Značajno je da je transfekcija sa Flag-c-Abl rezultirala izraženijim inhibitornim efektom na proliferaciju virusa nego transfekcija praznim vektorom (slika 6C). Nadalje, liječenje IFNg-om je imalo mali, ako ga uopće imalo, efekta na virusnu infekciju u prisustvu c-Abl-selektivnog inhibitora AMN107 (slika 6D). Ovi podaci sugeriraju da c-Abl igra važnu ulogu u STAT1-posredovanim antivirusnim efektima. Zatim smo istraživali uloge c-Abl u virusnoj infekciji kod call/fl, Lck-Cre (c-abl-conditional nockout, c-abl-cKO) miševa, kod kojih je c-abl bio specifično nokautiran u timocitima (slika S7A ) budući da nokautiranje gena c-abl zametne linije dovodi do trčanja i smrti u prve dvije sedmice nakon rođenja (Koleske et al., 1998; Schwartzberg et al., 1991). Zatim su WT i c-abl-cKO miševi intranazalno inficirani virusom influence A (IAV). Uočen je statistički neznatan veći mortalitet među c-abl-cKO miševima nego među WT miševima. WT miševi kojima je kontinuirano davan AMN107, koji sistematski potiskuje c-Abl/Arg kinaze u svim tkivima, pokazali su značajno povećanu osjetljivost na IAV (Slika 6E). Zajedno, ovi nalazi ukazuju da je c-Abl potreban za antivirusni imunitet kod životinja.
Slika 6. c-Abl podstiče antivirusne efekte zavisne od IFN
DISKUSIJA
IFNg je jedan od najvažnijih imunomodulirajućih citokina i igra vitalnu ulogu u urođenom imunitetu protiv virusne infekcije. U kanonskom signaliziranju IFNg, nakon stimulacije IFNg, JAK1 i JAK2 se regrutuju u citoplazmatske repove agregiranih IFNg receptora (IFNGR) i aktiviraju kroz sekvencijalne događaje autofosforilacije i transfosforilacije (Stark, 2007.; Villarino20 i sur.). Zatim, STAT1 pristaje na IFNGR povezivanjem svog SH2 domena sa sekvencom prepoznavanja u IFNGR (Y440DKPH444), unutar koje je Y440 fosforiliran od strane JAKs (Greenlund et al., 1995). Nakon fosforilacije na Y701 od strane JAK-a, STAT1 se dimerizira i translocira u jezgro, gdje promovira transkripciju niza gena koji reagiraju na IFNg (Aaronson i Horvath, 2002; Stark i Darnell, 2012). Stat1 ablacija kod miševa rezultira izostankom transkripcionih odgovora na IFN i nedostatkom IFN-indukovanih antimikrobnih i antivirusnih aktivnosti u ćelijama (Meraz et al., 1996). Stat1 / miševi također pokazuju povećanu osjetljivost na razvoj spontanih i kemijski (3-metilholantren) indukovanih tumora (Kaplan et al., 1998) i preosjetljivost na određene upalne patologije (Bettelli et al., 2004; Villarino et al. ., 2010). Štaviše, STAT1 signalizacija štiti T ćelije od citotoksičnosti posredovane prirodnim ćelijama ubojicama (Kang et al., 2019).Ovi nalazi sugeriraju da STAT1 posreduje u urođenoj imunološkoj aktivaciji i imunitetu tumora.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Schlatterer et al. izvijestili su da c-Abl, ali ne i Arg, može izazvati gubitak neurona izazivanjem STAT1 aktivacije i proizvodnje interferona. Međutim, tačan mehanizam odgovoran za c-Abl zavisnu STAT1 aktivaciju nije razjašnjen (Schlatterer et al., 2012). Ovdje pokazujemo da se c-Abl vezuje i fosforilira STAT1 i da stupa u interakciju sa STAT2 direktno in vitro (Slike 2 i 3, S8A, S9A i S10A). STAT1 Y701 je isključivo fosforiliran JAK kinazama, koje regulišu formiranje dimera STAT1 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) i nukleocitoplazmatsko prebacivanje tokom IFNg signalizacije (Mao et al., 2005; Mertens et al., 2006, 20 et al., 2006; Zhong et al., 2005.). Naša studija je neočekivano otkrila da c-Abl, druga kinaza osim JAKs, također nezavisno doprinosi fosforilaciji STAT1 Y701 (slika 3). Iako c-Abl posredovana fosforilacija Y701 nije tako moćna kao kod JAK-a, čini se da je neophodno da Y701 dostigne maksimalnu fosforilaciju budući da je ozbiljno poremećena fosforilacija Y701 uočena u c-abl/arg/ćelijama nakon IFNg stimulusa, a IFNg- indukovanu fosforilaciju STAT1 Y701 inhibirao je AMN107, od 1,25 mM do 5 mM, na način ovisan o dozi (Slike 3G i S11A). Međutim, na fosforilaciju Y701 ne utiče mnogo fosforilacijsko stanje Y106 i Y665, druga dva fosfozita c-Abl, što ukazuje da potencirana fosforilacija STAT1 Y701 nije rezultat c-Abl-posredovane fosforilacije na više mjesta, već je moguće STAT1 pripisuje se pojačanoj aktivnosti JAK-a. Prethodne studije su pokazale da su konstitutivna aktivacija JAK1 i varijabilna aktivacija JAK2 uočene u ćelijama koje eksprimiraju BCR-Abl (Chai et al., 1997; Henderson et al., 1997; Shuai et al., 1996). Štaviše, pokazalo se da BCR-Abl umjereno aktivira STAT1 i STAT2 kroz fosforilaciju tirozina JAK1, JAK2 i JAK3 (Henderson et al., 1997). Trenutni dokazi potvrđuju da Abl i JAK mogu imati izražene sinergističke efekte na fosforilaciju STAT1 na Y701 (Slika 3E).
Pored Y701, istovremeno je identificirana fosforilacija Y106 i Y665 (Slike 3C i S4A). Ovi fosfoziti nisu bili uključeni u STAT1 Y701 fosforilaciju ili STAT1 homodimerizaciju (Slike S4B i S4C). Međutim, Murphy i kolege su otkrili da je interakcija između NTD (N-terminalni domen interakcije proteina, aminokiseline 1-136) monomera neophodna za dimerizaciju nefosforiliranih STAT molekula pune dužine (Ota et al., 2004). STAT1 mutanti (F77A i/ili L78A) ne uspijevaju formirati nefosforilirane dimere, a ti mutanti pokazuju fenotipsko perzistentnu fosforilaciju u ćelijama tretiranim IFN-om i otpornost na defosforilaciju posredovanu TC45- in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 u NTD, koji je blizu F77 i L78, može biti odgovoran za održavanje STAT1 u fosforilisanom dimernom stanju i za održavanje STAT1 u jezgru pod jonizujućim zračenjem (Slike S6A i S6B). Štaviše, SH2 domen je u interakciji sa fosforilisanim domenom koji sadrži tirozin kada je formiranje fosforilisanog homodimera indukovano IFN (Shuai et al., 1994). Y665, koji leži u SH2 domeni, može uticati na dimerizaciju. Funkcije c-Abl-posredovanih fosforilacijskih mjesta (Y106 i Y665) zahtijevaju dalja istraživanja.
Slično JAKs, c-Abl posredovana fosforilacija reguliše formiranje STAT1 dimera (uključujući STAT1- STAT1 homodimer i STAT1-STAT2 heterodimer formiranje (slike 4A, S12A i S12B)), nuklearnu translokaciju, vezivanje DNK i transkripcija gena stimuliranih IFN-om. Poremećaj Abl doprinio je potenciranoj virusnoj proliferaciji i povećanju virusom induciranoj ćelijskoj smrti (Slike 6B, 6C i 6D). Štaviše, otkrili smo da je jonizujuće zračenje (IR) izazvalo STAT1 nuklearnu translokaciju u odsustvu inhibitora c-Abl (slike S6A i S6B). IR direktno aktivira c-Abl (Pendergast, 2002) i naknadno STAT1-zavisnu IFNg signalizaciju, što može pružiti osnovni mehanizam pomoću kojeg terapija zračenjem inicira IFN-kaskadni urođeni i adaptivni imunološki napad na tumor (Burnette et al. ., 2011) i nudi jači urođeni imuni status kao odgovor na IR podražaje. U poređenju sa plemenima WT legla, miševi kod kojih je c-abl uslovno nokautiran u timocitima pokazali su veći, ali ne i statistički značajan mortalitet. Značajno je da su miševi kojima je sistematski davan c-Abl/Arg inhibitor AMN107 imali veći mortalitet (Slika 6E), što ukazuje da je ekspresija c-Abl u različitim tkivima doprinijela antivirusnom imunitetu kod životinja. Iz ovih podataka sugeriramo da endogeni Abl nudi latentnu bazalnu otpornost na virusnu infekciju i da aktivirani Abl stimuliran ionizirajućim zračenjem štiti stanice. Abl kinaze se konstitutivno aktiviraju kod većine pacijenata sa CML-om. Inhibitori Abl kinaze STI571 i AMN107 predstavljaju prvi tretman za terapiju CML. Međutim, infekcija gornjih disajnih puteva i imunosupresija se često primjećuju, što može biti uzrokovano represijom imunološkog regulatornog puta posredovanog STAT-om (Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Naši nalazi su dodali teorijsku osnovu za optimizaciju terapije.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Ukratko, utvrđeno je da se tirozin kinaza c-Abl povezuje sa STAT1 in vivo i in vitro, da promoviše fosforilaciju STAT1 na Y701 nezavisno od JAK-a, da potencira transaktivaciju i posreduje urođene imune odgovore protiv infekcije, posebno u kontekstu c. -Abl vezan stres. Naš nalaz pruža dodatni pristup za STAT1 aktivaciju, što doprinosi rastućem obimu znanja o regulaciji nizvodnog signalnog puta IFN-a.
REFERENCE
Aaronson, DS, i Horvath, CM (2002). Mapa puta za one koji ne znaju JAK-STAT. Science 296, 1653–1655.
Advani, AS, i Pendergast, AM (2002). BcrAbl varijante: biološki i klinički aspekti. Leuk. Res. 26, 713–720.
Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH, i Kuchroo, VK (2004). Gubitak T-bet, ali ne i STAT1, sprečava razvoj eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa. J. Exp. Med. 200, 79–87.
Bradley, WD, i Koleske, AJ (2009). Regulacija stanične migracije i morfogeneze kinazama porodice Abl: mehanizmi u nastajanju i fiziološki konteksti. J. Cell Sci. 122, 3441–3454.
Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN, i Kerr, IM (1996). Kinaza negativni mutanti JAK1 mogu održati ekspresiju gena inducibilnog interferona gama, ali ne i antivirusno stanje. EMBO J. 15, 799–809.
Carlesso, N., Frank, DA, i Griffin, JD (1996). Tirozil fosforilacija i aktivnost vezivanja DNK transduktora signala i aktivatora transkripcionih (STAT) proteina u hematopoetskim ćelijskim linijama transformisanim Bcr/Abl. J. Exp. Med. 183, 811–820.
Chai, SK, Nichols, GL, i Rothman, P. (1997). Konstitutivna aktivacija JAK-ova i STAT-ova u ćelijskim linijama koje eksprimiraju BCR Abl i stanicama periferne krvi izvedene od pacijenata s leukemijom. J. Immunol. 159, 4720–4728.
Colicelli, J. (2010). ABL tirozin kinaze: evolucija funkcije, regulacije i specifičnosti. Sci. Signal. 3, re6.
Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY, i Rothman, PB (1998). Direktna interakcija Jak1 i v-Abl je potrebna za v-Abl-indukovanu aktivaciju STAT-a i proliferaciju. Mol. Cell Biol. 18, 6795–6804.
Danial, NN, i Rothman, P. (2000). JAK-STAT signalizacija aktivirana od strane Abl onkogena. Oncogene 19, 2523–2531.
de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R., i Koenderman, L. (1999). STAT5 aktivacija BCR-Abl doprinosi transformaciji K562 ćelija leukemije. Krv 94, 1108–1112.
Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR, i Vuk-Pavlović, S. (2004). Imatinib mezilat inhibira proliferaciju T-ćelija in vitro i preosjetljivost odgođenog tipa in vivo. Krv 104, 1094–1099.
Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C., i Liu, X. (2017). Globalna regulacija diferencijalne ekspresije gena c-abl/arg onkogenim kinazama. Med. Sci. Monit. 23, 2625–2635.
Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanović, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , et al. (2014). Povećana regulacija imunoproteazomskih podjedinica kod miozitisa ukazuje na aktivnu upalu uz uključivanje ćelija koje predstavljaju antigen, CD8 T-ćelija i IFNGamma. PLoS One 9, e104048.
Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J., i Schreiber, RD (1995). Stat regrutovanje pomoću tirozin-fosforiliranih citokinskih receptora: uređeni reverzibilni proces vođen afinitetom. Imunitet 2, 677–687.
Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J., i Pendergast, AM (2013). Uloga kinaza porodice ABL u karcinomu: od leukemije do solidnih tumora. Nat. Rev. Cancer 13, 559–571.
Gu, JJ, Ryu, JR, i Pendergast, AM (2009). Abl tirozin kinaze u signalizaciji T-ćelija. Immunol. Rev. 228, 170–183.
Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J., i Deisseroth, AB (1997). Potencijalna uloga bcr-abl u aktivaciji JAK1 kinaze. Clin. Cancer Res. 3, 145–149.
Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, et al. (2016). Dugoročne koristi i rizici frontalnog nilotiniba u odnosu na imatinib za hroničnu mijeloidnu leukemiju u hroničnoj fazi: 5-godišnje ažuriranje randomiziranog ispitivanja ENESTnd. Leukemia 30, 1044–1054.
Kang, YH, Biswas, A., Field, M., i Snapper, SB (2019). STAT1 signalizacija štiti T ćelije od citotoksičnosti posredovane NK ćelijama. Nat. Commun. 10, 912.
Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ, i Schreiber, RD (1998). Demonstracija sistema za nadzor tumora zavisnog od interferona gama kod imunokompetentnih miševa. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 95, 7556–7561.
Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA, i Baltimore, D. (1998). Bitne uloge za Abl i Arg tirozin kinaze u neurulaciji. Neuron 21, 1259–1272.
Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE, i Stark, GR (1996). Uloge JAK-a u aktivaciji STAT-a i stimulaciji ekspresije c-fos gena epidermalnim faktorom rasta. Mol. Cell Biol. 16, 369–375.
