Program bubrežne fibrogeneze kontrolišu mikroRNA koje regulišu oksidativni metabolizam
Mar 29, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob , Diego Rodríguez-Puyolc ,d
Santiago Lamesa,**
a Program fizioloških i patoloških procesa, Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Španija
b Genomski objekat, Parque Científico de Madrid, Madrid, Španija
c Odeljenje za patologiju, Bolnica Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madrid, Španija
d Odsjek za medicinu i medicinske specijalnosti, Fondacija za istraživanje Univerzitetske bolnice "Principe de Asturias", IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Španija
Ključne riječi: MicroRNAS, fibroza bubrega, oksidacija masnih kiselina, ekstracelularni matriks, CPT1A, mitohondrije
cistanche bodybuilding je vrlo dobar za funkciju bubrega
A B S T R A C T
Prekomjerno nakupljanje ekstracelularnog matriksa (ECM) je znak fibroznih bolesti. U bubrezima je to posljednji uobičajeni put preovlađujućih bolesti koje dovode do kroničnog zatajenja bubrega. Dok citokini kao što je TGF- igraju osnovnu ulogu u transformaciji miofibroblasta, nedavni rad je pokazao da su disfunkcija mitohondrija i defektna oksidacija masnih kiselina (FAO), koji ugrožavaju glavni izvor energije za bubrežne tubularne epitelne ćelije, predloženi kao fundamentalni doprinos razvoju i napredovanju fibroze bubrega. Prijavljeno je da mikroRNA (miRNA), koje reguliraju ekspresiju gena post-transkripcijski, kontroliraju bubrežnu fibrogenezu. Da bismo identificirali miRNA uključene u metabolički poremećaj bubrežne fibroze, izvršili smo pregled niza miRNA u mišjem modelu jednostrane ureteralne opstrukcije (UUO). MiR-150-5p i miR-495-3p su odabrani zbog njihove veze sa ljudskom patologijom, njihove uloge u metabolizmu mitohondrija i njihovog ciljanja na enzim CPT1A koji prenosi masne kiseline. Pronašli smo 2- i 4-prestruku regulaciju miR-150-5p i miR-495-5p, respektivno, u modelima UUO i nefropatije izazvane folnom kiselinom (FAN) , dok je TGF- 1 pojačao njihovu ekspresiju u ćelijskoj liniji renalnih tubularnih epitelnih ćelija HKC-8. Ove miRNA su sinergizirale sa TGF-om u pogledu njegovog profibroznog efekta tako što su pojačale markere povezane s fibrozom Acta2, Col{16}} i Fn1. Bioenergetske studije su pokazale smanjenje stope potrošnje kiseonika (OCR) u vezi sa FAO u HKC-8 ćelijama u prisustvu obe miRNA. Konzistentno, nivoi ekspresije njihovih ciljnih gena povezanih sa mitohondrijama CPT1A, PGC1 i mitohondrijalnog transkripcionog faktora A (TFAM), smanjeni su za polovinu u ćelijama bubrežnog epitela izloženih ovim miRNA. Nasuprot tome, nismo otkrili promjene u mitohondrijskoj masi i transmembranskom potencijalu (ΔẐm) ili produkciju anjona radikala mitohondrijalnog superoksida. Naši podaci potvrđuju da miR-150 i miR- 495 mogu doprinijeti bubrežnoj fibrogenezi tako što pogoršavaju metabolički poremećaj koji je kritično uključen u tubularne epitelne ćelije, što na kraju dovodi do fibroze.
1. Uvod
Hronična bolest bubrega (CKD) je kliničko stanje u kojem se održava smanjena bubrežna funkcija. Općenito se smatra da je nepovratan i progresivan. Predstavlja važan javnozdravstveni problem koji može zahvatiti 12-14 posto opće populacije [1]. Može biti prisutan kod oko 30-40 posto pacijenata s visoko rasprostranjenim patologijama kao što su dijabetes melitus i hipertenzija, gdje doprinosi diktiranju evolucije i prognoze. Bez obzira na etiologiju bolesti, progresija CKD dovodi do tubulno-intersticijalne i glomerularne fibroze [2]. Tubulo-intersticijska fibroza uključuje širenje prostora između tubularne bazalne membrane i peritubularnih kapilara kroz taloženje matriksnih proteina (ECM) (pretežno kolagena tipa I i III i fibronektina) u vezi s inflamatornim stanicama, gubitkom tubularnih stanica i akumulacijom miofibroblasta. [3].
Transformirajući faktor rasta- (TGF-) smatra se ključnim sveprisutnim profibrotičnim citokinom i glavnim regulatorom diferencijacije miofibroblasta u fibrozi [4]. Nedavne studije su pokazale da globalni defekt u oksidaciji masnih kiselina (FAO), koji dovodi do kompromisa u glavnom izvoru energije za tubularne epitelne ćelije, igra važnu ulogu u razvoju fibroze bubrega [5,6]. TGF- potiskuje FAO na način ovisan o SMAD3-i PGC1A, čime utječe na transkripcijske regulatore preuzimanja i oksidacije masnih kiselina, uključujući CPT1A [5]. Promjene u FAO konačno rezultiraju intracelularnom akumulacijom lipida i iscrpljivanjem ATP-a, što dovodi do fibroze [5,7]. Stoga, strategije usmjerene na obnavljanje metaboličkog poremećaja koji djeluju u CKD mogu pružiti terapijske opcije [8].
MikroRNA (miRNA) su se pojavile kao kritični regulatori ekspresije gena kroz svoje djelovanje na posttranskripcijsku regulaciju. U bubrezima se pokazalo da miR imaju ključnu ulogu u nefrogenezi, homeostazi i bolesti [9]. MiRNA su takođe sposobne da regulišu fibrozne procese i nazvane su "fibroza" [10]. Pored toga, zbog nedostatka efikasne terapije za prevenciju ili vraćanje bubrežne fibrogeneze [11], manipulacija ekspresijom miRNA in vivo isporukom miRNA mimika ili inhibitora je predložena kao obećavajuća terapijska strategija za CKD [12]. Osim toga, cirkulirajuće miRNA mogu predstavljati dijagnostičke, pa čak i prognostičke biomarkere [13].
Kontrola bubrežne fibroze posredovana miRNA uglavnom se odvija kroz regulaciju TGF- 1 signalizacije na način ovisan o ćelijama i kontekstu, koristeći Smad put kao jedan od glavnih ciljeva [14]. U prethodnom radu identifikovali smo nekoliko miRNA koje imaju uticaj na fibrozu bubrega regulacijom specifičnih metaboličkih puteva [15,16]. Prekomjerna ekspresija miR-9-5p sprječava dediferencijaciju tubularne epitelne bubrežne stanice i reprogramira metabolički poremećaj povezan s fibrozom [16], dok gubitak funkcije miR-33, bilo genetske ili farmakološke, dovodi do povećanja FAO i prevencija nakupljanja lipida u tubularnim epitelnim stanicama. Ovo je povezano sa povećanom opskrbom energijom, poboljšanom bioenergetikom mitohondrija i prevencijom eksperimentalne bubrežne fibroze [15]. Dakle, miRNA koje reguliraju staničnu bioenergetiku su također sposobne regulirati bubrežnu fibrogenezu. U ovoj studiji koristili smo strategiju zasnovanu na nizu miRNA u modelu kronične ozljede bubrega unilateralne opstrukcije uretera (UUO) kako bismo identificirali miRNA uključene u bubrežni fibrotični fenotip kroz modifikaciju metaboličkih puteva. Odabirom nekoliko gena povezanih s mitohondrijskom funkcijom (CPT1A, TFAM, PGC1A), identificirali smo i miR-150 i miR-495 kao miRNA sposobne da smanje stopu potrošnje kiseonika (OCR) povezanu sa FAO i promovišu TGF{ {21}}indukovana fibrogena transformacija u ćelijskoj liniji ljudskih tubularnih epitelnih ćelija HKC-8. Naši nalazi naglašavaju važnost miRNA kao mitohondrijalnih metaboličkih regulatora uključenih u bubrežnu fibrogenezu.
2. Materijal i metode
Ćelijske linije i uslovi kulture. Ljudske bubrežne proksimalne tubularne epitelne ćelije (HKC-8) uzgajane su u DMEM/F12 (Dulbecco-ov modificirani Eagleov medij 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY) sa dodatkom 15 mM HEPES-a, 5 posto (vol/vol) fetalni goveđi serum (FBS)
(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0.5 ug/ml hidrokortizon (Sigma, St. Louis, MO), 50 jedinica/ mL penicilina i 50 ug/mL streptomicina (Gibco, Rockville, MD) na 37◦ C i 5 posto CO2. Ovu ćelijsku liniju je ljubazno obezbijedila laboratorija dr. Susztak (Philadelphia, Pennsylvania, USA). Tretmani sa humanim rekombinantnim 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) obavljeni su nakon 12 sati gladovanja HKC-8 ćelija bez seruma.
Postupak transfekcije. Ćelije su zasijane u posude za kulturu od 60 mm kako bi se postiglo ušće od 70 posto. Oni su transficirani sa 40 nM mirVana™ miRNA koja oponaša miR-150, miR-495 ili mirVana™ miRNA imitira negativnu kontrolu (kompanija Ambion, SAD) koristeći lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Ćelije su inkubirane sa lipofektamin-pre-miRNA 37 ◦ C tokom 6 sati. Nakon toga, 5 ml svježeg medija koji je sadržavao 10 posto FBS-a je dodano u posude za kulturu, a ćelije su držane u kulturi 6 h dok se ne koriste za naredne eksperimente. U slučaju kombinacije sa tretmanom TGF- 1, primijenjen je na ćelije nakon prekomjerne ekspresije miRNA u skladu sa prethodnim odjeljkom.
Imunoblot. Ćelije su isprane u PBS-u, homogenizirane i lizirane u 100 μL RIPA pufera za lizu koji sadrži 150 mM NaCl, 0,1 posto SDS, 1 posto natrijum deoksiholata, 1 posto NP-40 i 25 mM Tris- HCl pH 7,6, u prisustvu proteaze (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Njemačka) i inhibitora fosfataze (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i sakupljeno struganjem. Četvrtina komada svakog uzorka bubrega (dobijenog nakon disekcije na pola i po dužini i poprijeko) homogenizirana je u 300 ul RIPA pufera sa zrncima od nehrđajućeg čelika od 5 mm (Qiagen, Valencia, CA) korištenjem TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) koji vibrira na 50 Hz tokom 15 minuta na 4 ◦ C. Uzorci su bistreni centrifugiranjem na 10,000 g tokom 15 minuta na 4 ◦ C. Pelet je zatim odbačen, a supernatant je čuvan kao proteinski lizat. Koncentracije proteina određene su BCA Protein Assay Kit-om (Thermo Scientific, Rockford, IL) i mjerene su u Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI). Jednake količine proteina (10-50 ug) iz ukupnog ekstrakta su odvojene na 8-10 posto SDS-poliakrilamidnih gelova i prebačene na nitrocelulozne bloting membrane (GE Healthcare, Chicago, IL) na 12 V tokom 20 minuta u polusuhom Trans-Blot Turbo sistem (Bio-Rad, Hercules, California).
Membrane su blokirane inkubacijom u trajanju od 1 h sa 5 posto nemasnog mlijeka u PBS-u koji sadrži 0.5 posto Tween-20 i blotirane preko noći sa specifičnim antitijelima: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦ C preko noći), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C preko noći), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 h, sobna temperatura); ). Nakon inkubacije sa IRDye 800 kozjim anti-zečjim i IRDye 600 kozjim anti-mišjim (1:15,000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) sekundarnim antitelima, membrane su snimljene u tri primerka pomoću Odyssey infracrvenog sistema za snimanje (LI-COR Biosciences, Linkoln, NE). Denzitometrija trake je izvedena korišćenjem softvera ImageJ 1.48 (http://rsb.info.nih.gov/ij) i relativna ekspresija proteina je određena normalizacijom na GAPDH. Promjene nabora su normalizirane na vrijednosti kontrolnog stanja.
Ekstrakcija RNK. Ukupna RNA je ekstrahirana iz HKC-8 ćelija ili bubrega miša korištenjem miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) prema uputama proizvođača. Količina i kvalitet RNK određivani su na 260 nm spektrofotometrom Nanodrop{2}} (Thermo Scientific, Rockford, IL).
Analiza ekspresije mRNA. Reverzna transkripcija (RT) je izvedena sa 500 ng ukupne RNK koristeći iScript™ cDNA Synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT–PCR je izveden sa iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), koristeći 96-well Bio-Rad CFX96 RT–PCR sistem sa C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA) prema uputama proizvođača. Vrijednost Ct je dobijena iz svake krive pojačanja korištenjem softvera za analizu CFX96 koji je obezbijedio proizvođač. Relativna ekspresija mRNA određena je metodom 2 − ΔΔCt [17]. 18S gen je korišten u svrhu normalizacije. The primer sequences used for mRNA quantification were: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGACGACCTGGTGAGAGA, RV: CATTGTGTCCCCTAATGCCTT), FN1 (FW: GTGTTGGGAATGGTCGT GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CATCTCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCATCTCTGGATCCAG: CCATCTCTGACTCCAG: CCATCTCTGGATCCAG: CCATCTCTGCAGTCCAG: CCATCTCTGCAGTCAG). Promjene nabora su normalizirane na vrijednosti kontrolnog stanja.
Kvantifikacija ekspresije miRNA. Kvantifikacija ekspresije miRNA je izvršena korišćenjem miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Danska). Nakon RT, cDNK šablon je amplificiran korištenjem mikroRNA-specifičnih LNA prajmera za zreli miR150-5p ili miR-495-3p (Exiqon, Feedback, Danska). qRT–PCR je izveden u 96-bunar Bio-Rad CFX96 PCR sistemu u realnom vremenu sa C1000 Thermal Cycler koristeći iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) prema uputama proizvođača . Ct vrijednost za triplikatne jažice dobijena je iz svake krive amplifikacije pomoću softvera CFX Manager Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Ct vrijednosti su normalizirane na endogenu kontrolnu 5S rRNA. Nivoi miRNA u plazmi su normalizovani na miR-103a-5p. Relativna ekspresija miRNA određena je metodom 2 − ΔΔCt [17]. Promjene nabora su normalizirane na vrijednosti kontrolnog stanja.
Mišji modeli fibroze bubrega. Miševi su smješteni u objektu za životinje bez specifičnih patogena (SPF) u CBMSO u skladu sa propisima EU za sve procedure. Sa životinjama se postupalo u skladu sa Vodičem za njegu i korištenje laboratorijskih životinja sadržanim u Direktivi 2010/63/EU Evropskog parlamenta. Odobrenje je dao lokalni odbor za etičku reviziju Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa" u Madridu, Etički komitet pri CSIC-u i Regulatorna jedinica za eksperimentalne postupke na životinjama Comunidad de Madrid.
Unilateralna opstrukcija uretera (UUO): UUO operacija je izvedena kao što je prethodno opisano [18]. Ukratko, miševi su anestezirani izofluranom (3-5 posto za indukciju i 1-3 posto za održavanje) i podijeljeni u dvije eksperimentalne grupe: UUO grupu i grupu lažne operacije. U UUO grupi, miševi su obrijani na lijevoj strani trbuha, skalpelom je napravljen vertikalni rez kroz kožu i koža je uvučena. Drugi rez je napravljen kroz peritoneum kako bi se otkrio bubreg. Lijevi mokraćovod je dva puta podvezan hirurškom svilom 15 mm ispod bubrežne karlice, a mokraćovod je zatim prekinut između dvije ligature. Zatim je podvezani bubreg nežno vraćen u ispravan anatomski položaj i dodan je sterilni fiziološki rastvor da bi se nadoknadio gubitak tečnosti. Rezovi su zašiveni, a miševi su odvojeni u kavezima. Lažna operacija izvedena je na sličan način, ali bez ligacije uretera. Buprenorfin je korišten kao analgetik. Prva doza je primijenjena 30 min prije operacije, a zatim svakih 12 h tokom 72 h, u dozi od 0,05 mg/kg subkutano. U ovom modelu, bubrežni protok krvi i brzina glomerularne filtracije postaju značajno smanjeni u roku od 24 h, a intersticijalna upala (vrhunac na 2-3 dana), tubularna dilatacija, tubularna atrofija i fibroza su evidentni nakon 7 dana. Opstruirani bubreg dostiže maksimalnu disfunkciju oko 2 sedmice nakon zahvata. Miševi su žrtvovani predoziranjem CO2, a kontrolni i opstruirani uzorci bubrega i krvi su sakupljeni nakon perfuzije sa PBS-om 3, 5, 7, 10 i 15 dana nakon UUO.
Nefropatija izazvana folnom kiselinom (FAN): U ovom modelu, fibroza bubrega je izazvana intraperitonealnom (ip) injekcijom sa 250 mg folne kiseline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) po kg tjelesne težine otopljene u 0.3 M natrijum bikarbonat (nosilac) kao što je prethodno opisano [19]. Kontrolne životinje su dobile 0,3 ml vehikuluma (ip). Miševi su žrtvovani predoziranjem CO2, a uzorci bubrega i krvi su sakupljeni nakon perfuzije sa PBS nakon 15 dana primjene FA.
mikroRNA profilisanje. Za identifikaciju specifičnih miRNA koje reguliraju fibrozni ishod, Custom miRCURY LNA mikroRNA niz (Exiqon, Feedback, Danska) je odabran kao platforma za profiliranje mikroRNA. Ova platforma se sastojala od ukupno 175 jedinstvenih testova specifičnih za mišje miRNA prisutne u Sanger miRBase v22.1 (http://microrn a.sanger.ac. UK). Za svaku mikroRNA, za analizu je odabran preovlađujući lanac. Selekcija MiR-a je zasnovana na predviđenim ciljnim genima koji se odnose na bubrežnu fibrozu, mitohondrijski metabolizam, redoks procese i cirkadijalni ritam. Ova analiza je urađena sa bioinformatičkim alatima za predviđanje cilja miRNA zasnovano na sekvenci, mikrokosmos [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) i miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Nakon ekstrakcije RNK iz 7-dnevnih UUO uzoraka bubrega, frakcija miRNA prisutna u 20 ng ukupne RNK podvrgnuta je reverznoj transkripciji korištenjem miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Danska) prema uputama proizvođača. Dobijeni cDNK su analizirani sa miRCURY miRNA PCR panelima u Roche LightCycler 480 PCR sistemu u realnom vremenu koristeći miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Danska). Svaki uzorak je analiziran u duplikatu. Ova procedura je obavljena u Genomičkoj ustanovi Fundacion Parque Científico de Madrid (Madrid, Španija). Softver LC480 je korišten za dobivanje vrijednosti Cq (Cq) za svaku miRNA. Delta Ct (ΔCt) vrijednost je izračunata normalizacijom vrijednosti Ct na snRNAU6 endogenog domaćinstva. Toplotna mapa je generisana sa PCR podacima u realnom vremenu predstavljenim kao ΔCt. Hijerarhijsko grupisanje je izgrađeno prema ΔCt vrijednostima. Delta Ct (ΔΔCt) vrijednost je izračunata oduzimanjem ΔCt referentne grupe uzoraka (kontrolnog bubrega) od ΔCt svakog opstruiranog uzorka bubrega. Relativna kvantifikacija (RQ) ili fold-change svake miRNA je generirana korištenjem 2 − ΔΔCt metode [17]. Diferencijalno izražene miRNA su identifikovane parametarskim Limma testom. Kako bi se testiranje više hipoteza uzeli u obzir, P-vrijednosti su prilagođene (prilagođene) korištenjem Benjamini-Hochbergove korekcije stope lažnog otkrivanja (FDR) [25]. Rezultati su prikazani na grafikonu vulkana.
analiza miRNA u krvnoj plazmi pacijenata sa CKD. Nivoi odabranih miRNA su analizirani u uzorcima plazme iz kohorte od 100 pacijenata sa CKD, što je detaljno opisano u nastavku. Periferna venska krv je sakupljena u EDTA sprejom obloženim vakutainerima (BD, Franklin Lakes, NJ). Da bi se dobila plazma, krv je centrifugirana na 400 g tokom 20 minuta, supernatant je prebačen u novu epruvetu i centrifugiran na 800 g tokom 20 minuta. Plazma je sakupljena i pohranjena zamrznuta u alikvotima na -80 ◦ C. MiRNA plazme je ekstrahirana iz krvi korištenjem kompleta za izolaciju miRCURYTM RNA—Biofluids i UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Danska). Analize nivoa miR-150 u ovim uzorcima su obavljene kao što je opisano u odjeljku postupka kvantifikacije ekspresije miRNA. Mjerenja potrošnje kisika. Brzina potrošnje kisika povezana s oksidacijom masnih kiselina (OCR) (vezana za oksidativnu fosforilaciju) i stopa ekstracelularne acidifikacije (ECAR) (povezana s proizvodnjom laktata i glikolizom) proučavane su korištenjem metaboličkog analizatora Seahorse Bioscience prema uputama proizvođača [26]. HKC-8 ćelije su zasijane u p60 ploču i transfekcija mikroRNA je izvedena kao što je gore opisano kada su dostigle konfluentaciju od 70 posto 48 h kasnije, HKC-8 ćelije su tretirane sa 10 ng/ml TGF{{ 18}} 48 h. Zatim su ćelije zasijane u količini od 2 × 104 ćelije po jažici u mikroploču za kulturu ćelija Seahorse Bioscience XFe24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Nakon adherencije ćelija, medijum za rast je zamenjen medijumom ograničenim na supstrat, Dulbeccovim modifikovanim medijumom Eagle (DMEM) sa dodatkom 0,5 mM glukoze i 1 mM glutamata. Jedan sat prije mjerenja testa, ćelije su inkubirane sa Krebs-Henseleit puferom (KHB) medijumom za ispitivanje sa dodatkom 0,2 posto karnitina na 37 ◦ C bez CO2. Petnaest minuta prije analize, inhibitor CPT1 Etomoksir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 μM je dodat u odgovarajuće jažice, a ćelije su inkubirane na 37 ◦ C bez CO2. Konačno, neposredno prije analize, dodat je BSA ili 200 μM palmitat-BSA FAO supstrat (Agilent Technology, Santa Clara, Kalifornija, SAD). Odmah je izveden XF Cell Mito Stress Test u energetskom analizatoru Seahorse XFe24 dodavanjem uzastopno nekoliko modulatora mitohondrijalne funkcije. Prvo, inhibitor ATP sintaze oligomicin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM) je korišten nakon bazalnog mjerenja. Ovo smanjuje protok elektrona kroz ETC, što rezultira smanjenjem mitohondrijalnog disanja. Zatim je dodan agens za odvajanje cijanid 4-(trifluorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), koji urušava protonski gradijent i remeti potencijal mitohondrijalne membrane. Kao rezultat toga, protok elektrona kroz ETC nije inhibiran, a potrošnja kiseonika kompleksom IV dostiže svoj maksimum. Treća i posljednja injekcija je mješavina inhibitora kompleksa III i I antimicin/rotenon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Ova kombinacija isključuje mitohondrijalno disanje i omogućava izračunavanje nemitohondrijalnog disanja potaknuto procesima izvan mitohondrija. Supstrati/inhibitori su pripremljeni u istom medijumu u kojem je sproveden eksperiment i automatski su ubrizgani iz portova za reagens u naznačeno vreme. Mjerenja su registrovana za 3-min periode vremena (u ukupnom periodu od 2 h) i vrijednosti su normalizirane za ukupni sadržaj proteina. Protein je ekstrahovan iz jažica sa 0,1 posto NP-40-PBS rastvora i kvantifikovan testom BCA proteina (Thermo Scientific, Rockford, IL). Za svaku eksperimentalnu grupu korištena su četiri bunara. XFp Cell Mito Stress test morskog konja korišten je za određivanje ključnih parametara mitohondrijske funkcije: bazalno mitohondrijsko disanje, ATP-vezano disanje, curenje protona (ne-- ATP-vezana potrošnja kisika), maksimalno disanje, nemitohondrijsko disanje i rezervni respiratorni kapacitet, kao što je prethodno opisano [27].
Luciferazni test. Za karakterizaciju mjesta vezanih kandidata za miRNA-150 i miRNA-495 u ljudskom CPT1A 3′-UTR, test luciferaze koji sadrži CPT1A 3′-UTR (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product Korišten je ID S814347). Mutacije usmjerene na mjesto u sjemenskim regijama predviđenih miR-150 i miR-495 lokacija unutar 3′ - UTR generirane su korištenjem kompleta za mutagenezu usmjerenu na Multisite-QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) prema prema protokolu proizvođača. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Sve konstrukcije su sekvencionirane prije upotrebe kako bi se potvrdilo da su pravilne strukture. HKC-8 ćelije su posađene u ploču sa ap24-jažicom i prolazno su kotransficirane sa 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (neoštećene ili mutirane konstrukcije) i 4 ng pGL3-Promotor (luciferaza krijesnice pod kontrolom promotora SV40) (Promega Corporation, Madison, WI, SAD) reporterski plazmidi i 40 nM bilo koje mirVana™ miRNA koja oponaša miR-150, miR -495 ili mirVana™ miRNA imitiraju negativnu kontrolu (kompanija Ambion, SAD) koristeći lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kada su dostigli konfluence od 70 posto kako je gore opisano. Za svaku eksperimentalnu grupu korištena su četiri bunara. Luciferazni testovi su izvedeni 24 h kasnije koristeći Dual-Luciferase reporter sistem (Promega, Madison, WI). Signali luciferaze vanile i krijesnice detektovani su korišćenjem Glomax multi detekcionog sistema (Promega Corporation, Madison, WI, SAD). Aktivnost luciferaze renila normalizovana je aktivnošću luciferaze krijesnice.
Potencijal mitohondrijske membrane (MMP). Promjene u MMP su određene kao razlike u fluorescenciji tetrametilrodamin metil estera (TMRM) (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD). Akumulira se u negativno nabijenim polariziranim mitohondrijama i fluorescira u narandžastoj boji. Kada se potencijal mitohondrijalne membrane sruši u apoptotičkim ili metabolički stresnim ćelijama, TMRM reagens se raspršuje po citosolu ćelije i nivoi fluorescencije dramatično padaju. HKC-8 ćelije su kultivisane i transficirane kao što je opisano u odjeljcima o ćelijskoj kulturi i postupku transfekcije. Zatim je medij za rast zamijenjen Hankovom uravnoteženom otopinom soli (HBSS) bez fenola sa 10 mM Hepesa. Tretmani oligomicinom (5 μM) i FCCP (4 μM) u trajanju od 5 minuta korišteni su kao pozitivni i negativni kontrolni uvjeti. Zatim su ćelije obojene sa 250 nM TMRM 30 minuta na 37 ◦ C. Ćelije su sakupljene tripsinom, centrifugirane (3000 o/min, 5 min) i peleta je resuspendirana u 200 μL HBSS sa 1 posto Goveđi serumski albumin (BSA) i 5 mM etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA). Intenzitet fluorescencije mjeren je protočnom citometrijom korištenjem talasne dužine emisije od 570 nm za TMRM (FL2) [28] u sistemu BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) i analiziran pomoću softvera FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ash , OR). Za svako eksperimentalno stanje analizirano je najmanje 20.000 singleta u tri primjerka.
Proizvodnja anjona radikala mitohondrijalnog superoksida. Evaluacija proizvodnje anjona superoksidnih radikala obavljena je korištenjem Mito-SOX™ Red mitohondrijalnog superoksidnog radikal anionskog indikatora (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), visoko selektivne fluorogene boje za mitohondrijski superoksidni radikal anion u živim stanicama, prema proizvođačevoj instrukcije. HKC-8 ćelije su kultivisane i transficirane kako je opisano u odjeljcima o kulturi ćelija i transfekcijskim postupcima. Zatim je medij za rast zamijenjen Hankovom uravnoteženom otopinom soli (HBSS) bez fenola sa 10 mM Hepesa. Tretman antimicinom A (150 μM) i karbonil cijanidom m-klorofenilhidrazonom (CCCP) (50 μM) u trajanju od 5 minuta korišteni su kao pozitivni i negativni kontrolni uvjeti. Zatim su ćelije obojene sa 5 μM MitoSOX™ Red tokom 30 minuta na 37 ◦ C. Ćelije su sakupljene kako je opisano u odjeljku o potencijalu mitohondrijalne membrane. Intenzitet fluorescencije mjeren je protočnom citometrijom korištenjem talasne dužine emisije od 580 nm za MitoSOX™ Red (FL2) u sistemu BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) i analiziran pomoću softvera FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland ILI). Za svako eksperimentalno stanje analizirano je najmanje 20,000 singleta u tri primjerka.
Mitohondrijalno obeležavanje. Evaluacija mitohondrijalnog sadržaja izvršena je korištenjem MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), koji pasivno difundira kroz plazma membranu i akumulira se u aktivnim mitohondrijima bez obzira na potencijal mitohondrijske membrane, prema uputama proizvođača. HKC-8 ćelije su kultivisane i transfektovane kao što je opisano u odjeljcima o ćelijskoj kulturi i postupku transfekcije. Zatim je medij za rast zamijenjen Hankovom uravnoteženom otopinom soli (HBSS) bez fenola sa 10 mM Hepesa. Ćelije su obojene sa 150 nM sa MitoTracker™ zelenim FM tokom 30 minuta na 37 ◦ C. Za analizu protočne citometrije, ćelije su sakupljene kako je opisano u odjeljku potencijala mitohondrijalne membrane. Intenzitet fluorescencije je mjeren korištenjem talasne dužine emisije od 516 nm sa MitoTracker™ zelenim FM (FL1) u sistemu BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) i analiziran pomoću softvera FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC , Ashland, OR). Za svako eksperimentalno stanje analizirano je najmanje 20,000 singleta u tri primjerka. Za fluorescentno snimanje, jezgra su takođe obojena DAPI (Sigma, St. Louis, MO) 5 minuta na sobnoj temperaturi. Žive ćelije su vizualizovane invertovanim Zeiss LSM 710 konfokalnim mikroskopom sa posmatranom ćelijom, objektivom 63X/1,2 vode C-Apohromat Corr UV-VIS-IR M27 i analizirane softverom Zeiss Zen2010B sp1 (Zeiss, Oberkochen, Nemačka) .
Određivanje broja kopija mitohondrija. Genomska DNK je ekstrahirana iz HKC-8 ćelija koristeći DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) prema uputama proizvođača. Brojnost mitohondrija određena je pomoću kompleta za analizu broja kopija ljudske mitohondrijske DNK (Detroit R&D, Detroit, MI). Relativni broj kopija mtDNK predstavljen je kao omjer mtDNK prema nuklearnoj DNK.
Uzorci pacijenata sa CKD kod ljudi. Za analizu nivoa miRNA u plazmi odabrana je kohorta od 100 pacijenata sa CKD (stadijum 3-4) iz bolnice Principe de Asturias. Uključuje dvije različite podgrupe klasificirane prema evoluciji njihove bubrežne funkcije na osnovu GFR MDRD indikatora [29] u periodu od 24 mjeseca: 50 pacijenata imalo je manje od 10 postobubregpogoršanje funkcije dok su ostali doživjeli barem 40 posto smanjenje funkcije bubrega ili su započelibubrežnizamjenska terapija (dijaliza). Takođe smo kvantificirali stepen fibroze ububregbiopsije iz različite skupine od 26 pacijenata s disfunkcijom transplantatabubregtransplantacija iz bolnice Ramn y Cajal. Sve biopsije su procijenjene prema Banff 2007 kriterijima [30].
Statistička analiza. Podaci su analizirani korištenjem neparametarskih testova osim gdje je naznačeno. Razlika između dvije nezavisne grupe ispitivana je Mann-Whitney testom, dok je više od dvije grupe upoređeno Kruskall-Wallisovim testom. P-vrijednost od 0.05 ili manje se smatra statistički značajnom (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0,001).="" podaci="" su="" analizirani="" pomoću="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" podaci="" se="" prikazuju="" kao="" srednja="" vrijednost="" ±="" standardna="" greška="" srednje="" vrijednosti="">
3. Rezultati
Podaci o ekspresiji miRNA u UUO-indukovanoj fibrozibubrezi. Dešifrirati doprinos miRNA metaboličkoj regulacijibubrežnifibrogeneze, 7-dnevni UUO model je izveden na WT miševima. RNK je izolirana iz kontrolne i fibroznebubreguzorci i profil ekspresije miRNA je analiziran u prilagođenom nizu mikroRNA. Odabir miRNA je zasnovan na njihovom potencijalnom ciljanju ključnih enzima uključenih u mitohondrijski metabolizam, redoks procese i cirkadijalni ritam nakon analize „in silico“ (više detalja u odjeljku Metode). Toplotna mapa je otkrila jasno različite obrasce ekspresije u nekim miRNA kada se uporede fibrozne i kontrolnebubreguzorci (slika 1A). Analiza vulkanskog dijagrama pokazala je da su 73 od 175 miRNA bile različito eksprimirane, 17 naviše i 56 naniže, u uzorcima fibroznih bubrega u poređenju sa kontrolnim (Slika 1B, Dodatna tabela 1). Među njima su odabrane specifične miRNA koje bi mogle regulirati fibrozni ishod u bubrezima putem metaboličkih puteva. U tu svrhu, in silico analiza 3′UTR (netranslated region) specifičnih gena uključenih u metaboličke i mitohondrijalne funkcije, CPT1A, TFAM, PGC1A izvedena je sa tri nezavisna alata za predviđanje (Targetscan, miRWalk i miRanda). Kriterijumi odabira su takođe uključivali nivo bubrežne ekspresije, novost ciljeva, stepen znanja o metaboličkom putu i biološki značaj. Veza sa ljudskom patologijom, nivoom ekspresije bubrežnog tkiva, njihovom ulogom u mitohondrijskom metabolizmu i njihovim potencijalnim ciljanjem enzima za prijenos masnih kiselina CPT1A potaknuli su nas da se fokusiramo na tri miRNA, miR-150-5p, miR-495-3p i miR-33-5p, kao kandidati sposobni da regulišu metaboličke promene povezane sa bubrežnom fibrogenezom (slika 1C). Treba napomenuti da CPT1A 3′-UTR sadrži jedno mjesto sjemena za miR-150 i dva sjemena mjesta za miR-495. Primijetili smo da miR-150 i miR-495 smanjuju aktivnost luciferazne reporterske analize koja sadrži CPT1A 3′-UTR za ~15 posto, odnosno 25 posto. Ova regulacija je u potpunosti poništena u slučaju tačkastih mutacija (PMs) u 3′-UTR CPT1A za miR-150 vezujuće mjesto (PM2) i djelimično odsutna u oba miR-495 vezivna mjesta (PM1 i PM3) (dodatna slika 1A i B). Ovi podaci ukazuju na direktnu interakciju CPT1A sa miR-150 i miR-495. MiR-33-5p je bio predmet posebne studije [15]. MiR-150-5p i miR{48}}p su povećani u fibroznim uzorcima bubrega u poređenju sa kontrolnim, sa promjenom puta od 3,69 (P-vrijednost: 0.012 ) i 1,95 (P-vrijednost: 0,012), respektivno.
MiR-150 i miR{1}} poboljšavaju TGF-profibrotski odgovor kod ljudibubrežnitubularne epitelne ćelije. Urađena je kvantitativna reverzna transkripcija – lančana reakcija polimeraze (qRT-PCR) kako bi se potvrdila promjena ekspresije miR-150-5p i miR-495-3p koja je identificirana profiliranjem ekspresije miRNA u UUObubreguzorci (sl. 2A i B). Osim toga, qRT-PCR-om je analizirana kinetika ekspresije miR-150-5p i miR- 495-3p u bubrezima 3, 5, 7, 10 i 15 dana nakon UUO procedure. Ekspresija ovih miRNA je značajno povećana 2- puta 5 dana nakon UUO i ostala je povišena 15 dana nakon UUO (sl. 2C i D). Nivo ekspresije ovih miRNA je također procijenjen u modelu nefropatije folne kiseline (FAN). Pronašli smo 4- i 2-prestruku regulaciju miR-495-3p i miR-150-5p, respektivno, u fibroznombubreguzorci iz modela FAN (slika 2E). TGF- 1, jedan od glavnih regulatora fibrogeneze, je također inducirao miR-150 i miR-495 ekspresiju u HKC-8 ćelijama više nego 2-puta i {{ 6}} puta, respektivno, nakon 48 h, podržavajući potencijalnu ulogu ovih miRNA u događajima povezanim sa TGF signalizacijom (Slike 3A i B). Da bi se procijenilo da li su miR-150 i miR-495 bili uključeni u profibrotsku transformaciju tubularnih epitelnih ćelija pomoću TGF- 1, ljudska ćelijska linija HKC-8 je transficirana miR -150-5p ili miR-495-3p i tretirani TGF- 1 različito vrijeme. Povećanje nivoa miR-150-5p i miR-495-3p značajno je poboljšalo TGF- 1-indukovanu ekspresiju mRNA nivoa markera Acta2, Col1 1 i Fn1 povezanih s fibrozom ( sl. 3C i D). Slično, prekomjerna ekspresija miR-150-5p ili miR{29}}p snažno je smanjila CPT1A i povećala obilje proteina -SMA (slike 3E i F). Ovi podaci sugeriraju da ove miRNA mogu učestvovati u patogenezibubrežnifibroze promicanjem TGF- 1-zavisne epitelne dediferencijacije tubularnih ćelija, kao i kompromitacijom ekspresije kritičnog enzima uključenog u FAO.
MiR-150 i miR-495 indukuju mitohondrijalne bioenergetske promjene i smanjuju ekspresiju gena uključenih u ključnu funkciju mitohondrija. Kako bismo stekli uvid u metaboličke posljedice izazvane primjenom miR-150-5p ili miR-495-3p, proučavali smo bioenergetski profil čovjekabubrežnitubularne epitelne ćelije.
Slika 1. Podaci o ekspresiji miRNA u UUO-indukovanoj fibrozi. (A) Toplotna mapa koja pokazuje relativnu ekspresiju miRNA kontralateralne i opstruiranebubreziod C57/BL6-J miševa podvrgnutih UUO proceduri tokom 7 dana (n=6). Traka skale se kreće od zelene do crvene (visoke do niske ekspresije), a brojevi predstavljaju vrijednosti ΔCt. Na lijevoj strani su naznačene miRNA odabrane za proučavanje. (B) Analiza vulkanskog dijagrama UUO-moduliranih miRNA. Log10 relativna kvantifikacija (RQ) i negativna (−) log10 prilagođena (prilagođena) P-vrijednosti su iscrtane na x- i y-osi, respektivno. Svaka miRNA je predstavljena tačkom. 73 od 175 miRNA pokazalo je izmijenjenu ekspresiju u fibroznim uzorcima (prilagođena P-vrijednost veća ili jednaka 0,05). Odabrane miRNA za dalju analizu su istaknute. (C) miR-150-5p i miR-495-3p su odabrani na osnovu njihove moći za in silico ciljanje gena CPT1A, TFAM i PGC1A. Za svaku odabranu mikroRNA, naznačena su očuvana ciljna mjesta sjemena u 3'UTR ovih gena, njihova promjena nabora i značaj (prilagođena P-vrijednost).
Slika 2. Nivoi ekspresije miR-150-5p i miR-495-5p inbubreziod modela UUO i FAN. (A, B) qRT-PCR analiza miR-150-5p (A) i miR-495- 3p (B) ekspresije ububreziod miševa 7 dana nakon UUO u uzorcima prethodno analiziranim mikroRNA nizom. (C–E) qRT-PCR analiza ekspresije miR-150-5p i miR-495-3p nakon FAN modela (C) i 3, 5, 7, 10 i 15 dana nakon UUO za miR-150-5p (D) i miR{{10}}p (E). Stupasti grafikoni predstavljaju srednju vrijednost nivoa ekspresije promjene nabora ± sem od 6 (A, B, E) i 3 (C i D) miševa po grupi. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" u="" poređenju="" sa="" njihovim="" odgovarajućim="" kontrolnim="" uslovima;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" u="" poređenju="" sa="">bubreziod miševa sa istim eksperimentalnim tretmanom.
TGF- 1 je korišten kao model citokina uključen u promjene povezane s profibrozom. Da bi se odredio bioenergetski status ovih ćelija, FAO povezana stopa potrošnje kiseonika (OCR) i stopa ekstracelularne acidifikacije (ECAR) HKC-8 ćelija su izmerene tokom sekvencijalnog tretmana sa jedinjenjima koja moduliraju mitohondrijalnu aktivnost u prisustvu palmitata , koristeći Seahorse XF24 Extracelular Flux Analyzer (više detalja u odjeljku Metode). Nakon 48h sa TGF- 1, HKC-8 ćelije u prisustvu miR-150-5p pokazale su konzistentan pad bazalnog, OCR spojenog sa stvaranjem ATP-a, ATP-vezano disanje i maksimalno disanje, što odnosi se na FCCP-osjetljiv OCR (slika 4A). Oštećenje u OXPHOS-u ogledalo se u smanjenju sadržaja ATP-a u HKC-8 ćelijama koje prekomjerno eksprimiraju miR-150-5p (slika 4C). Nismo primijetili da ove miRNA izazivaju varijacije u ECAR-u (podaci nisu prikazani). U skladu s tim, nivoi ekspresije mRNA njihovih mitohondrijalnih
srodni ciljni geni CPT1A, PGC1 i mitohondrijalni transkripcijski faktor A (TFAM), smanjeni su za polovinu u ćelijama tretiranim miR-150 mimikom u poređenju sa ćelijama koje oponašaju miRNA NC-tretirane (slika 4E). Studije koje su koristile isti eksperimentalni pristup sa miR-495-3p su dale slične rezultate (sl. 4B, D, F). Međutim, mitohondrijalna masa, određena brojem kopija mtDNA i bojenjem mitohondrija sa MitoTrackerTM zelenim FM, nije bila značajno modulirana miRNA-150 i miRNA- 495 kako u bazalnim uslovima tako i pod tretmanom TGF. U osnovi je uočen trend smanjenja ovog parametra (dodatna slika 2A, B, C). Sve u svemu, ovi podaci podržavaju da miR-150 i miR-495 promoviraju a
profibrozno djelovanje u tubularnim epitelnim stanicama kroz oštećenje mitohondrijalne funkcije.
MiR-150 i miR-495 ne mijenjaju mitohondrijski transmembranski potencijal (ΔѰm) i mitohondrijski superoksidni radikal
Slika 3. MiR-150 i miR-495 pojačavaju TGF- 1-zavisni profibrotski odgovor kod ljudibubrežnitubularne epitelne ćelije. (A, B) RT-PCR analiza ekspresije miR{{0}}p (A) i miR-495-3p (B) u HKC-8 ćelijama tretiranim sa 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 za navedena vremena. (C, D) nivoi mRNA alfa-aktina glatkih mišića (-SMA), alfa 1 tip-1 kolagena (Col1 1), fibronektina (FN) iz ćelija transficiranih sa miR-NC i mimičnim miR -150-5p (C) ili miR-495-3p (D) određeni su qRT-PCR koristeći Sybr green. Ćelije su tretirane sa TGF- 1 (10 ng/ml) nakon prekomjerne ekspresije miRNA gdje je naznačeno (vidi također odjeljak o metodama). (E, F) Imunoblotovi koji prikazuju nivoe CPT1A i -SMA nivoe proteina u ćelijama transficiranim miR-NC i oponašaju miR-150-5p (E) ili miR{{20}}p (F) za naznačene vremenske tačke. GAPDH je korišten u svrhu normalizacije. Stupasti grafikoni (desni paneli) predstavljaju srednju vrijednost izraza promjene nabora ± sem iz 3 nezavisna eksperimenta. *P < {{30}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" u="" poređenju="" sa="" njihovim="" odgovarajućim="" kontrolnim="" uslovima;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" u="" poređenju="" sa="" ćelijama="" tretiranim="" mir-nc="" sa="" istim="" eksperimentalnim="">
Slika 4. MiR-150 i miR-495 pojačavaju TGF 1-indukovanu FAO represiju u HKC-8 ćelijama. (A, B) Stopa potrošnje kiseonika (OCR) HKC-8 ćelija transficiranih sa
40 nM miR-NC i imitiraju miR-150-5p (A) ili miR-495-3p (B) i izloženi 10 ng/ml TGF{{5} } nakon prekomjerne ekspresije miRNA (vidi također odjeljak o metodama). Stupasti grafikoni (desni paneli) pokazuju stope OCR-a povezane sa bazalnim, protonskim curenjem, ATP-vezanim, maksimalnim i rezervnim kapacitetima i nemitohondrijalnim respiratornim statusima. Podaci su predstavljeni nakon normalizacije količinom proteina. (C, E) Nivoi ATP-a u HKC-8 ćelijama transficiranim miR-NC i oponašaju miR-150-5p (C) ili miR-495-3p (E). (D, F) nivoi mRNA CPT1A, PGC1A i TFAM u HKC-8 ćelijama transficiranim miR-NC i mimikom miR-150-5p (D) ili miR-495-3p (F) su određen qRT-PCR koristeći Sybr green. Stupasti grafikoni pokazuju srednju vrijednost ± sem 4 nezavisna eksperimenta. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" u="" poređenju="" sa="" njihovim="" odgovarajućim="" kontrolnim="" uslovima;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" u="" poređenju="" sa="" ćelijama="" tretiranim="" mir-nc="" sa="" istim="" eksperimentalnim="">
proizvodnja anjona. Potencijal mitohondrijske membrane (ΔΨm) generiran protonskim pumpama (kompleksi I, III i IV) je bitna komponenta u procesu skladištenja energije tokom oksidativne fosforilacije. Povećani ΔẰm može dovesti do mitohondrijalnog redoks perturbacije, dok njegovo smanjenje uzrokuje smanjenje proizvodnje ATP-a, ugrožavajući vitalnost ćelije [254]. Anjon superoksidnih radikala (O2•−) je slobodni radikal koji se može stvoriti u mitohondrijima kao posljedica curenja elektrona koje se može dogoditi unutar nekoliko koraka ETC. Generisanje O2•− unutar mitohondrijalnog matriksa takođe kritično zavisi od NADH/NAD plus i CoQH2/CoQ odnosa i lokalne koncentracije O2 [255]. Njegova prekomjerna proizvodnja može dovesti do gubitka mitohondrijalne redoks homeostaze kroz različite mehanizme, stanje koje je povezano s mnogim patološkim stanjima uključujući AKI i CKD [201]. ΔẐm je ispitivan TMRM bojom i produkcija anjona superoksid radikala sa MitoSOX bojom. Prvo smo potvrdili ove testove tretiranjem ćelija sa FCCP i CCCP kao negativnim kontrolama, za TMRM i MitoSOX respektivno, i oligomicinom i Antimicinom A kao pozitivnim kontrolama, za TMRM i MitoSOX respektivno, u ljudskoj ćelijskoj liniji HKC{{7} }. U slučaju TMRM testa, tretman oligomicinom je inducirao 3-putostruko povećanje srednje fluorescencije TMRM u poređenju sa kontrolnom bojom, dok je tretman FCCP rezultirao 9- puta smanjenjem. Antimicin A i CCCP su proizveli 35-putostruko povećanje i 2-putostruko smanjenje, respektivno, u MitoSOX testu (dodatna slika 3A i B). Da bi se utvrdilo da li su miR-150 i miR-495 efekti na metabolizam mitohondrija izazvali promjene u ovim parametrima, HKC-8 ćelije su transficirane sa miR-150-5p ili miR{{17} }p mimic ili odgovarajući miR-NC. Nisu pronađene statistički značajne razlike u kvantifikaciji fluorescencije TMRM ili MitoSOX sondi između uslova tretmana sa odabranim miRs i miR-NC (dodatna slika 3C).
Nivoi MiR-150 i miR-495 nisu pogođeni u uzorcima plazme i bubrega pacijenata sa CKD. Procijenili smo ekspresiju odabranih miRNA u biopsijama plazme i bubrega pacijenata sa CKD. Analiza biopsija bubrega od 26 pacijenata (Hospital Ramn y Cajal) nije pokazala korelaciju između stepena fibroze i nivoa miR-150-5p odnosno miR-495-3p (dodatna slika 4A i B) . Cirkulirajući nivoi miR-150-5p u plazmi, miRNA sa najvećom ekspresijom bubrega od ova dva, takođe su određeni u kohorti od 100 pacijenata sa CKD (Hospital Principe de Asturias). Zbog ograničenja dostupnosti uzoraka, nismo uspjeli odrediti serumske vrijednosti miR- 495-3p u ovoj kohorti. Ovi pacijenti su prethodno bili podijeljeni u dvije podgrupe na osnovu evolucije njihove bubrežne funkcije u periodu od 24 mjeseca, tako da je 50 pacijenata imalo manje od 10 posto pogoršanja funkcije bubrega, dok je kod ostalih došlo do smanjenja bubrežne funkcije od najmanje 40 posto. funkcija. qRT-PCR kvantifikacija nivoa miR-150-5p u plazmi nije pokazala jasan trend prema diferencijalnoj ekspresiji u dvije podgrupe pacijenata (dodatna slika 4C).
4. Diskusija
Otkriće miRNA kao ključnih regulatora patofizioloških procesa podstaklo je istraživanje njihove upotrebe kao terapeutskih agenasa u gotovo svim kliničkim uvjetima, uključujući bubrežnu bolest [31]. Bubrežna fibroza je veoma rasprostranjen ishod hronične bubrežne bolesti (CKD) sa nezavisnošću od etiologije, a njeno prisustvo je jasan prediktor evolucije. Stoga je značajan napor uložen u identifikaciju miRNA povezanih s fibrozom bubrega [32,33]. U ovoj studiji smo se fokusirali na sve važniju ulogu metaboličkog poremećaja ububrežnioštećenjai identifikovali smo dvije miRNA, miR-150 i miR-495, koje su ranije bile nepoznate aktere na sceni. Štaviše, otkrili smo da imaju dubok učinak na ćelijsku bioenergetiku sinergijom s TGF-om i modificiranjem ključnih metaboličkih puteva povezanih s masnimkiselina oksidacija.
Povreda epitela koegzistira sa defektom masnog tkivakiselinaoksidacija, glavni izvor energije za tubularne epitelne ćelije [5]. To dovodi do njihove dediferencijacije koja izaziva oštećenje tubularne funkcije, izaziva zaustavljanje ćelijskog ciklusa i promoviše oslobađanje kritičnih profibrotičkih citokina koji mogu doprinijeti aktivaciji intersticijskih miofibroblasta [5,34]. MiR-150 i miR-495 ekspresija je povećana kod mišafibroznibubrezii učovjek bubregepitelnih ćelija (HKC-8) nakon tretmana sa TGF-, što ukazuje na njihovu uključenost u profibrotički odgovor. Od interesa, in silico analiza genomskih regija koje kodiraju za miR-150 i miR-495 dozvoljava identifikaciju mjesta vezivanja za faktore transkripcije koji se odnose na TGF-signalizaciju i druge puteve uključene u oštećenje UUO (pretrage u genecards.org za miR-150 i miR-495). I miR-150 i miR-495 smanjili su nivo ekspresije svojih ciljnih gena CPT1A, PGC1 i TFAM, što se odrazilo na smanjen bazalni, ATP-vezani i maksimalni sadržaj OCR i ATP nakon tretmana sa miR-150 i miR-495. Ovaj efekat je bio praćen pojačanim TGF-profibrotičnim odgovorom u HKC-8 ćelijama. Otkrili smo da je TGF smanjio mitohondrijalnu masu i mitohondrijsku DNK. Nakon tretmana miRNA-150 i miRNA-495, uočen je trend smanjenja mitohondrijalnog sadržaja u bazalnim uslovima, iako nije dostigao značaj. Ovo ukazuje na mehanizam neovisan o ulozi PGC1 ili TFAM-a i najvjerovatnije povezan s metaboličkim efektom povezanim sa smanjenjem regulacije CPT1A kao glavne varijable na koju utiče prisustvo miRNA. Promjene u mitohondrijskoj bioenergetici su kritične kod bolesti bubrega [35]. Imajući u vidu, nedavno smo pokazali da je CPT1A kritičan enzim za očuvanje zdravog tubularnog kompartmenta, jer njegova prekomjerna ekspresija štiti od fibroze bubrega [6]. Međutim, PGC1
i TFAM geni su također usko povezani s mitohondrijskom funkcijom i biogenezom [36]. Poremećena ekspresija ovih gena povezana je sa CKD, dok njeno očuvanje doprinosi integritetu bubrega kao što je prikazano u nekoliko modela oštećenja. Dakle, Han et al. otkrili su da tubularni dobitak funkcije PGC1 štiti miševe od fibroze bubrega izazvane Notchom i preokreće mitohondrijalnu disfunkciju povezanu s ovim modelom [37]. Slično, ponovna ekspresija Tfam u ćelijama tubula spriječila je Notch-indukovano metaboličko i profibrotično reprogramiranje [38]. Stoga je moguće zamisliti da smanjena ekspresija mRNA ovih mitohondrijskih gena, izazvana miR-150 i miR-495, također doprinosi oštećenom epitelnom fenotipu.
Pad koji smo uočili u OCR-u povezan sa oštećenjem epitelnih ćelija je u skladu s prethodnim izvještajima, uključujući naše studije sa miR-33 i miR-9 [15,16]. Dok Kang et al. također su izvijestili da je oksidacija glukoze bila niža u modelima fibroze bubrega kod ljudi i miša [5], naši podaci pokazuju da mikroRNA posredovano smanjenje OCR-a ne inducira per se varijacije u ECAR-u, sugerirajući da glikolitičko gašenje u fibroznim stanjima najvjerovatnije zavisi na fibrozne podražaje, a ne na poremećenu oksidativnu fosforilaciju. Nekoliko miRNA je identificirano kao glavni modifikatori mitohondrijalne funkcije, uključujući arhetipsku profibrotičnu miRNA, miR-21 [39]. Potiskivanje PPAR-ekspresije miR-21 je prizvano kao mehanizam kojim ova miRNA ispoljava svoje profibrotičko djelovanje. Osim što inhibiraju FAO, ciljni geni za miR-21 ukazuju na to da ova miRNA utišava širok spektar mitohondrijalnih procesa. Drugi primjeri uključuju mir-9 [16], miR-33 [15] i miR-30e [40,41]. Međutim, prema našim saznanjima, postoji nekoliko izvještaja koji se bave regulacijom mikroRNA gena CPT1A, PGC1 i TFAM u kontekstu fibroze bubrega. Zanimljivo je da mikroRNA-214 koja promoviše tranziciju epitela u mezenhim (EMT) tokom renalne fibroze direktno cilja TFAM u ćelijama raka debelog crijeva [42]. Ova represija je također prijavljena za miR-590-3p [43]. Porodica miR-29, jedan od najbolje okarakteriziranih regulatora proizvodnje ECM u fibrozi organa, direktno cilja na PGC1, čuvajući srčanu homeostazu. Dakle, patološko utišavanje miR-29 dovodi do regulacije PGC1, stvarajući duboke promjene u biogenezi mitohondrija koje doprinose srčanim bolestima [44]. Dok naši podaci jasno govore u prilog ulozi miR-150 i miR-495 u fibrozi bubrega, bila bi neophodna daljnja istraživanja in vivo da se potvrdi ova tvrdnja.
Da bismo procijenili integritet mitohondrijalnog lanca transporta elektrona (ETC), fokusirali smo se na dvije karakteristike: ΔѰm i produkciju anjona radikala superoksida. Uočili smo da miR-150 i miR-495 nisu promijenili ove parametre. Stabilan ΔḰm je neophodan za vitalnost ćelije i njegova veličina varira među tipovima ćelija [45]. Njegovo održavanje je striktno fino podešeno jer povećanje ΔḰm može dovesti do poremećaja u redoks stanju, dok njegovo smanjenje uzrokuje smanjenje proizvodnje ATP-a i može pokrenuti apoptozu. U našem istraživanju, promjene u ΔẐm su kvantificirane kationskom fluorescentnom bojom TMRM, dok je proizvodnja anjona radikala mitohondrijalnog superoksida mjerena fluorogenom bojom MitoSOX Red. Upotreba ovih sredstava u stanjima koja utiču na funkciju bubrega nije uočljiva u literaturi. Ipak, suočeni s odsustvom promjena u našoj studiji, nismo slijedili dubinske druge strategije za procjenu redoks hormeze, pa stoga ne možemo isključiti da ove miRNA mogu promijeniti nukleofilni ton ili funkciju nekoliko komponenti ETC.
U kliničkom okruženju, miR-150 je predložen kao profibrotička miRNA kod lupus nefritisa modulacijom TGF-signalizacije [46,47], dok je miR-495 bio povezan sa zaštitnom ulogom kod dijabetičara fibroza [48]. Da bismo saznali njihovu potencijalnu uključenost u CKD, procijenili smo njihov nivo u serumu i parenhima u dvije različite skupine pacijenata. Nivoi miRNA u serumu su predloženi kao potencijalni biomarkeri za progresiju CKD [49,50]. Dakle, nivoi miR-21 u cirkulaciji u serumu i obilje miR-29c u urinarnim egzosomima koreliraju sa fibrozom bubrega, što ukazuje na njihovu potencijalnu ulogu biomarkera [51, 52]. Međutim, nivoi miR-150 i miR-495 nisu se razlikovali ni u uzorcima plazme ni u uzorcima bubrega pacijenata sa CKD. Različiti obrasci ekspresije mikroRNA među vrstama i tipovima ćelija mogu objasniti ovo odsustvo razlike u nivoima miR-150 i miR-495 u fibroznom tkivu [53]. Dok bi u nekim slučajevima prijavljeni nivoi mikroRNA u plazmi mogli odražavati one u bubrežnom tkivu, treba uzeti u obzir i druge mehanizme koji se odnose na lučenje miRNA u cirkulatorni sistem ili protivtežu ovog lučenja od strane drugih organa [13,54].
Sve u svemu, naši rezultati podržavaju promociju miR-150 i miR-495bubrežniepitelnećelijadediferencijacija najvjerovatnije kroz deprivaciju energije, koju prenosi potiskivanje gena povezanih sa mitohondrijalnim funkcijama CPT1A, PGC1 i TFAM. Oni također pružaju osnovu za nastavak svoje uloge in vivo, kao i njihovu potencijalnu korisnost kao dijagnostički ili prognostički biomarkeri.
Doprinosi autora
SL je osmislio i usmjerio istraživanje. VM je dizajnirao, izveo i analizirao većinu eksperimenata. RR je pomogao u analizi mikroRNA niza. DRP i LGB su izveli studije na dvije različite kohorte pacijenata sa CKD. Svi autori su pomogli u raspravi o rezultatima, a SL i VM su napisali rukopis.
Izjava o konkurentnom interesu
Autori nemaju sukob interesa.
Priznanja
Ovaj rad je podržan grantovima španskog Ministarstva nauke SAF2015-66107-R i PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/ 01513 (DRP) sufinansiranih od strane Evropske Fond za regionalni razvoj, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 i RD16/ 0009/0016 (SL i DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017/BMD3751), (SL i DRP) bespovratna pomoć Španskog društva za nefrologiju (Fundacin Senefro 2017) za SL i FundacionRenal"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) svi iz Španije. CBMSO dobija institucionalnu podršku od Fondacije "Ramn Areces". VM je podržan od strane preddoktorske stipendije FPI programa (BES- 2013-065986) španskog Ministarstva nauke.
