Glutamatni receptor igra ulogu u odbrani od Botrytis Cinerea putem električne signalizacije u paradajzu

sažetak:

Biljni geni receptora za glutamat (GLR) su homologni genima jonotropnih glutamatnih receptora sisara (iGluR). Iako su GLR uključeni u odbranu biljaka od biotičkog stresa, odnos između GLR-posredovanog imuniteta biljaka protiv gljivičnih patogena i električnih signala ostaje slabo shvaćen. Ovdje smo otkrili da je predtretman inhibitorom GLR, 6,7-dinitrihinoksalinom-2,3-dionom (DNQX), povećao osjetljivost biljaka paradajza na nekrotrofni gljivični patogen Botrytis cinerea. Procjena glr3.3, glr3.5 i glr3.3/glr3.5 dvostrukih mutanata nakon infekcije B. cinerea pokazala je da su GLR3.3 i GLR3.5 paradajza neophodni za imunitet biljaka protiv B. cinerea, gdje je GLR3. 3 igra glavnu ulogu.

Analiza promjena membranskog potencijala izazvanih glutamatom (Glu) ili glicinom (Gly) pokazala je značajno smanjenu amplitudu nokautacijom GLR3.3 u paradajzu. Dok tretman sa Glu ili Gly značajno povećava imunitet protiv B. cinerea kod biljaka divljeg tipa, ovaj efekat je značajno oslabljen kod glr3.3 mutanata. Dakle, naši podaci pokazuju da je GLR3.3- i GLR3.{8}}posredovan imunitet biljaka protiv B. cinerea povezan sa električnim signalima u biljkama paradajza.

Jačina imuniteta direktno određuje naše zdravstveno stanje. Kada je imunitet jak, sposobniji smo da se borimo protiv bolesti i infekcija. S druge strane, ako je naš imunološki sistem slab, patogeni mogu lakše napasti naša tijela i uzrokovati da se razbolimo. Zbog toga je veoma važno održavati imuni sistem zdravim, koji se može poboljšati ishranom, vežbanjem i smanjenjem stresa.

U istraživanju je utvrđeno da Cistanche Herba može značajno poboljšati imunitet. Ukupni glikozidi Cistanche deserticola, Cistanche deserticola polisaharida i verbaskozida mogu značajno smanjiti sadržaj MDA u jetri i moždanom tkivu, te aktivnost telomeraze u srcu i moždanom tkivu. Fagocitna funkcija makrofaga je pojačana, a proliferativni odgovor limfocita i sadržaj IL-2 u perifernoj krvi je značajno povećan, čime se pojačava imunološka funkcija organizma.

Kliknite na zdravstvene prednosti cistanchea

1. Uvod

Biljke koje rastu u prirodnom okruženju stalno su ugrožene raznim patogenima. Ovi biotički stresori utiču na proizvodnju usjeva i često uzrokuju ekonomske gubitke. Kako biljkama nedostaje mobilnost, one su tokom evolucije stekle niz sistema za transdukciju signala kako bi efikasno ublažile štetne efekte promjena okoliša. Što brže ovi signali manevrišu, veća je vjerovatnoća da će se biljke prilagoditi i odoljeti nadolazećem stresu. Do sada prijavljeni signali uključuju protok kalcijuma, ROS (reaktivne vrste kiseonika), električne signale, itd. [1–5], koji reaguju u roku od nekoliko sekundi ili minuta.

Biljni geni receptora za glutamat (GLR) su homologni genima jonotropnog glutamatnog receptora sisara (iGluRs), koji pokreću električne i Ca2 plus signalne kaskade [3,6]. Pretpostavlja se da biljni GLR imaju vezu liganda kao i aktivnost jonskih kanala. GLR imaju 20 članova porodice u Arabidopsis [7] i 13 članova u riži [8]. Postoji 13 GLR gena pune dužine u biljkama paradajza [9].

Važno je da su GLR uključeni u odgovor biljaka na biotički stres. Na primjer, AtGLR3.3 je vitalni modul biljnog imuniteta protiv bakterijskog patogena P. syringae pv. paradajz DC3000 (Pst DC3000), Oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis i insekt Spodoptera littoralis [10–12].

Osim toga, Wang et al. (2019) izvijestili su da GLR3.5 funkcionira u odbrani paradajza od nematode korijenskog čvora (RKN) Meloidogyne incognita [13]. Prekomjerna ekspresija GluR-komplementarne DNK rotkvice u biljkama Arabidopsis povećava otpornost na nekrotični gljivični patogen, B. cinerea. Međutim, mutanti Arabidopsis glr3.3 ne pokazuju povećanu ranjivost na gljivične patogene u poređenju sa Col-0. Stoga, uloga GLR-a u imunitetu biljaka protiv gljivičnih patogena ostaje kontroverzna.

Biljni GLR su uključeni u stvaranje i prijenos električnih signala. Postojanje električnih signala u biljkama otkrili su Burden-Sanderson i Charles Darwin [14,15]. Oni su signali brzog odgovora koji nastaju trenutnom promjenom gradijenta električnog potencijala na plazma membrani ili alveolarnoj membrani lista [16]. Sve biljke mogu proizvoditi električne signale na velikim udaljenostima, koji igraju ulogu u komunikaciji različitih tkiva i organa, što dovodi do integracije odgovora okoline [17,18].

Posljednjih godina, funkcija električnih signala u GLR-posredovanoj otpornosti biljaka na biotički stres privukla je veliku pažnju [19]. U Arabidopsisu, insekti koji se hrane lišćem mogu uzrokovati promjene u površinskom potencijalu, što dovodi do ekspresije nekoliko ključnih regulatornih gena inducibilnih jasmonata (JA) u odrasloj fazi biljaka [3]. Napad nematoda korijenskog čvora na korijen paradajza uzrokuje prijenos električnih i ROS signala s korijena na lišće, što rezultira akumulacijom JA u listovima [13]. Farmer et al. (2014) su predložili hipotezu da distalna sinteza JA u biljkama nakon ranjavanja ovisi o električnim signalima posredovanim kladom 3 GLR [20]. Međutim, odnos između električnih signala i GLR-induciranog imuniteta biljaka protiv gljivičnih patogena nije u potpunosti potkrijepljen.

Paradajz (Solanum lycopersicum L.) se po ekonomskom značaju ubraja među najznačajnije kultivisane kulture u svetu [21]. Ipak, gljivične bolesti štete proizvodnji paradajza, što rezultira značajnim ekonomskim gubicima [22]. Posebno se smatra da je Botrytis cinerea, tipična nekrotrofična gljiva, na drugom mjestu među 10 najboljih gljivičnih patogena u molekularnoj biljnoj patologiji [23]. Ima širok raspon domaćina i može zaraziti preko 200 biljnih vrsta, uključujući razne gotovinske kulture [24]. B. cinerea može uzrokovati značajan pad prinosa paradajza i kvaliteta plodova nakon berbe [25]. Međutim, sorta paradajza sa širokom otpornošću na B. cinerea još nije razvijena. Stoga je razumijevanje molekularnih mehanizama rezistencije paradajza na B. cinerea posebno važno.

Postoji 13 GLR gena pune dužine u biljkama paradajza. U ovoj studiji, GLR3.3 i GLR3.5, koji imaju pozitivnu ulogu u toleranciji na hladnoću [26] i odbrani od RKN-a [13], funkcionalno su okarakterisani u pogledu imuniteta biljaka paradajza protiv B. cinerea. Otkrili smo da su GLR3.3 i GLR3.5 važni igrači u imunitetu biljaka protiv B. cinerea u paradajzu, vjerovatno kroz vezivanje za ligand glutamat (Glu) ili glicin (Gly), čime se pokreću električni signali. Ovo otkriće ima suštinsku naučnu vrednost, sa potencijalom za razvoj novih strategija za povećanje otpornosti useva na B. cinerea.

2. Materijali i metode

2.1. Biljni materijali, uslovi rasta i hemijski tretmani

Linije paradajza (CRISPR-Csa{1}}uređene linije glr3.3, glr3.5 i glr3.3/3.5) korištene u ovoj studiji bile su u pozadini divljeg tipa (WT) cv Ailsa Craig (AC) , kao što je ranije objavljeno [27]. U slučaju kulture supstrata bez zemlje, biljke paradajza uzgajane su u posudama koje su sadržavale miješani supstrat (vermikulit: treset, 1:3, v/v) i gnojene Hoaglandovim hranljivim rastvorom.

U slučaju hidroponske kulture, sjeme paradajza je prvo klijalo u posudama ispunjenim miješanim supstratom (vermikulit: perlit, 1:1, v/v), a nakon nicanja, presadnice su prebačene u plastične posude kapaciteta 1,5 L (četiri sadnice po kontejneru). Kontejneri su punjeni Enshi hranljivim rastvorom upola jačine, koji je kontinuirano ventilisan aeracijom vazduha iz vazdušne pumpe [21]. Uslovi uzgoja bili su sljedeći: 14 h svjetlo/8 h tamno fotoperiod; 24 ◦C/20 ◦C dnevna/noćna temperatura; i 400 µmol m−2 s −1 PPFD (gustina fotosintetičkog toka fotona). Tretirane su četiri nedjelje stare biljke paradajza.

Za DNQX (6,7-dinitrihinoksalin-2,3-dion, GLRs inhibitor) test prethodnog tretmana, WT biljke su tretirane folijarnim prskanjem sa 1 mM DNQX ili H2O kao kontrolom, 12 sati prije B. cinerea inokulacija. Testovi prethodnog tretmana Glu i Gly su izvedeni dok su mutanti glr3.3 i biljke WT tretirane sa 20 mM Glu, 20 mM Gly ili H2O kao kontrola jednom dnevno na abaksijalnim i adaksijalnim površinama listova. Dva dana nakon farmakološkog tretmana, biljke su podvrgnute inokulaciji patogena.

2.2. Inokulacija patogena i testovi simptoma bolesti

U ovom istraživanju korišten je soj B. cinerea BO5-10. Inokulacija je izvršena suspenzijom B. cinerea u gustini od 2 × 105 spora mL-1 [28]. Suspenzijom je prskan cijeli list biljaka paradajza. Inokulirane biljke su stavljene u zatvorenu kutiju kako bi se održala vlažnost od oko 90 posto. Temperatura i svjetlost bili su isti kao u normalnim uvjetima kulture.

Nakon inokulacije patogenom, akumulacija mRNA aktina B. cinerea je kvantificirana na {{0}} dan nakon inokulacije (dpi) [29]. Fluorescencija hlorofila je mjerena hlorofilnim fluorometrom (IMAG-MAXI; Heinz Walz) pri 3 dpi. Fotohemijska kvantna efikasnost PSII (ΦPSII) je analizirana kao Fm0–F/Fm0 [30].

2.3. Subcelularna lokalizacija

GLR3.3 i GLR3.5 fragmenti gena su amplificirani korištenjem prajmera navedenih u Dodatnoj tabeli S1 i klonirani u pAC402 vektor sa oznakom zelenog fluorescentnog proteina (GFP) [31]. Agrobacterium soj GV3101, koji nosi plazmide, i Agrobacterium, koji nosi FLS2-mCherry kao marker za lokalizaciju plazma membrane, prolazno su ko-eksprimirani u transgenoj Nicotiana benthamiana (izraženoj histonom 2B-mCherry za označavanje lokalizacije), prethodno opisano [32]. Dva dana nakon infiltracije, fluorescentni signali GFP- ili mCherry-označenih proteina procijenjeni su u listovima, koristeći Zeiss LSM 780 konfokalni mikroskop na prethodno opisanim talasnim dužinama ekscitacije/emisije [28].

2.4. RNK izolacija, transkripcija i qRT-PCR

Ukupna RNK je izolirana iz listova paradajza korištenjem kompleta RNAsimple Total RNA (Tiangen, Kina) i reverzno transkribirana korištenjem ReverTra Ace qPCR RT Master Mixa (Toyobo, Japan). qRT-PCR proces je sproveden korišćenjem LightCycler 480 Real-Time PCR sistema (Roche, Švajcarska). Reakcioni sistem je izveden kako je opisano u prethodnom eksperimentu [28]. Specifični prajmeri za aktin gen B. cinerea i gen za aktin paradajza interne kontrole navedeni su u Dodatnoj tabeli S1.

2.5. Snimanje električnog potencijala

Za snimanje električnog potencijala korištene su hidroponske biljke paradajza u fazi četiri lista. Kapilare od borosilikatnog stakla vanjskog prečnika 1,5 mm i unutrašnjeg prečnika 0.86 mm (Sutter Instrument Company, Amerika) su oblikovane u staklene mikroelektrode sa prečnikom vrha od oko 0 .5 mm za mjerenje intracelularnog citoplazmatskog potencijala. APE-2 vertikalni izvlakač mikropipeta (Narishige, Tokio, Japan) je korišten za izvlačenje kapilara nakon zagrijavanja. Mikroelektrode su napunjene sa 1 M KCl i umetnute u ćelije mezofila lista. List je potopljen baznom otopinom (sastavljenom od 5 mM MES, {{10}}.5 mM CaSO4, 0.05 mM KCl i pH 6.0) [13], koja je izvedeno kao što je prikazano u Dodatku Slika S1. Svaka elektroda je bila povezana na diferencijalno pojačalo. Za detekciju signala korišćena su dva dvokanalna pojačala (FD223 i Duo773, World Precision Instruments). Hidroponski rastvor je zamenjen istim rastvorom sa dodatkom 2 mM Glu ili 2 mM Gly, korišćenjem infuzione cevi, kada je vrednost izmerenog membranskog potencijala bila stabilna. Amplitude su potencijalne razlike u odnosu na osnovnu liniju prije promjena.

2.6. Statistička analiza

Eksperimenti su provedeni po potpuno randomiziranom dizajnu, a u svakom eksperimentu korišteno je najmanje tri ponavljanja. Osim ako nije drugačije navedeno, za svaku biološku replikaciju, dva lista iz svake od dvije biljke su kombinovana i korištena kao nezavisni uzorak. Tri odvojena eksperimenta izvedena su nezavisno. Proveli smo analizu varijanse podataka koristeći verziju softvera SAS 8 (SAS Institute), a zatim koristili Tukeyjev test da odredimo značajnost na nivou od 5 posto.

3. Rezultati

3.1. Prethodni tretman sa GLR inhibitorom povećava osetljivost paradajza na B. cinerea

Da bi se istražila uloga GLR-a u odbrani biljaka od B. cinerea, biljke paradajza su prskane DNQX ili H2O (kontrola), 12 h prije inokulacije sa B. cinerea. Pri 3 dpi sa B. cinerea, inokulirani listovi su pokazali vidljive lezije bolesti. Oštećenje listova izazvano infekcijom B. cinerea procenjeno je korišćenjem fluorescentnog snimanja hlorofila da bi se odredila odstupanja u kvantnom prinosu fotosistema II (ΦPSII) (Slika 1a,b). Nakon inokulacije sa B. cinerea, ΦPSII se značajno smanjio. Značajno je da je vrijednost ΦPSII u biljkama tretiranim DNQX bila niža od one u kontroli. Tretman DNQX-om je također povećao obilje mRNA aktina B. cinerea u listovima (slika 1c). Ovi nalazi pokazuju da GLR pozitivno regulišu imunitet biljaka protiv B. cinerea u biljkama paradajza.

Slika 1. Tretman DNQX-om povećava osjetljivost paradajza na B. cinerea. Biljke paradajza stare četiri nedelje tretirane su sa 1 mM DNQX ili H2O, 12 h pre inokulacije sa B. cinerea: (a) pseudobojne slike listova paradajza koje pokazuju ΦPSII pri 3 dpi; (b) kvantitativne vrijednosti ΦPSII pri 3 dpi; (c) izobilje transkripta aktina B. cinerea u listovima paradajza inokuliranih sa B. cinerea pri 1 dpi. Rezultati u panelima (b,c) prikazani su kao srednje vrijednosti ± SD; n=4. Statistički značajne razlike između tretmana (p < 0.05, Tukeyjev test) prikazane su različitim slovima. Gore opisani eksperimenti izvedeni su tri puta, sa istim nalazima svaki put.

3.2. Subcelularna lokalizacija GLR3.3 i GLR3.5

Paradajz GLR3.3 i GLR3.5 su homologni Arabidopsis GLR3.3 i GLR3.6, respektivno (9], za koje je prijavljeno da učestvuju u odgovoru na napad nematoda i otpornost na hladnoću kod paradajza. Da bi se odredila subćelijska lokalizacija paradajza GLR3.3 i GLR3.5, GLR3.3-GFP, GLR3.5-GFP i GFP su transformisani u Agrobacteriumtumefaciens, a zatim prolazno eksprimirani u N. benthamiana. Konfokalna mikroskopija epidermalnih ćelija lista pokazala je da je kontrolni GFP signal pokazao lokalizaciju u ćelijskim membranama, citosolima i jezgrima (Slika 2). Fluorescentni signali GLR3.3-GFP iGLR3.5-GFP su kolokalizirani sa FLS2-mCherry u plazmi membrane ćelija nije uočeno da se GLR3.3 i GLR3.5 kolokaliziraju sa histonom 2B-mCherry na jezgrima. Rezultati sugeriraju da se GLR3 paradajza.3-GFP i GLR3.5-CFP lokalizuju na plazma membrane ćelije.

Slika 2. Subcelularna lokalizacija GLR3.3 i GLR3.5. GLRs-GFP paradajza su prolazno koeksprimirani sa FLS2-mCherry (tvorcem lokalizacije plazma membrane) u listovima N. benthamiama. GFP i mCherry signali su vizualizirani pomoću konfokalne mikroskopije 48 sati nakon infiltracije. Bar=25 µm.

3.3. GLR3.3 i GLR3.5 Funkcija u odbrani biljaka od B. cinerea

Da bi se istražila uloga GLR-a u imunitetu biljaka, CRISPR/Cas 9-posredovane genski uređene biljke paradajza GLR3.3 ili GLR3.5 nokaut i glr3.3/3.5 dvostruki mutanti su inficirani sa B. cinerea. Rezultati su pokazali da je nokautiranje GLR33 i GLR3.5 rezultiralo očiglednim smanjenjem PSll, u poređenju sa WT kontrolom (Slika 3a,b). Shodno tome, akumulacija mRNK aktina B. cinerea u listovima značajno se povećala (slika 3c) kod glr3.3 ili glr3.5 mutanata.

U međuvremenu, glr3.3/glr3.5 dvostruki mutanti pokazali su više slabljenja u odbrani biljaka u poređenju sa glr3.3 i glr3.5 mutantima. Ova zapažanja sugeriraju da GLR3.3 i GLR3.5 funkcioniraju redundantno kako bi uspostavili otpor protiv B. Camerona. Nadalje, GLR3.3 igra glavnu ulogu, jer su mutanti glr3.3 bili podložniji inokulaciji B. cinerea od glr3.5 mutanata. Na osnovu toga, GLR3.3 je odabran za dalje istraživanje.

3.4. Prepoznavanje Glu i Gly od strane GLR-a pokrenulo je električnu signalizaciju u imunološkom odgovoru

Kako Glu ili Gly mogu biti prepoznati od strane GLR-a da izazovu depolarizaciju membrane [33], odredili smo Glu- ili Gly-indukovanu električnu signalizaciju praćenjem efekta Glu i Gly na membranski potencijal u listovima paradajza. Tretman Glu i Gly je izazvao značajne promjene u membranskom potencijalu za kratko vrijeme, uz povećanje amplitude od oko 17-20 mV (Slika 4). Značajno je da je promjena membranskog potencijala izazvana Glu i Gly značajno oslabljena kod glr3.3 mutanata. Ovi nalazi sugeriraju da električna signalizacija u listovima paradajza, inducirana Glu ili Gly, djelomično ovisi o GLR3.3.

Slika 3. Efekti uređivanja GLR3.3 i GLR3.5 na odbranu biljke od inokulacije B. cinerea u paradajzu: (a) pseudobojne slike listova paradajza koje prikazuju pPSll pri 3 dpi; (b) kvantifikacija pPSllat 3 dpi; (c) obilje transkripta aktina B. cinerea u listovima paradajza inokuliranih sa B. cinerea atI dpi. Rezultati u panelima (b,c) prikazani su kao srednje vrijednosti - SD; n=4. Statistički, značajne razlike između tretmana (p < 0.05, Tukeyjev test) su prikazane različitim slovima. Gore opisani eksperimenti izvedeni su tri puta, sa istim nalazima svaki put.

Slika 4. Glu ili Gly utiču na membranski potencijal listova WT i glr3.3: (a) tipične promene membranskog potencijala u listovima paradajza WT ili glr3.3 mutanta tretiranih Glu ili Gly; (b) kvantifikacija promjena amplitude membranskog potencijala. Rezultati u panelu (b) su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD; n=4. Prikazane su statistički značajne razlike između tretmana (p < 0.05, Tukeyjev test) Mock WT glr3.3 glr3.5 B. cinerea WT glr3.3/glr3.5 (b) (c ) (a) WT plus 2mM Glu WT plus 2mM Gly glr3.3 plus 2mM Gly glr3.3 plus 2mM Glu WT plus Kontrolna otopina (a) (b) Slika 4. Glu ili Gly utječe na membranski potencijal WT i glr3.3 listovi: (a) tipične promjene membranskog potencijala kod listova paradajza WT ili mutanta glr3.3 tretiranih Glu ili Gly; (b) kvantifikacija promjena amplitude membranskog potencijala. Rezultati u panelu (b) su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD; n=4. Statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05, Tukeyjev test) prikazane su različitim slovima. Gore opisani eksperimenti izvedeni su tri puta, sa istim nalazima svaki put.

Glr3.3 mutanti su pokazali veću osjetljivost na B. cinerea, što je bilo u skladu sa smanjenjem Glu- ili Gly-induciranih električnih signala. Na osnovu ovih zapažanja, pretpostavili smo da je prepoznavanje Glu i Gly od strane GLR-a ključno za imunitet protiv B. cinerea. Da bi se potvrdila ova hipoteza, provedena je farmakološka analiza glu- ili Gly-egzogenim tretmanom. Prije inokulacije B. cinerea, biljke WT i mutant glr3.3 su prethodno tretirani Glu, Gly ili H2O (kontrola).

U WT biljkama, smanjenje ΦPSII izazvano inokulacijom B. cinerea i povećanje akumulacije mRNA aktina B. cinerea značajno je ublaženo prethodnim tretmanom sa egzogenim Glu ili Gly pri 3 dpi (Slika 5). Međutim, simptomi bolesti kod mutanta glr3.3 bili su ozbiljniji, a korisni efekti Glu i Gly na rezistenciju protiv B. cinerea značajno su smanjeni zbog nokauta GLR3.3. Dakle, ovi rezultati pokazuju da Glu- i Gly-indukovana imunost biljaka protiv B. cinerea dijelom ovisi o GLR3.3.

Slika 5. Glu- ili Gly-indukovana imunost protiv B. cinerea delimično zavisi od GLR3.3. Biljke paradajza stare četiri nedelje tretirane su sa 20 mM Glu, 20 mM Gly ili vodom jednom dnevno dva dana pre inokulacije B. cinerea: (a) pseudobojne slike listova paradajza koje pokazuju ΦPSII pri 3 dpi ; (b) kvantifikacija ΦPSII pri 3 dpi; (c) izobilje transkripta aktina B. cinerea u listovima paradajza inokuliranih sa B. cinerea pri 1 dpi. Rezultati u panelima (b,c) prikazani su kao srednje vrijednosti ± SD; n=4. Statistički značajne razlike između tretmana (p < 0,05, Tukeyjev test) prikazane su različitim slovima. Gore opisani eksperimenti izvedeni su tri puta, sa istim nalazima svaki put.

4. Diskusija

s su proteini kationskih kanala koji postoje u bakterijama, biljkama i životinjama. Kod životinja je dokazano da su GLR uključeni u neurotransmisiju i imunološku regulaciju, a njihov ligand Glu djeluje kao signalni agens između dva sistema [34-36]. U biljkama, GLR imaju pozitivnu ulogu u imunitetu protiv biotičkog stresa [10,12,13]. Posebno se pokazalo da je odbrana izazvana GLR od RKN-a i ujeda insekata povezana s električnim signalima [3]. Međutim, odnos između GLR-posredovane otpornosti na gljivične bolesti i električnih signala nije u potpunosti potkrijepljen. Ovdje pružamo uvjerljive dokaze koji pokazuju da je GLR3.3- i GLR3.{11}}moduliran imunitet biljke protiv tipičnog gljivičnog patogena B. cinerea povezan sa električnim signalima.

U ovoj studiji je po prvi put otkrivena uloga GLR-a u imunitetu sadnica paradajza protiv B. cinerea. Primjena GLR inhibitora DNQX povećala je osjetljivost biljaka paradajza na B. cinerea (Slika 1). Štaviše, izbacivanje GLR3.3 ili GLR3.5 značajno je oslabilo imunitet biljke, što je dovelo do pojačanih simptoma bolesti u listovima (Slika 3). Ovi nalazi podržavaju ideju da biljke paradajza zahtijevaju GLR da bi uspostavile adekvatnu odbranu od nekrotrofnog gljivičnog patogena B. cinerea. Iako prekomjerna ekspresija GluR rotkvice inhibira rast B. cinerea [37], nije pronađeno da nijedan od Arabidopsis glr mutanata nije osjetljiviji na B. cinerea [12], što sugerira da se funkcija GLR može razlikovati među vrstama. U ovoj studiji, glr3.3/glr3.5 dvostruki mutanti su pokazali osjetljiviji fenotip u poređenju sa jednostrukim mutantima glr3.3 i glr3.5. Ovi nalazi sugeriraju da GLR3.3 i GLR3.5 funkcionišu redundantno. Značajno, poređenje fenotipova između glr3.3 i glr3.5 mutanata sugerira da GLR3.3 igra glavnu ulogu u odbrani od B. cinerea.

Električni signali su brzi odgovor uključeni u GLR-posredovanu otpornost biljaka na biotički stres. Ovdje su električni signali inducirani Glu ili Gly značajno oslabljeni u glr3.3 mutantima. Tretman Glu ili Gly inducirao je membranski potencijal na kratko vrijeme. Međutim, varijacija u amplitudi je značajno smanjena kod glr3.3 mutanata (Slika 4). Slično, kod Arabidopsis, stvaranje i širenje električnih signala izazvanih oštećenjem listova je oslabljeno kod glr3.3 i glr3.6 mutanata [3]. Međutim, slabljenje promjena površinskog potencijala uzrokovanih ranama očituje se skraćivanjem trajanja, ali je amplituda ostala ista kao WT kod Arabidopsis glr3.3 mutanata nakon ranjavanja listova. Ove razlike u rezultatima mogu biti posljedica razlika u vrstama i tretmanima. U skladu s našim rezultatima, nokaut GLR3.3 inhibira depolarizaciju membrane izazvanu Glu tretmanom u korijenu Arabidopsis [38]. Svi ovi rezultati sugeriraju da električni signali inducirani Glu ili Gly dijelom zavise od GLR3.3.

Egzogeni tretman sa Glu-om izaziva imunološki odgovor na više bolesti, kao što su gljivica pirinča Magnaporthe Oryza, nekrotrofna gljiva Alternaria alternata u plodovima paradajza i bakterijski patogen Ralstonia solanacearum koji se prenosi u tlu [39–41]. Sun et al. (2019) izvještavaju da tretman Glu povećava otpornost plodova paradajza na B. cinerea [42]. U ovoj studiji, egzogeni tretman sa Glu ili Gly izaziva imunitet protiv B. cinerea u WT biljkama; međutim, prednosti ovog tretmana su značajno inhibirane kod mutanta glr3.3 (Slika 5). Ovdje predstavljeni podaci pokazuju da je GLR3.3 potreban za Glu- ili Gly-indukovanu imunost protiv B. cinerea. Stoga, ovi nalazi sugeriraju da otpornost B. cinerea izazvana Glu ili Gly dijelom ovisi o GLR3.3.

Na osnovu ovdje navedenih podataka, predlažemo da su GLR uključeni u odbrambene odgovore na B. cinerea putem električnih signala. S obzirom na imunitet posredovan fitohormonima, signalni put salicilne kiseline olakšava odbranu od biotrofnih i hemibiotrofnih patogena, dok signalni put JA/etilena funkcionira protiv nekrotrofnih patogena [43,44]. Antagonistički odnos između ova dva puta je evidentan u mnogim biljnim patosistemima [45,46].

Međutim, pokazalo se da GLR3.3 pozitivno posreduje u otpornosti na biotrofni patogen Pst DC3000, dok je u isto vrijeme neophodan za imunitet protiv nekrotrofnog patogena B. cinerea. Naš prijedlog je razuman, jer GLR3.3 može prepoznati Glu, koji se smatra nekom vrstom DAMP-a [6,47]. DAMP pokreću rane sekundarne signale i induciraju ekspresiju JA/etilena, gena za odbranu signala SA. Nadalje, ubrizgavanje umjetne struje u površinu stabljike uzrokuje značajno povećanje akumulacije JA u biljkama [13].

Prema ovim rezultatima, GLR3.3 može igrati ulogu u ranoj fazi otpornosti biljaka kroz Glu- ili Gly-inducirane električne signale, koji reagiraju u sekundama ili minutama, uzvodno od puta hormonske signalizacije. JA signalni put se također može aktivirati električnim signalima. Osim toga, dobro je dokumentirano da AtGLR3.3 učestvuje u otpornosti biljaka posredovanjem [Ca2 plus ]cyt varijacije i oksidacijskih odgovora [12]. Odnos između ovih puteva i električnih signala u regulaciji otpornosti biljaka na B. cinerea zahtijeva dalje istraživanje.

5. Zaključci

Ovdje prikazani podaci pokazuju da GLR3.3 i GLR3.5 imaju pozitivnu ulogu u odbrani biljaka paradajza od nekrotrofnog patogena B. cinerea putem električnih signala. Naša studija pruža nove uvide u mehanizam odbrane biljaka protiv B. cinerea. Ipak, bit će zanimljivo dalje istražiti odnos između nekoliko signalnih puteva induciranih GLR-om, koji doprinose imunitetu biljaka protiv gljivičnih patogena.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, SF, CP i KS; metodologija, KS; softver, SF i PW; validacija, SF, CP i KS; formalna analiza, SF, CH i QM; istraga, SF, CP i SD; resursi, KS; kuriranje podataka, SF i CP; pisanje—izrada originalnog nacrta, SF i KS; pisanje—pregled i uređivanje, KS; nadzor, KS; administracija projekta, KS; finansiranje nabavke, KS Svi autori su pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

finansiranje:

Ovaj rad su podržale Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (31772355, 32172650), Fondacija za prirodne nauke provincije Zhejiang za istaknute mlade naučnike (LR19C150001), Program ključnih istraživanja i razvoja provincije Zhejiang (2021C02040), i Starry Night Naučni fond Instituta za napredne studije Univerziteta Zhejiang u Šangaju (SN-ZJU-SIAS-0011).

Izjava institucionalnog odbora za reviziju:

Nije primjenjivo.

Izjava o informiranom pristanku:

Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka:

Sirove podatke koji podržavaju zaključke ovog članka autori će staviti na raspolaganje, bez nepotrebnih rezervi.

Priznanja:

Autori bi željeli izraziti iskrenu zahvalnost Nacionalnoj fondaciji za prirodne nauke Kine, Fondaciji za prirodne nauke provincije Zhejiang, ključnom programu istraživanja i razvoja provincije Zhejiang i Fondu za nauku Zvjezdane noći šangajskog instituta za napredne nauke Zhejiang University Učite za njihovu finansijsku podršku.

Sukobi interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Gilroy, S.; Suzuki, N.; Miller, G.; Choi, WG; Toyota, M.; Devireddy, AR; Mittler, R. Plimni talas signala: kalcijum i ROS na čelu brze sistemske signalizacije. Trends Plant Sci. 2014, 19, 623–630. [CrossRef]

2. Hedrich, R.; Salvador-Recatala, V.; Dreyer, I. Električno ožičenje i komunikacija postrojenja na velike udaljenosti. Trends Plant Sci. 2016, 21, 376–387. [CrossRef]

3. Mousavi, SA; Chauvin, A.; Pascaud, F.; Kellenberger, S.; Farmer, EE Geni slični glutamatnom receptoru posreduju u signalizaciji rane od lista do lista. Nature 2013, 500, 422–426. [CrossRef]

4. Choi, WG; Miller, G.; Wallace, I.; Harper, J.; Mittler, R.; Gilroy, S. Orkestriranje brze signalizacije na velike udaljenosti u postrojenjima sa Ca2 plus, ROS i električnim signalima. Plant J. 2017, 90, 698–707. [CrossRef]

5. Marčec, MJ; Gilroy, S.; Poovaiah, BW; Tanaka, K. Međusobna interakcija Ca2 plus i ROS signalizacije u imunološkom odgovoru biljaka. Plant Sci. 2019, 283, 343–354. [CrossRef]

6. Toyota, M.; Spencer, D.; Sawai-Toyota, S.; Jiaqi, W.; Zhang, T.; Koo, AJ; Howe, GA; Gilroy, S. Glutamat pokreće signalizaciju odbrane biljaka na daljinu na bazi kalcijuma. Nauka 2018, 361, 1112–1115. [CrossRef]

7. Wudick, MM; Michard, E.; Oliveira, NC; Feijo, JA Poređenje biljnih i životinjskih glutamatnih receptora: zajedničke osobine, ali različite sudbine? J. Exp. Bot. 2018, 69, 4151–4163. [CrossRef]

8. Ni, J.; Yu, Z.; Du, G.; Zhang, Y.; Taylor, JL; Shen, C.; Xu, J.; Liu, X.; Wang, Y.; Wu, Y. Heterologna ekspresija i funkcionalna analiza porodice GLUTAMATNIH RECEPTOR-LIKE u pirinču ukazuje na njenu ulogu u fluksu kalcijuma izazvanog glutamatom u korenu pirinča. Rice 2016, 9, 9. [CrossRef] [PubMed]

9. Aouini, A.; Matsukura, C.; Ezura, H.; Asamizu, E. Karakterizacija 13 gena sličnih glutamatnom receptoru kodiranih u genomu paradajza po strukturi, filogeniji i profilima ekspresije. Gene 2012, 493, 36–43. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, F.; Wang, J.; Ma, C.; Zhao, Y.; Wang, Y.; Hasi, A.; Qi, Z. Kanal sličan glutamatnom receptoru 3.3 je uključen u posredovanje glutation-pokrenutih citosolnih kalcijumskih tranzijenta, transkripcijskih promjena i odgovora urođenog imuniteta kod Arabidopsis. Plant Physiol. 2013, 162, 1497–1509. [CrossRef] [PubMed]

11. Nguyen, CT; Kurenda, A.; Stolz, S.; Chetelat, A.; Farmer, EE Identifikacija ćelijskih populacija neophodnih za električnu signalizaciju od lista do lista u ranjenoj biljci. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2018, 115, 10178–10183. [CrossRef]

12. Manzoor, H.; Kelloniemi, J.; Chiltz, A.; Wendehenne, D.; Pugin, A.; Poinssot, B.; Garcia-Brugger, A. Učešće glutamatnog receptora AtGLR3.3 u signalizaciji odbrane biljaka i otpornosti na Hyaloperonospora arabidopsidis. Plant J. 2013, 76, 466–480. [CrossRef] [PubMed]

13. Wang, G.; Hu, C.; Zhou, J.; Liu, Y.; Cai, J.; Pan, C.; Wang, Y.; Wu, X.; Shi, K.; Xia, X.; et al. Sistemska signalizacija korijenskih izdanaka pokreće odbranu korijena zasnovanu na jasmonatu protiv nematoda. Curr. Biol. 2019, 29, 3430–3438. [CrossRef] [PubMed]

14. Darwin, CR Insectivorous Plants; John Murray: London, UK, 1875.

15. Burdon-Sanderson, JS Napomena o električnim fenomenima koji prate iritaciju lista Dionæa muscular. Proc. R. Soc. London. 1873, 21, 495–496.

16. Sukhova, E.; Akinchits, E.; Sukhov, V. Matematički modeli električne aktivnosti u biljkama. J. Membr. Biol. 2017, 250, 407–423. [CrossRef]

17. Li, JH; Ventilator, LF; Zhao, DJ; Zhou, Q.; Yao, JP; Wang, ZY; Huang, L. Električni signali biljaka: multidisciplinarni izazov. J. Plant Physiol. 2021, 261, 153418. [CrossRef] [PubMed]

18. Garcia-Servin, MA; Mendoza-Sanchez, M.; Contreras-Medina, LM Električni signali kao opcija komunikacije sa postrojenjima: Pregled. Theor. Exp. Plant Physiol. 2021, 33, 125–139. [CrossRef]

19. Li, M.; Wang, F.; Li, S.; Yu, G.; Wang, L.; Li, Q.; Zhu, X.; Li, Z.; Yuan, L.; Liu, P. Uvoznici pokreću prijenos jasmonske kiseline s lista na list u sistemskom imunitetu izazvanom ranom. Mol. Plant 2020, 13, 1485–1498. [CrossRef]

20. Farmer, EE; Gasperini, D.; Acosta, IF Hipoteza ćelija stiskanja za aktivaciju sinteze jasmonata kao odgovor na ranjavanje. New Phytol. 2014, 204, 282–288. [CrossRef]

21. Ding, S.; Shao, X.; Li, J.; Ahammed, GJ; Yao, Y.; Ding, J.; Hu, Z.; Yu, J.; Shi, K. Oblici azota i metabolizam utiču na odbranu biljke od folijarnih i korijenskih patogena u paradajzu. Okruženje biljnih ćelija. 2021, 44, 1596–1610. [CrossRef]

22. Li, X.; Yang, R.; Chen, H. Mediatorska podjedinica Arabidopsis thaliana MED8 reguliše imunitet biljke na Botrytis Cinerea interakcijom sa osnovnim transkripcionim faktorom helix-loop-helix (bHLH) FAMA. PLOS ONE 2018, 13, e193458. [CrossRef]

23. Dean, R.; Van Kan, JA; Pretorius, ZA; Hammond-Kosack, KE; Di Pietro, A.; Spanu, PD; Rudd, JJ; Dickman, M.; Kahmann, R.; Ellis, J.; et al. Top 10 gljivičnih patogena u molekularnoj patologiji biljaka. Mol. Plant Pathol. 2012, 13, 414–430. [CrossRef]

24. Bai, Y.; Lindhout, P. Domestikacija i oplemenjivanje paradajza: šta smo dobili i šta možemo dobiti u budućnosti? Ann. Bot. 2007, 100, 1085–1094. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, X.; Zhou, X.; Cai, Z.; Guo, L.; Chen, X.; Chen, X.; Liu, J.; Feng, M.; Qiu, Y.; Zhang, Y.; et al. Biokontrolni soj Pseudomonas aeruginosa CQ-40 potiče rast i kontroliše Botrytis cinerea u paradajzu. Patogeni 2020, 10, 22. [CrossRef]

26. Li, H.; Jiang, X.; Lv, X.; Ahammed, GJ; Guo, Z.; Qi, Z.; Yu, J.; Zhou, Y. Tomato GLR3.3 i GLR3.5 posreduju u toleranciji na hlađenje izazvanu hladnom aklimatizacijom regulacijom proizvodnje apoplastične H2O2 i redoks homeostaze. Okruženje biljnih ćelija. 2019, 42, 3326–3339. [CrossRef]

27. Hu, C.; Duan, S.; Zhou, J.; Yu, J. Karakteristike transdukcije električnog signala izazvanog biljojedima/ranama u paradajzu. Front. Agric. Sci. inž. 2021, 8, 292–301.

28. Zhang, H.; Hu, Z.; Lei, C.; Zheng, C.; Wang, J.; Shao, S.; Li, X.; Xia, X.; Cai, X.; Zhou, J.; et al. Biljni fitosulfokin peptid pokreće imunitet zavisan od auksina kroz citosolni Ca2 plus signalizaciju u paradajzu. Plant Cell 2018, 30, 652–667. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, S.; Li, X.; Sun, Z.; Shao, S.; Hu, L.; Ye, M.; Zhou, Y.; Xia, X.; Yu, J.; Shi, K. Antagonizam između fitohormonske signalizacije leži u osnovi varijacija u osjetljivosti biljaka paradajza na bolesti pod povišenim CO2. J. Exp. Bot. 2015, 66, 1951–1963. [CrossRef]

30. Genty, B.; Briantais, JM; Baker, NR Odnos između kvantnog prinosa fotosintetskog transporta elektrona i gašenja fluorescencije klorofila. Biochim. Biophys. Acta 1989, 990, 87–92. [CrossRef]

31. Ma, Q.; Liu, Y.; Fang, H.; Wang, P.; Ahammed, GJ; Zai, W.; Shi, K. Bitna uloga mitohondrijalne alfa-ketoglutarat dehidrogenaze E2 u bazalnom imunološkom odgovoru protiv bakterijskih patogena u paradajzu. Front. Plant Sci. 2020, 11, 579772. [CrossRef]

32. Liao, Y.; Tian, ​​M.; Zhang, H.; Li, X.; Wang, Y.; Xia, X.; Zhou, J.; Zhou, Y.; Yu, J.; Shi, K.; et al. Vezivanje mitohondrijalne alfa-ketoglutarat dehidrogenaze E2 salicilnom kiselinom utiče na mitohondrijsku oksidativnu fosforilaciju i komponente lanca transporta elektrona i igra ulogu u bazalnoj odbrani od virusa mozaika duhana u paradajzu. New Phytol. 2015, 205, 1296–1307. [CrossRef]

33. Stephens, NR; Qi, Z.; Spalding, podtipovi EP glutamatnog receptora dokazani razlikama u desenzibilizaciji i zavisnosti od gena GLR3.3 i GLR3.4. Plant Physiol. 2008, 146, 529–538. [CrossRef] [PubMed]

34. Boldyrev, AA; Carpenter, DO; Johnson, P. Novi dokazi za sličnu ulogu glutamatnih receptora u nervnom i imunološkom sistemu. J. Neurochem. 2005, 95, 913–918. [CrossRef]

35. Fazio, F.; Ulivieri, M.; Volpi, C.; Gargaro, M.; Fallarino, F. Ciljanje metabotropnih glutamatnih receptora za liječenje neuroinflamacije. Curr. Opin. Pharmacol. 2018, 38, 16–23. [CrossRef]

36. Ganor, Y.; Levite, M. Neurotransmiter glutamat i ljudske T ćelije: Glutamatni receptori i direktni i snažni efekti izazvani glutamatom na normalne ljudske T ćelije, kancerogene ljudske leukemije i T ćelije limfoma, i autoimune ljudske T ćelije. J. Neural Transm. 2014, 121, 983–1006. [CrossRef] [PubMed]

37. Kang, S.; Kim, HB; Lee, H.; Choi, JY; Heu, S.; Oh, CJ; Kwon, SI; Prekomjerna ekspresija CS u Arabidopsisu glutamatnog receptora koji cilja na plazma membranu iz male rotkvice povećava priliv Ca2 posredovanog glutamatom i odlaže gljivičnu infekciju. Mol. Ćelije 2006, 21, 418–427.

38. Qi, Z.; Stephens, NR; Spalding, EP Ulazak kalcijuma posredovan GLR3.3, glutamatnim receptorom Arabidopsis sa širokim profilom agonista. Plant Physiol. 2006, 142, 963–971. [CrossRef]

39. Kadotani, N.; Akagi, A.; Takatsuji, H.; Miwa, T.; Igarashi, D. Egzogene proteinogene aminokiseline izazivaju sistemsku rezistenciju u pirinču. BMC Plant Biol. 2016, 16, 60. [CrossRef] [PubMed]

40. Seo, S.; Nakaho, K.; Hong, SW; Takahashi, H.; Shigemori, H.; Mitsuhara, I. L-histidin inducira otpornost biljaka na bakterijski patogen Gastonia solanacearum djelomično kroz aktivaciju etilenske signalizacije. Plant Cell Physiol. 2016, 57, 1932–1942. [CrossRef]

41. Yang, J.; Sun, C.; Fu, D.; Yu, T. Test za L-glutamat inhibiciju rasta Alternaria alternata izazivanjem rezistencije u plodovima paradajza. Food Chem. 2017, 230, 145–153. [CrossRef]

42. Sun, C.; Jin, L.; Cai, Y.; Huang, Y.; Zheng, X.; Yu, T. Tretman L-glutamatom povećava otpornost ploda paradajza na bolesti indukujući ekspresiju glutamatnih receptora i akumulaciju aminokiselina. Food Chem. 2019, 293, 263–270. [CrossRef]

43. Li, N.; Han, X.; Feng, D.; Yuan, D.; Huang, LJ Preslušavanje signala između salicilne kiseline i etilena/jasmonata u odbrani biljaka: razumijemo li šta oni šapuću? Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 671. [CrossRef] [PubMed]

44. Farmer, EE; Gao, YQ; Lenzoni, G.; Wolfender, JL; Wu, Q. Rane i mehanostimulirani električni signali kontroliraju hormonske odgovore. New Phytol. 2020, 227, 1037–1050. [CrossRef] [PubMed]

45. Zhang, Y.; Song, RF; Yuan, HM; Li, TT; Wang, LF; Lu, KK; Guo, JX; Liu, WC Prekomjerna ekspresija N-kraja CATALASE2 poboljšava biosintezu jasmonske kiseline u biljci i otpornost na nekrotrofni patogen Botrytis cinerea B05.10. Mol. Plant Pathol. 2021, 22, 1226–1238. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Caarls, L.; Van der Does, D.; Hickman, R.; Jansen, W.; Verk, MC; Proietti, S.; Lorenzo, O.; Solano, R.; Pieterse, CM; Van Wees, SC Procjena uloge transkripcijskih represora faktora odgovora etilena u supresiji gena koji reagiraju na jasmonsku kiselinu posredovanu salicilnom kiselinom. Plant Cell Physiol. 2017, 58, 266–278. [CrossRef]

47. Tanaka, K.; Heil, M. Molekularni obrasci povezani sa oštećenjem (DAMP) u urođenom imunitetu biljaka: Primjena modela opasnosti i evolucijske perspektive. Annu. Rev. Phytopathol. 2021, 59, 53–75. [CrossRef]

Shuxian Feng †, Caizhe Pan †, Shutting Ding, Qiaomei Ma, Chaoyi Hu, Ping Wang i Kai Shi *.

Odsjek za hortikulturu, Univerzitet Zhejiang, Hangzhou 310058, Kina; 21916054@zju.edu.cn (SF)

22016198@zju.edu.cn (CP); 3130100256@zju.edu.cn (SD); 11916060@zju.edu.cn (QM); cyhu@zju.edu.cn (CH); 11916061@zju.edu.cn (PW)

Prepiska: kaishi@zju.edu.cn; Tel.: plus 86-0571-88982383

Ovi autori su podjednako doprinijeli ovom radu.

For more information:1950477648nn@gmail.com