Zaštitni efekat kvercetina na endotelne ćelije oštećene hipoksijom i reoksigenacijom

Za više informacija kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

Pozadina: Cerebralna bolest malih krvnih žila (CSVD) je grupa kliničkih sindroma koji pokrivaju sve patološke procese malih krvnih žila u mozgu, koji mogu uzrokovati moždani udar i tešku demenciju. Međutim, kako patogeneza CSVD nije jasna, liječenje je ograničeno. Disfunkcija endotelnih stanica javlja se ranije od kliničkih simptoma, kao što su hipertenzija i leukoza. Stoga se očekuje da će tretman endotelnih ćelija biti novi proboj.kvercetin, flavonoid prisutan u raznim biljkama, ima funkciju protiv upale i antioksidacije. Ova studija imala je za cilj da istraži zaštitni efekat kvercetina na ozljedu endotelnih stanica i pruži osnovnu teoriju za kasniju primjenu u klinici.

Metode: Mikrovaskularne endotelne ćelije ljudskog mozga (HBMEC) kultivisane su in vitro, a model oštećenja endotelnih ćelija uspostavljen je hipoksijom i reoksigenacijom (H/R). Zaštitni efekti kvercetina na HBMEC su proučavani iz perspektive vijabilnosti ćelija, migracije ćelija, angiogeneze i apoptoze. U cilju daljeg proučavanja mehanizma kvercetina,oksidativni stresi analiziran je stres endoplazmatskog retikuluma. Štaviše, proučavan je i integritet krvno-moždane barijere (BBB).

Rezultati: kvercetinmože promovirati održivost, migraciju i angiogenezu HBMEC-a i inhibirati apoptozu. Osim toga, kvercetin također može aktivirati Keap1/Nrf2 signalni put, smanjiti ekspresiju proteina ATF6/GRP78. Dalja studija je pokazala da kvercetin može povećati ekspresiju Claudin-5 i Zonula occludens-1.

Zaključci: Naši eksperimenti pokazuju da kvercetin može zaštititi HBMEC od H/R, koji sadrži promociju ćelijske proliferacije, migraciju stanica i angiogenezu, smanjujući potencijalno oštećenje mitohondrijske membrane i inhibirajući ćelijsku apoptozu. Ovo može biti povezano s njegovom antioksidacijom i inhibicijom stresa endoplazmatskog retikuluma. U isto vrijeme, kvercetin može povećati nivo BBB konneksina, što sugerira da kvercetin može održati integritet BBB-a.

Ključne riječi: bolest malih krvnih žila mozga, endotelne stanice, kvercetin, oksidativni stres, stres endoplazmatskog retikuluma, krvno-moždana barijera

UVOD

Bolest malih krvnih žila mozga(CSVD) je krovni pojam koji obuhvata sve patološke procese koji uključuju male žile u mozgu i odnosi se na grupu kliničkih, slikovnih i patoloških sindroma različite etiologije koji sadrže intrakranijalne arteriole do venula (prečnika).<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

kvercetinje flavonoid prisutan u nekoliko biljaka, kao što je Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc ima snažno antioksidativno i protuupalno djelovanje i može imati zaštitne efekte kod različitih patoloških stanja uključujući kardiovaskularne bolesti, metaboličke poremećaje, neurodegenerativne bolesti, dijabetes, rak i gojaznost (Dok-Go et al,2003; Comalada et al,2005; Cho et al, 2006). Predtretman kvercetinom značajno je povećao nivoe ekspresije endogenih antioksidativnih enzima u hipokampalnim CA1 piramidalnim neuronima životinja oštećenih ishemijom, pokazujući snažne antioksidativne i neuroprotektivne efekte (Chen et al,2017). Nedavne studije su također otkrile da kvercetin ima neuroprotektivne efekte protiv ishemijske ozljede uz održavanje integriteta BBB (Jin et al, 2019). Međutim, njegov učinak na mikrovaskularne endotelne stanice mozga (BMEC) pod hipoksijom i reoksigenacijom (H/R) je slabo proučavan, a ciljni protein kvercetina koji štiti BMEC nije prijavljen.

U našoj studiji istražili smo zaštitni učinak kvercetina na mikrovaskularne endotelne ćelije ljudskog mozga (HBMEC) oštećene H/R u kulturi. Istovremeno, dodatno smo proučavali mogući mehanizam njegovog zaštitnog dejstva, kako bismo pružili više teorijske osnove za kliničku promociju kvercetina i dali nove ideje za lečenje CSVD.

MATERIJALI I METODE

Mediji, reagensi i antitela

kvercetin(purity>98 posto) je kupljeno od Best Biological Technology Co, Ltd. (Chengdu, Kina). HBMEC su kupljeni od Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (Šangaj, Kina). Fetalni goveđi serum (FBS) je dobijen od Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Izrael). Penicilin/streptomicin i Dulbecco-ov modifikovani medijum orla (DMEM) su kupljeni od Hyclone (GA, Sjedinjene Države). Komplet za testiranje potencijala mitohondrijske membrane (JC-1), komplet za testiranje BCA proteina, 2,7-dihlorid-hidro fluorescein diacetat (DCFH-DA) i NP40 lizat su kupljeni od Beyotime Biotechnology (Šangaj, Kina). Preparat fosfataze i potpuni inhibitor proteaze kupljeni su od Rochea (Šangaj, Kina). Apoptosis Kit je kupljen od BD Biosciences (Sparks, MD, Sjedinjene Države). Malondialdehid (MDA), superoksid dismutaza (SOD), molekul intercelularne ćelijske adhezije-1 (ICAM-1), molekul vaskularne ćelijske adhezije-1 (VCAM{{10}} )enzimski imunosorbentni test (ELISA) je (Cambridge, Abcam je kupio kompaniju dfr1"一United Kingdom). Antitela protiv faktora 2 (Nrf2) povezanog sa nuklearnim faktorom E2-, Kelch kao ECH povezani protein 1 (Keap1), Aktivirajući transkripcijski faktor 6(ATF6), glukozom regulirani protein 78(GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH je kupljen od Cell Signaling Technology (Danvers, Sjedinjene Države). IgG konjugiran s peroksidazom hrena (HRP) dobijen je od kompanije Jackson (Pensilvanija, Sjedinjene Države). SDS-PAGE komplet za brzo doziranje i ECL hromogeni rastvor su kupljeni od EpiZyme Biotechnology (Šangaj, Kina). uzgajane su u DMEM-u koji sadrži 10 posto FBS i 1 posto penicilin-streptomicina, u 37Cinkubatoru sa 5 posto CO2. Za izazivanje endotela Nakon oštećenja ćelija, HBMEC-i su tretirani hipoksijom od 12 h, nakon čega je uslijedila 8 h reoksigenacija, a specifične procedure su bile sljedeće (Warpsinski et al., 2020): HBMEC-i su prvo inkubirani s podlogom bez seruma u inkubatoru za hipoksiju (1 posto O,5 posto CO.94 posto N) 12 h, a zatim je podloga promijenjena u normalnu podlogu sa 10 posto FBS-a, dok su inkubirane u normoksia inkubatoru (95 posto O2,5 posto CO2) 8 h. Tretman kvercetinom 2 mg kvercetina je rastvoreno u 331 μL DMSO da bi se formirao osnovni rastvor sa koncentracijom od 1 mmol/L i pohranjen na -20 stepenu stepena. Radni rastvor je razblažen na 0,1,0,5,1,2,5,10 umol/L sa DMEM, u kome je procenat DMSO bio ispod 0,1 odsto. Nakon što su ćelije prianjale, dodat je kvercetin sa medijumom bez seruma, a ploče su potom stavljene u inkubator za hipoksiju. Nakon 12 h, ćelije su uklonjene, promijenjene u kvercetin sa serumskom podlogom i stavljene u inkubator za normoksiju na 8 h.

Test vitalnosti ćelija

Efektikvercetino održivosti HBMEC-a ispitan je komplet za brojanje ćelija-8 prema uputstvu za operatera. Najprije su procijenjene sigurne doze kvercetina za ćelije u odsustvu oštećenja endotelnih ćelija, a zatim su ispitani zaštitni efekti istog u stanju oštećenja ćelija. Svi eksperimentalni rezultati ponovljeni su najmanje tri puta.

Ispitivanje zacjeljivanja ogrebotina i formiranja cijevi Eksperimenti migracije izvedeni su metodom grebanja ćelija. Prije tretmana kvercetinom, nacrtana je ravna okomita linija na dnu ploče za kulturu i fotografisana za snimanje 0 h, a ćelije su naknadno podvrgnute tretmanu kvercetinom i modeliranjem prije snimanja fotografija za snimanje. Prednja i stražnja područja su kontrastirana dva puta.

Formiranje epruvete oponašajući angiogenu sposobnost ćelija, Matrigel (9-12mg/ml) je stavljen na dno ploče za kulturu, zatim su kvercetin i ćelije tretirane modeliranjem postavljene na vrh, nakon 8 h, snimljene su slike. Generacija grananja krvnih sudova analizirana je i upoređena korišćenjem ImageJ.

Potencijali mitohondrijske membrane i analiza apoptoze

Komplet za promjenu potencijala mitohondrijske membrane i komplet za apoptozu korišteni su za otkrivanje apoptoze stanica. Promjena potencijala mitohondrijalne membrane je otkrivena bojenjem HBMEC-a sa JC-1 fluorescentnom sondom. Dodan je radni rastvor za bojenje JC-1(1×) i inkubiran u cinkubatoru na 37 stepeni 20 minuta prije nego što je dva puta ispran sa JC-1(1×) puferom za bojenje i na kraju dodan u svaku jažicu za PBS . Zatim je za analizu korišten uređaj za snimanje ćelija visokog sadržaja.

HBMEC-ovi su sakupljeni sa ploča 6-jažica, centrifugirani da bi se uklonio supernatant, zatim se dodala 1 × otopina za vezivanje aneksina V da bi se otpuhale i pomiješale ćelije, a zatim se dodala FITC boja za aneksin V da se inkubira u mraku na sobnoj temperaturi 10 min, dodati rastvor za bojenje propidijum jodida(PI) 5 minuta pre mašine, a za detekciju je upotrebljen Beckman protočni citometar.

ELISA

Nakon što su ćelije tretirane H/R ili kvercetinom, supernatant je sakupljen. ICAM-1, VCAM-1, SOD i MDA su detektovani korišćenjem ELSA kompleta prema uputstvu za operatera.

Ispitivanje vrsta reaktivnog kiseonika (ROS) Sposobnost stvaranja ROS detektovana je DCFH-DA sondom, koja je procenjena pomoću uređaja za snimanje ćelija visokog sadržaja i analizirana fluorescencijom pomoću ImageJ. Western blotting

HBMEC su sakupljeni sa ploča za kulturu, NP40 lizat je dodat preparat fosfataze i kompletan inhibitor proteaze je korišten za ekstrakciju proteina iz ćelija. Određen je sadržaj proteina i uzeto je 30 ug proteina za eksperimente imunoblotinga. SDS-PAGE gel je korišten za elektroforezu, blokiran sa 5 posto nemasnog suvog mlijeka nakon elektrotransfera na PVDF membranu u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi. Zatim anti-Nrf2(zec, 1:1,000),anti-Keapl(zec,1:1,000),anti-ATF6(zec,1:1,000 ), anti-GRP78 (zec,1:1,000), anti-ZO-1(zec,1:1,000), anti-Claudin-5( zec,1:1,000) antitela su inkubirana preko noći na 4C. Nakon ispiranja sljedećeg dana, dodana su razrijeđena kozja anti-zečja sekundarna antitijela (IgG HRP, 1:10,000) i inkubirana 1h. Konačno, detekcija je razvijena nakon tri puta pranja u TBST.

Proteomska analiza

HBMEC su tretirani sa H/R u prisustvu kvercetina (l umol/L). Nakon toga, ćelije su nežno sastrugane sa ploče za kulturu strugačem za ćelije, sakupljene u kriopijale, brzo stavljene u tečni azot, a zatim pohranjene na -80 stepenu 5 minuta iTRAQ tehnologija je korištena za proteomsku analizu, tj. proteini sa p-vrednošću<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 ili<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Statistička analiza

Podaci su usklađeni sa normalnom distribucijom, a za izražavanje podataka korištena je srednja vrijednost ± standardna devijacija. Za statističku analizu korišten je GraphPad Prism 8. Dva nezavisna uzorka analizirana su t-testom, a podaci mjerenja opisani su srednjom ± standardnom devijacijom (SD). Poređenje među grupama provedeno je jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA). p-vrijednost<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

REZULTATI

Rezultati

Utjecaj kvercetina na vitalnost stanica

Da bismo testirali efekat kvercetina na vitalnost ćelije, prvo smo ispitali sigurnu dozu kvercetina na ćelije, kao što je prikazano na slici 1A, koja nije imala uticaja na vitalnost ćelije pri 0.1-10 umol/L . Zatim, za traženje efikasne doze na osnovu oštećenja endotelnih ćelija, pokazali smo da kvercetin na 0.1-1 μmol/L može promovirati vitalnost stanica u H/R-HBMEC, kao što je prikazano na slici 1B. Naknadni eksperimenti su izvedeni oko ovog raspona koncentracija. Vrijedi napomenuti da kada je koncentracija lijeka dosegla 10 μmol/L, pojavila se citotoksičnost. Mislili smo da kada su HBMEC oštećeni H/R, njihova tolerancija se smanjuje. Stoga, kada je koncentracija lijeka bila nešto veća, oštećenje stanica se povećava. Stoga je do citotoksičnosti došlo kada je koncentracija lijeka 10 μmol/L.

Učinak kvercetina na ćelijsku migraciju i angiogenezu

Da bi se ispitali efekti kvercetina na migratorne i angiogene kapacitete endotelnih ćelija, HBMEC su podvrgnuti H/R tretmanu dok je davan kvercetin. Izvršili smo test ogrebotina kako bismo testirali sposobnost migracije ćelija, koji je pokazao da H/R tretman oslabi sposobnost migracije H/R-HBMEC-a u poređenju sa kontrolom, a kvercetin bi mogao značajno promovirati migraciju stanica u koncentraciji od 0 .1-1 μmol/L. Tubulogeneza je korištena za oponašanje in vitro angiogeneze, a dužina njene grane predstavlja angiogeni kapacitet. Rezultati su pokazali da je tretman H/R rezultirao smanjenim angiogenim kapacitetom, ali kvercetin 0.1-1 μmol/L bi mogao poništiti ovu povredu, kao što je prikazano na slici 2.

Efekat kvercetina na ćelijsku apoptozu

Da bismo testirali potencijal kvercetina da inhibira apoptozu endotelnih ćelija, koristili smo potencijal mitohondrijske membrane i apoptozu za evaluaciju. Kada su ćelije bile ozlijeđene kako bi se podvrgle apoptotičkim događajima, potencijal mitohondrijske membrane je smanjen, citoplazmatska crvena fluorescencija je značajno smanjena, zelena fluorescencija je povećana, a crveno/zeleno (R/G) je konačno prihvaćeno da predstavlja promjenu potencijala mitohondrijske membrane, što će se smanjiti kada je potencijal mitohondrijske membrane ugrožen. Naši rezultati su pokazali da je nakon H/R tretmana potencijal mitohondrijalne membrane ćelija smanjen, na šta ukazuje povećana zelena fluorescencija. S povećanjem doze kvercetina, crvena fluorescencija je bila stalno pojačana, što ukazuje da kvercetin može ovisno o dozi podići potencijal mitohondrijalne membrane (Slika 3A, C). Nadalje, korišćena je protočna citometrija za direktno ispitivanje apoptoze ćelije. Rezultati su pokazali da HBMEC pokazuju povećanu stopu apoptoze nakon H/R tretmana, dok je kvercetin u 0.1-1 umol/L pokazao jasnu sposobnost inhibicije apoptoze (Slika 3B, D).

Učinak kvercetina na ćelijsku adheziju

Kada se endotelne ćelije oštete, stvaraju se neki adhezijski molekuli, kao što su ICAM{{0}} i VCAM-1, koji adsorbiraju toksične supstance u BBB i oštećuju moždani parenhim (Hauptmann et al, 2020. ).Da bi se ispitao efekat kvercetina na sposobnost H/R-HBMEC-a da proizvode adhezione molekule, ICAM-1 i VCAM-1 su izmjereni pomoću ELISA-e. U našoj studiji, H/R je rezultirao povećanjem nivoa ICAM-1 i VCAM-1, ali je dodavanje kvercetina ispod koncentracije od 0.1-1 umol/L smanjilo ovaj efekat (Slika 4).

Kvercetin može inhibirati oksidativni stres

Kvercetin je flavonoid sa jakim antioksidativnim kapacitetom, pa smo upotrijebili DCFH-DA sondu za detekciju ROS. Posmatrali smo

povećano stvaranje ROS-a u HBMEC-ima izloženim H/R, što je značajno smanjeno tretmanom kvercetinom u koncentracijama od {{0}}.1-1 umol/L U međuvremenu smo otkrili promjene nivoa oksidativnog stresa proizvode SOD i MDA sa ELISA-om, a rezultati su pokazali da je kvercetin u koncentraciji od 0.1-1 μmol/L mogao smanjiti SOD i MDA, koji su bili povišeni za H/R, što ukazuje da bi kvercetin mogao smanjiti oštećenje HBMEC-a od oksidativnog stresa (Slika 5).

Kvercetin bi mogao regulisati Keap1/Nrf2 i ATF6/GRP78 proteine

Da bismo dalje istražili zaštitni mehanizam kvercetina na HBMEC, analizirali smo nivoe ekspresijeoksidativni stresi proteini endoplazmatskog retikuluma povezani sa stresom. Poznato je da Keap1/Nrf2 reguliše antioksidativne odgovore in vivo. Povreda oksidativnog stresa tjera endotelne ćelije da se podvrgnu stresnom odgovoru, što rezultira povećanjem nivoa Keapl/Nrf2 (Warpsinski et al, 2020). U ovoj studiji, H/R je rezultirao aktivacijom mehanizama ćelijskog antioksidativnog odgovora i povećanim nivoima Keapl i Nrf2, koji bi mogao biti dodatno ojačan kvercetinom pri 0.5-1 umol/L kako bi se poboljšao antioksidativni kapacitet HBMEC-a .ATF6/GRP78 je jedan od puteva koji regulišu homeostazu endoplazmatskog retikuluma (ER). ER stres može pogoršati ozljedu endotelnih stanica (Nie et al, 2020). U našoj studiji, ER stres je aktiviran H/R, a nivoi ATF6 i GRP78 su povećani. Kvercetin u l umol/L je bio u stanju da značajno smanji nivoe proteina oba, inhibira ER stres i zaštiti HBMEC od H/R povrede (Slika 6).

Kvercetin bi mogao održati BBB integritet

BMEC su okosnica strukture BBB, a njihova smrt ili apoptoza nakon H/R ozljede utječe na integritet i funkcionalnost BBB (Ding et al, 2019). BBB-povezanih proteina ZO-1 i Claudin-5. U poređenju sa kontrolnom grupom, izraz ZO-1 i Claudin-5 je bio

smanjen u H/R ozljedi, što ukazuje da je BBB oštećen i da se to oštećenje može poništiti kvercetinom u koncentracijama od 0.5-1 μmol/L, što ukazuje da kvercetin može održavati funkciju endotelnih stanica (Slika 7).

Proteomska analiza

Da bi se pronašli proteini diferencijalne ekspresije (DEP) H/R oštećenih HBMEC u prisustvu kvercetina ili ne, ITRAO je korišten za provođenje proteomičke analize. Proteini koji pokazuju ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 ili<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

DISKUSIJA

CSVD, kao sve veći medicinski i socioekonomski teret, brzo je privukao pažnju. Ali iznenađujuće, patogeneza CSVD-a trenutno ostaje nejasna, ne pružajući ni jasnu shemu njegovog liječenja. S obzirom da kasnije faze CSVD mogu napredovati do teških ishoda kao što su moždani udar i demencija, ciljanje na rane lezije za liječenje može efikasno odgoditi progresiju CSVD (Cannistraro et al, 2019). Pokazalo se da rane patološke promjene CSVD leže u disfunkciji endotelnih stanica i lijekovi koji stabiliziraju njenu disfunkciju mogu poboljšati ranjivost bijele tvari mozga u lezijama CSVD (Rajani et al,2018). S obzirom na ulogu koju imaju endotelne ćelije u CSVD, postavili smo se da istražimo zaštitne efekte tradicionalne kineske medicine na endotelne ćelije koristeći HBMEC.

Kvercetin je flavonoid prisutan u raznim biljkama (Nawrot-Hadzik et al, 2019). Ima snažno antioksidativno i protuupalno djelovanje i može imati zaštitno djelovanje kod različitih patoloških stanja. U ovoj studiji smo pokazali da kvercetin može ublažiti H/R ozljedu, a nekoliko eksperimentalnih podataka potvrđuje naš zaključak da kvercetin može promovirati vitalnost stanica, migraciju stanica, angiogenezu, povećati potencijal mitohondrijske membrane i inhibirati apoptozu.

S obzirom na to da kvercetin ima snažno antioksidativno djelovanje, istražili smo mehanizam kojim kvercetin štiti HBMEC u smislu antioksidacije. Nivoi ROS mogu biti značajno povećani oksidativnim stresom (Wu et al., 2018), a akumulacija ROS može uzrokovati mnoge bolesti, uključujući kardiovaskularne bolesti, endotelnu disfunkciju i bolesti povezane sa starenjem, te neurodegenerativne bolesti (Chen et al, 2015; Jakaria i sur., 2018; Santos i sur., 2018). Štaviše, oksidativni stres se javlja u peroksidaciji lipida, stvarajući MDA, koji će uništiti ravnotežu oksidativnih antioksidansa u tijelu i povećati oštećenje endotelnih stanica (Yang et al, 2021).

Keapl/Nrf2 se smatra trenutno najvažnijim samo-antioksidativnim putem, a aktivacija ovog puta može značajno poboljšati disfunkciju endotelnih stanica. Posebno, ROS pomaže u promicanju aktivacije Nrf2 signalnog puta (Selimoglu-Buet et al, 2017). Pokazali smo da kvercetin može smanjiti generiranje ROS i MDA, dok povećava ekspresiju proteina Keapl i Nrf2, sugerirajući da kvercetin može ublažiti ozljedu endotelnih stanica smanjenjem odgovora na oksidativni stres aktiviranjem Keapl/Nrf2 signalnog puta.

I ne samo to, trajni ER stres aktivira nesavijeni proteinski odgovor i mijenja ekspresiju antioksidativnih gena, što dovodi do apoptoze endotelnih stanica (Tang et al, 2019). Osim toga, oksidativni stres također može uzrokovati poremećaj savijanja proteina u ER, provocirati ER stres i pogoršati ozljedu endotelnih stanica (Hetz, 2012). ER stres se može aktivirati ova tri puta: ER kinaza slična PKR (PERK), inozitol koji zahtijeva enzim 1 (IRE1) i aktivirajući ATF-6, koji štite stanice od ER stresa u homeostatskim uvjetima (Hetz et al. ,2020). Ali kada su pod utjecajem vanjskih štetnih stimulansa, ova tri puta bi aktivirala ER odgovor na stres i inducirali apoptozu stanica. Štaviše, studije su pokazale da inhibicija odgovora na stres ER može preokrenuti disfunkciju endotelnih ćelija izazvanu H/R (Chen et al, 2020). U našoj studiji, kvercetin bi mogao smanjiti povišeni sadržaj ATF6/GRP78 uzrokovan H/R, inhibirati odgovor na stres endoplazmatskog retikuluma i štite endotelne stanice.

Kao glavna komponenta BBB, funkcije endotelnih ćelija uključuju održavanje njihovog integriteta. Disfunkcija BBB-a uzrokuje curenje tekućine, proteina i drugih komponenti plazme u perivaskularna tkiva, dodatno ometajući cerebralnu vazodilataciju i transport nutrijenata (Wardlaw et al, 2019). Kada se endotelne ćelije oštete i integritet BBB-a će biti uništen, tako da zaštita endotelnih ćelija može dalje održavati integritet BBB-a. Claudin-5 je visoko izražen u BMEC-ima i uključen je u sačinjavanje okosnice čvrstih spojnih lanaca za regulaciju BBB permeabilnost (Yang et al, 2020). Endotelne ćelije su usidrene za aktinski citoskelet pomoću proteina kao što je ZO-1, stvarajući čvrste spojeve između endotelnih ćelija koje održavaju čvrstoću BBB (Zhang et al,2020). U našoj studiji, izraz claudin-5 i ZO-1 je korišten za predstavljanje BBB integriteta. Naši rezultati su pokazali da su nivoi proteina klaudina-5 i ZO-1 smanjeni u HBMEC-ima podvrgnutim H/R ozljedi, što ukazuje da je integritet BBB-a poremećen, a kvercetin bi mogao smanjiti ovu povredu podizanjem klaudin{{ 9}} i nivoi ZO 1 proteina.

Nadalje, da bi se pronašle potencijalne mete kvercetina na HBMEC, i-TRAQ je označen u ćelije. Nakon proteomske analize, istraženo je prvih 20 uobičajenih različito eksprimiranih proteina. Među njima su INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI su povezani sa endotelnim ćelijama. INSRR se smatra tumorskim endotelnim markerom i njegova prekomjerna ekspresija može promovirati angiogenezu (Nowak-Sliwinska et al, 2019). Rekombinantni ANXA2 može smanjiti propusnost endotela u stanjima oštećenja hipoksije i inflamatornog faktora, što ukazuje da ANXA2 može biti uključen u održavanje čvrstoće endotelnih stanica (Li et al,2019). Kod bojenja ljudskih cervikalnih sekcija, snažna ekspresija DUSP3 je pronađena u endotelnim ćelijama, a eksperimenti su takođe pokazali da je DUSP3 neophodan za mikrovaskularni rast izazvan osnovnim faktorom rasta fibroblasta (Amand et al. 2014). Pokazalo se da ekspresija HBAl u endotelnim ćelijama kontroliše vaskularni tonus i funkciju (Sangwung et al., 2017). Smatra se da PGK1 smanjuje aterogenezu (Zhang et al, 2020). Štaviše, VTN se smatra kritičnim za formiranje tromba u okruženju vaskularne povrede (Bowley et al, 2017). GPI je obogaćen mikrovaskularnim endotelnim ćelijama sinovijalnog tkiva pacijenata sa reumatoidnim artritisom u hipoksičnom okruženju i reguliše lučenje faktora rasta vaskularnog endotela iz sinovijalnih fibroblasta reumatoidnog artritisa kako bi inducirao angiogenezu (Lu et al, 2017). eksprimirani proteini povezani sa neplodnošću posredovanom varikokelom pokazali su da je Nrf2 bio uzvodni regulator ANXA2 (Panner Selvam et al, 2021). Inhibicija PGK1 može aktivirati Keapl/Nrf2 put i stimulirati antioksidativni odgovor koji štiti ćelije (Bollong et al, 2018). Ova dva proteina mogu biti potencijalne mete kvercetina kroz Keapl/Nrf2 put. Dalja studija može potvrditi ulogu ovih proteina na efekat kvercetina na H/R-HBMEC.

Doduše, kvercetin može imati zaštitne efekte na endotelne ćelije. Ali konkretni ciljevi djelovanja i dalje zahtijevaju daljnje istraživanje, a da li postoje dodatni putevi djelovanja ostaje nepoznato.

Zaključno, ova studija je pokazala da kvercetin održava integritet krvno-moždane barijere štiteći endotelne ćelije. Na molekularnom nivou, kvercetin može igrati ulogu u zaštiti endotelnih ćelija tako što štiti od oksidativnog stresa kroz Keapl/Nrf2 put i inhibira stres endoplazmatskog retikuluma putem ATF6/GRP78 puta. Ova studija postavlja temelje za TCM za liječenje CSVD-a štiteći endotelne stanice.