Epigenetski regulator BRD4 je uključen u upalni odgovor u bubrezima pacova izazvan kadmijumom

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong i dr

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobiliproizvodi i Cistanche DHT

SAŽETAK

Kadmijum (Cd) je opisan kao potencijalni induktor upale, dok sve veći broj dokaza pokazuje da je neodgovarajuća upala faktor koji doprinosipovreda bubrega. Stoga je istraživanje upalnog odgovora izazvanog Cd-om od velikog značaja za razjašnjavanje mehanizma nefrotoksičnosti izazvane Cd-om. koji sadrži bromodomen 4(BRD4) je važan epigenetski regulator uključen u razvoj mnogih upalnih bolesti, ali njegova regulatorna uloga u Cd-okidačuinflamatornoodgovor ostaje da se razjasni. Ovdje smo otkrili da tretman sa Cd kod Sprague-Dawley štakora (2 mg/kg TM, ip, 5 uzastopnih dana) i kod štakoraćelija bubregalinija (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) inducirala je transkripciju inflamatornih citokina, koja bi mogla biti smanjena JQ1 (BRD4 inhibitor, 25 mg/kg TM, ip , 3 uzastopna dana in vivo; 0,5 μM, 12 h in vitro) ili BRD4 mala interferirajuća RNK (siRNA, in vitro), što sugerira da BRD4 učestvuje u Cd-pokrenutom inflamatornom odgovoru. Zatim je naša studija razjasnila uloge BRD4 u inflamatornom odgovoru izazvanom Cd-om. Inhibicija BRD4 smanjila je Cd-promoviranu nuklearnu translokaciju i aktivaciju NF-κB in vivo i in vitro. Cd je povećao nivo acetilacije RelA K310 i poboljšao vezivanje BRD4 za acetilirani NF-κB RelA in vivo i in vitro, koji su poništeni inhibiranjem BRD4. Ukratko, naša studija sugerira da je BRD4 uključen u transkripciju inflamatornih citokina izazvanu Cd posredovanjem aktivacije NF-κB signalnog puta i povećanjem samog vezivanja za acetilirani NF-κB RelA kod pacova.bubreg,stoga bi BRD4 mogao biti potencijalna terapijska meta za bubrežne bolesti izazvane Cd-om.

Ključne riječi: BRD4KadmijumUpala bubregacitokini NF-κB JQ1

1. Uvod

Kadmijum (Cd) je zagađivač teških metala visoke toksičnosti i dugog poluraspada. S razvojem industrijske proizvodnje, povećana opasnost od zagađenja Cd-om po sigurnost okoliša i zdravlje ljudi izazvala je zabrinutost (Wang et al., 2020; Horiguchi i Oguma, 2016). Nakon što ga tijelo apsorbira, Cd izaziva oštećenje više organa ibubregje glavni ciljni organ (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Prethodno smo sistematski potvrdili da inhibicija autofagije, oksidativni stres i apoptoza sinergistički doprinose nefrotoksičnosti uzrokovanoj Cd kod pacova (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Upala je fiziološki odgovor koji djeluje kao obrambena reakcija protiv infekcije ili ozljede, ali nekontrolirani i neodgovarajući upalni odgovori izazvani Cd-om mogu uzrokovati štetu kao što je oštećenje normalnog tkiva promatrača i promicanje autoimunih bolesti (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang i dr. al., 2020.). Upalni odgovor izazvan Cd-om pogoršao je kardiovaskularne bolesti i oštećenje jetre, što sugerira da upala može igrati važnu ulogu u Cd-posredovanojbubregpatološki procesi (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetika se odnosi na nasljedne modifikacije u ekspresiji gena zasnovane na promjenama ne-DNK sekvence, a reverzibilnost ovih modifikacija omogućava otkrivanje novih terapijskih ciljeva (Vendetti i Rudin, 2013). Porodica bromodomena i ekstra-terminalnih domena (BET) uključuje bromodomene koji sadrže 2 (BRD2), BRD3, BRD4 i bromodomenu specifičnu za testis (BRDT), koju karakteriziraju dva bromodomena i vezivanje za acetilirane lizine histona i nehistona ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee i Bohmann, 2018). BET proteini djeluju kao koaktivator transkripcije mnogih gena, regulirajući tako ćelijski ciklus, upalni odgovor, oksidativni stres i druge fiziološke procese u različitim patološkim modelima (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 je posebno dobro proučavan član porodice BET proteina, a akumulirana istraživanja su ga izvijestila kao novu epigenetičku metu u regulaciji različitihbolesti bubrega, uključujući kronični nefritis, dijabetičku nefropatiju i eksperimentalno oštećenje bubrega (Zeng i Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). Potvrđeno je da BRD4 učestvuje u procesu transkripcije zavisnog od nuklearnog faktora-κB (NF-κB) za regulaciju upalnih odgovora kod mnogih bolesti (Xu i Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 se može regrutovati acetiliranim RelA (NF-κB podjedinica, gen koji kodira protein) na lizinu 310 (RelA-K310ac) preko njegovih bromodomena, čime se aktivira ciklin zavisna kinaza 9 (CDK9) i fosforilira se u RNA polimerazu II transkripcija NF-κB ciljnih gena (Hajmirza et al., 2018). Nedavne studije sugeriraju da bi inhibitori BRD4 mogli biti potencijalna terapijska opcija za upalne bolesti. U modelima ozljede leđne moždine pacova, inhibicija BRD4 je ublažila upalni odgovor i promovirala funkcionalni oporavak mikroglije (Dey et al., 2019). Također, inhibicija BRD4 poništila je eksperimentalnu upalu bubrega na mišjim modelima jednostrane opstrukcije uretera, antimembranskog bazalnog GN i infuzije angiotenzina II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

S obzirom na potencijalne proinflamatorne efekte Cd i regulatorne efekte BRD4 na upalu, pretpostavili smo da je BRD4 uključen u upalni odgovor izazvan Cd-om. Kao što se očekivalo, BRD4 posreduje u procesu transkripcije inflamatornih citokina u modelima bubrega pacova izloženih Cd. Naša studija otkriva potencijalni mehanizam u inflamatornom odgovoru izazvanom Cd-om i pruža nove uvide u terapiju nefrotoksičnosti izazvane Cd-om.

2. Materijali i metode

2.1. Hemikalije i antitijela

Kadmijum hlorid (CdCl2, bezvodni, 439800) je kupljen od Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). ( plus )-JQ1 (HY-13030) je dobijen od MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, SAD). Komplet za ekstrakciju nuklearnog proteina kupljen je od Beyotime Institute of Biotechnology (Šangaj, Kina, P0027). Efikasan komplet za hemiluminiscenciju (ECL, 32209) i reagens za analizu proteina bicinhoninske kiseline (BCA, 23225) dobijeni su od Thermo Fisher Scientific-a (Madison, WI, SAD). Korišćena su primarna antitela protiv sledećih proteina: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) su kupljena od Proteintech Group (Wuhan, Kina); -aktin (3700 s), Histon H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normalni zečji IgG (IgG, 4394) kupljeni su od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD); BRD4 (ab128874), K (lizin) acetiltransferaza 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (acetil K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488– 488–anti-rabbit su kupljeni donkeay3b iz Abcam (Cambridge, UK). Druga antitijela: kozji anti-mišji IgG (H plus L) (115-035-003) i kozji anti-zečji IgG (H plus L) (111-035-003) kupljeni su od Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, SAD ).

2.2. Životinje i eksperimenti

Dvadeset četiri Sprague-Dawley pacova (mužjaci, stari 6 sedmica, 110-120 g) kupljena su od Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Kina). Pacovima je omogućen slobodan pristup hrani i vodi u prostoriji pod kontrolom okoline (24 ± 5 ​​stepeni, 12 h ciklus svjetlosti/mraka). Eksperimentalne procedure bile su primjenjive na Direktivu Vijeća Europske zajednice 2010/63/EU za eksperimente na životinjama, a sve procedure je odobrio Odbor za njegu i korištenje životinja Univerziteta Yangzhou. Nakon jedne sedmice aklimatizacije, pacovi su nasumično podijeljeni u četiri grupe: (1) Kontrolna grupa: intraperitonealno ubrizgan odgovarajući rastvarač (fiziološki rastvor ili 2-hidroksipropil- -ciklodekstrin rastvor). (2) Cd grupa: CdCl2 (2 mg/kg tjelesne težine, rastvoren u fiziološkom rastvoru) ubrizgan intraperitonealno tokom 5 uzastopnih dana da bi se uspostavio model trovanja Cd. (3) Cd plus JQ1 grupa: CdCl2 (2 mg/kg tjelesne težine) ubrizgan intraperitonealno 5 uzastopnih dana kako bi se uspostavio model trovanja Cd, i JQ1 (25 mg/kg tjelesne težine, otopljen u 2-hidroksipropil{{ 25}}otvor ciklodekstrina) ubrizgan intraperitonealno 6-8 dana. (4) JQ1 grupa: JQ1 (25 mg/kg tjelesne težine) ubrizgan intraperitonealno 6-8 dana. Statistički podaci o sadržaju Cd u serumima pacova i tkivima bubrega navedeni su u Tabeli S1, odražavajući uspješno uspostavljanje modela pacova izloženih Cd-u.

Nakon 8 dana tretmana, pacovi su ubijeni dislokacijom grlića materice pod dubokom anestezijom nakon 12 sati gladovanja. Tkiva bubrega su secirana i 1 g tkiva svakog bubrega je brzo pohranjeno na -80 ◦C za praćenje Western blot i kvantitativnu PCR (qPCR) analizu. Preostala količina tkiva je brzo fiksirana u 4 posto paraformaldehida (PFA) za imunohistohemijsko (IHC) bojenje.

2.3. Ćelijska kultura i tretman

Ćelijska linija bubrega pacova (NRK{{0}}E) dobijena je od Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. NRK-52E ćelije su uzgajane sa Dulbeccovim modificiranim Eagleovim medijumom (DMEM, Gibco, 12800-017) koji sadrži 5 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS, Gibco, 10437-028), penicilina i streptomicina (1 00 U/mL) u vlažnom stanju od 5 posto CO2 i 95 posto zraka na 37 stepeni. CdCl2 (ultračista voda – rastvoren) i JQ1 (otopljen u dimetil sulfoksidu) odvojeno su čuvani na 4 stepena i −20 stepeni i razblaženi u radnim rastvorima pre upotrebe. Eksperimentalni dizajn je bio sljedeći: (1) Ćelije su tretirane sa 0, 2,5, 5, 10 μM Cd tokom 12 h, ili 5 μM Cd tokom 0, 6, 12, 24 h da bi se izvršili naredni testovi. (2) Ćelije su tretirane sa 5 µM Cd i/ili 0,5 µM JQ1 tokom 12 h da bi se izvršili sledeći testovi. (3) Ćelije su transficirane sa siBRD4 i/ili tretirane sa 5 μM Cd narednih 12 h da bi se izvršili naredni testovi.

2.4. Mala interferirajuća RNA transfekcija

Transficirali smo 20 nM BRD4 male interferirajuće RNK (siBRD4, Invitrogen, Kalifornija, SAD) u NRK-52E ćelije pomoću reagensa za transfekciju Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) u trajanju od 24 h prema uputstvu za proizvod. Korištene su sljedeće čulne siRNA:

siBRD4, sa ciljnom sekvencom 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (siRNA negativna kontrola), sa ciljnom sekvencom od 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Uzorci tkiva bubrega i NRK-52E ćelije su lizirani u RIPA puferu koji sadrži inhibitore proteaze kako bi se ekstrahirao ukupni protein. Nuklearni protein je unapred pripremljen od svežih tkiva i ćelija i uskladišten na -80 stepeni. Uzorci proteina (20-30 ug po uzorku) su razdvojeni SDS-PAGE elektroforezom, a zatim prebačeni na membrane od poliviniliden fluorida (Millipore, ISEQ00010). Membrane su blokirane sa 5% obranog mlijeka 90 minuta i inkubirane 12 h na 4 stepena sa sljedećim primarnim antitelima: -aktin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Zatim su membrane isprane sa TBST i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelima (1:10000) tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Membrane su inkubirane elektrohemiluminiscencijom (ECL, ThermoFisher Scientific) i određene na Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Francuska), a optička gustoća je analizirana pomoću ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Imunofluorescentno (IF) bojenje

NRK{{0}}E ćelije posađene u 24-ploču sa bunarima su uzgojene do oko 60 posto konfluencije. Ćelije su tretirane sa 5 μM Cd i/ili 0,5 μM JQ1 tokom 12 h, zatim fiksirane sa PFA (4 procenta, 10 min), permeabilizovane sa Triton X- 100 (0,1 procenat, 15 min), blokirane sa BSA (2 procenta, 90 min) na sobnoj temperaturi, i inkubirano sa primarnim antitelom (NF-κB p65, 1:50 razblaživanje) preko noći na 4 stepena. Nakon što su tri puta isprane PBS-om, ćelije su inkubirane sa sekundarnim antitijelima (razrijeđenje 1:500) 90 min, i sa DAPI 5 min na sobnoj temperaturi, zatim su ćelije posmatrane pod konfokalnim mikroskopom. Nuklearna translokacija NF-κB analizirana je u tri nezavisne studije.

2.7. qPCR

Ukupna RNK tkiva bubrega i NRK-52E ćelije su ekstrahovane sa RNAiso Plus kitom (Takara Bio, Shiga, Japan). 1 ug ukupne RNK je korišten za sintezu cDNK 1. lanca prema priručniku proizvođača (Roche, Basel, Švicarska). Uzeto je 2 μL komplementarne DNK (cDNK) po jažici da bi se detektovali relativni nivoi mRNA pomoću LightCycler® 96 PCR sistema u realnom vremenu (Roche). Izračunajte relativne nivoe mRNA prema jednačini 2-△△CT. Prajmeri su navedeni u tabeli S2. -aktin je bio referentni gen pacova.

2.8. Ko-imunoprecipitacija (Co-IP)

Tkiva bubrega i NRK-52E ćelije su lizirane u svježe pripremljenom puferu za lizu stanica (20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 posto Triton X{{8} }) koji sadrži PMSF. Protein G kuglice (100 μL po uzorku, Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD) pomiješane su sa 2 ug BRD4, RelA-K310ac ili IgG antitijela po uzorku i rotirane 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim su ukupni proteinski lizati inkubirani sa kompleksom kuglice-antitijelo preko noći na 4 stepena. Nakon što su tri puta isprani puferom za lizu ćelija, imunoprecipitati su resuspendovani sa 1 × SDS PAGE puferom za uzorke da bi se konfigurisali uzorci. Ciljni proteini su detektovani primenom western blotinga sa anti-BRD4 i anti-RelA K310ac primarnim antitelima.

2.9. Statistička analiza

Svi podaci su dobijeni iz najmanje tri nezavisna eksperimenta i izraženi kao srednja vrijednost ± SEM osim ako nije drugačije navedeno. Eksperimentalne grupe su upoređene nesparenim dvostranim Studentovim t-testom ili jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) koristeći SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Značaj je postavljen na p <>

3. Rezultati

3.1. Cd in vivo i in vitro izaziva ekspresiju upalnih citokina

Kao zagađivač životne sredine, dokazano je da Cd uzrokuje oštećenje bubrega regulacijom niza bioloških procesa (Wang et al., 2019c). U ovoj studiji, promjene u transkripcijskim razinama inflamatornih citokina ispitane su nakon izlaganja Cd-u kako bi se ispitalo da li je upala uključena u Cd-induciranu nefrotoksičnost. Podaci su pokazali da je izloženost Cd značajno povećala nivoe interleukina (IL)-1 i faktora tumorske nekroze (TNF)- proteina u NRK-52E ćelijama (Slika 1A-B) i tkivu bubrega pacova (Slika 1C -D). U međuvremenu, kao što je prikazano na slici 1E-F, izloženost Cd je povećala nivoe transkripcije upalnih citokina (IL-1, IL-6, TNF- i (monocitni kemoatraktantni protein-1) MCP -1) in vivo i in vitro. Ovi nalazi sugeriraju da Cd inducira ekspresiju upalnih citokina u bubrezima pacova.

3.2. BRD4 učestvuje u procesu transkripcije upalnih citokina izazvanom Cd

BRD4 je novoopisani epigenetski regulator koji se vezuje za acetilirane histone ili nehistone kako bi regulirao upalne procese u mnogim bolestima. Ovdje su korišćeni inhibitori BRD4 JQ1 i BRD{4}}siRNA za ispitivanje uloge BRD4 na inflamatorni odgovor izazvan Cd-om. Podaci su pokazali da su nivoi IL-1 i TNF proteina s povišenim nivoom Cd smanjeni tretmanom JQ1 in vivo i in vitro (Slika 2A-D) i srušenjem BRD4 in vitro (Slika S1A-B). U međuvremenu, tretman JQ1 značajno je inhibirao nivoe transkripcije IL-1, IL-6, TNF- i MCP-1 u NRK-52E ćelijama koje su pojačane Cd-om (slika 2E) i tkiva bubrega pacova (slika 2F). Također, BRD4 knockdown značajno je smanjio nivoe transkripcije inflamatornih citokina u NRK-52E ćelijama povećane Cd-om (Sl. S1C). Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da je BRD4 kritični regulator upalnog odgovora u bubrezima pacova izazvanog Cd-om.

3.3. Nivoi ekspresije BRD4 ostaju nepromenjeni nakon izlaganja Cd

Zatim su otkrivene promjene u nivoima ekspresije BRD4 nakon izlaganja Cd. NRK-52E ćelije su tretirane sa Cd pod gradijentom koncentracije, a pacovima je intraperitonealno ubrizgan Cd tokom 5 dana da bi se razjasnio efekat Cd na ekspresiju BRD4 u bubrezima in vivo i in vitro. Rezultati su pokazali da su nivoi BRD4 proteina nepromijenjeni iu NRK-52E ćelijama izloženim Cd (Slika 3A-B) i u tkivima bubrega pacova (Slika 3C-D). Takođe, nivoi BRD4 mRNA su ostali nepromenjeni nakon izlaganja Cd (Slika 3E-F). Ovi rezultati pokazuju da BRD4 posreduje u inflamatornom odgovoru izazvanom Cd-om ne ovisi o promjenama u nivou ekspresije.

3.4. BRD4 reguliše translokaciju NF-κB nuklearne translokacije koju promoviše Cd

Uloga BRD4 u inflamatornom odgovoru izazvanom Cd-om istražena je u našoj studiji. Promjena signalnog puta NF-κB usko je povezana s transkripcijom inflamatornih citokina (Chi et al., 2021). Naša studija je otkrila da je BRD4 uključen u nuklearnu translokaciju reguliranu Cd i aktivaciju NF-κB. Prvo, subcelularna lokalizacija NF-κB određena je IF bojenjem i IHC bojenjem. Podaci na slikama 4A i D pokazuju da JQ1 inhibira Cd-promovisanu translokaciju NF-κB nuklearnih ćelija u NRK-52E ćelijama i tkivima bubrega pacova. U međuvremenu, western blot rezultati su pokazali da JQ1 značajno smanjuje Cd-povećane nivoe nuklearnog proteina NF-κB in vivo (Slika 4B-C) i in vitro (Slika 4E-F). Slično, BRD4 knockdown je također značajno inhibirao Cd-promoviranu NF-κB nuklearnu translokaciju (slika S2A) i smanjio Cd-povećane nivoe nuklearnog proteina NF-κB (slika S2B-C) u NRK-52E ćelijama. Uzeto zajedno, inhibicija BRD4 može smanjiti translokaciju NF-κB nuklearne translokacije koju promoviše Cd, što sugerira da BRD4 posreduje u aktivaciji NF-κB signalnog puta u bubrezima nakon izlaganja Cd.

3.5. Cd povećava nivoe acetilacije RelA K310

Studije su potvrdile da se BRD4 vezuje za acetilirani RelA K310 preko svojih domena broma kako bi regulisao transkripciju zavisnu od NF-κB (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Tako je detektovan nivo acetilacije RelA K310 i ekspresija dva enzima. Podaci su pokazali da se nivoi proteina RelA-K310ac i acetilaze Ep300 kontinuirano snižavaju sa povećanom koncentracijom Cd, dok se nivo proteina deacetilaze Sirt1 postepeno povećava u NRK-52E ćelijama (Slika 5A-B) i tkivima bubrega pacova (Sl. 5C-D). Takođe, nivoi mRNA Ep300 i Sirt1 pokazali su iste trendove (Slika 5E-F). Ovi rezultati sugeriraju da Cd podstiče nivo acetilacije RelA K310, tako da BRD4 može biti uključen u transkripciju inflamatornih citokina izazvanih Cd u bubrezima.

3.6. Cd povećava vezivanje BRD4 za RelA-K310ac kako bi poboljšao njegovu transkripcijsku funkciju

Vezivanje za mesta acetilacije je osnova za regulaciju transkripcije BRD4 (Huang et al., 2009). Da bi se potvrdilo da li Cd reguliše funkciju BRD4 povećanjem vezivanja BRD4 za RelA-K310ac, interakcija između RelA-K310ac i BRD4 je otkrivena preko Co-IP-a. Podaci na slici 6A pokazuju da je Cd značajno poboljšao interakciju između RelA-K310ac i BRD4 u NRK-52E ćelijama, što je ublaženo JQ1 tretmanom ili srušenjem BRD4. Takođe, isti trend je uočen u tkivima bubrega pacova (slika 6B). Ovi rezultati pokazuju da Cd pojačava vezivanje BRD4 za RelA-K310ac, koji promoviše transkripciju zavisnu od NF-κB i nakon toga doprinosi inflamatornom odgovoru izazvanom Cd.

4. Diskusija

Cd je prijavljen kao potencijalni pokretač upale zbog svoje visoke toksičnosti, dok tačan mehanizam još uvijek nije u potpunosti shvaćen (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Naša studija je potvrdila da Cd inducira ekspresiju upalnih citokina u bubrežnim stanicama štakora i otkrila da BRD4, epigenetski cilj koji ima kritične funkcije u nizu ćelijskih procesa uključujući upalu, doprinosi upalnom odgovoru izazvanom Cd-om. Dalji eksperimenti su pokazali da je BRD4 uključen u aktivaciju NF-κB signalnog puta promotivnog Cd-a. Također, Cd je povećao nivo acetilacije RelA K310, čime je povećao vezivanje BRD4 za acetilirani NF-κB RelA kako bi promovirao transkripciju inflamatornih citokina zavisnih od NF-κB.

Upala je jedan od prirodnih mehanizama odbrane od egzogenih hemikalija, dok nekontrolisani i neodgovarajući upalni odgovor može oštetiti normalna tkiva i izazvati autoimune bolesti (Jian et al., 2018). Cd-povećani biološki markeri upale često su bili povezani s različitim bolestima. Studije su pokazale da je upala izazvana Cd uključena u aterogenezu (Tinkov i sar., 2018). Štoviše, Cd je promovirao ekspresiju upalnih citokina, koji su doprinijeli oštećenju tkiva pluća i testisa i inducirali hepatotoksičnost (Koopsamy Naidoo et al., 2019.; Arafa et al., 2014.). Ovi štetni efekti su u skladu s našim rezultatima, da je upalni odgovor uključen u Cd-induciranu povredu bubrega. Sve je više istraživanja fokusirano na mehanizme nastanka upale izazvane Cd-om. Kao dobro proučen član porodice BET proteina, BRD4 igra ključnu ulogu u mnogim biološkim procesima uključujući upalu. Ovdje su JQ1 (inhibitor BRD4) i siRNA korišteni za deregulaciju funkcionalne aktivnosti BRD4 i otkriveno je da inhibicija BRD4 smanjuje transkripciju inflamatornih citokina izazvanu Cd u bubrezima pacova, što sugerira da BRD4 sudjeluje u inflamatornom odgovoru izazvanom Cd. . Općenito se vjeruje da je disregulacija ekspresije BRD4 ključni događaj u nastanku upalnog odgovora. Kod ozljede kičmene moždine, patološke srčane hipertrofije i drugih bolesti povezanih s upalom, poremećena ekspresija BRD4 doprinijela je ekspresiji upalnih citokina (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Međutim, Cd nije imao uticaja na nivoe ekspresije BRD4 u sadašnjim eksperimentalnim uslovima, što nas je navelo da razmotrimo da li BRD4 posreduje u inflamatornom odgovoru izazvanom Cd drugim putevima.

NF-κB je važan regulatorni faktor u upalnim procesima i odgovoran je za kontrolu ekspresije mnogih inflamatornih medijatora (Lawrence, 2009). Studije su objavljene da je BRD4 uključen u regulaciju NF-κB signalnog puta. Huang et al. (2017) sugeriraju da BRD4 reguliše IKK posredovanu aktivaciju NF-κB putem p38 i JNK-MAPK puteva. Wang et al. (2019a) otkrili su da srušenje BRD4 ili tretman JQ1 blokiraju NF-κB signalni put u mikroglijama aktiviran lipopolisaharidom (LPS). Meng et al. (2014) su pokazali da tretman JQ1 blokira ekspresiju inflamatornih citokina inhibiranjem aktivacije NF-κB u RAW 264.7 ćelijama tretiranim LPS-om. Ovi izvještaji su pokazali da BRD4 posreduje u aktivaciji NF-κB u mnogim modelima upale, dok je inhibicija BRD4 efikasan terapijski pristup anti-inflamaciji. U trenutnoj studiji, inhibicija BRD4 blokirala je nuklearnu translokaciju NF-κB u tkivima bubrega pacova izloženim Cd i NRK-52E ćelijama, sugerirajući da BRD4 posreduje u Cd-aktiviranom NF-κB signalnom putu.

Tipično, nakon što je NF-κB aktiviran različitim stimulusima i translocira se u jezgro, BRD4 se veže za acetilirani NF-κB RelA na mjestu K310, što povećava njegovu stabilnost i transkripcijsku aktivnost u jezgru (Hajmirza et al., 2018). Stoga nivo acetilacije RelA K310 utječe na regulatornu funkciju BRD4 na inflamatorni odgovor. U hipokampalnim neuronima, deacetilaza Sirt1 je posredovala u deacetilaciji RelA K310 kako bi regulisala ekspresiju BACE1, što je doprinijelo proizvodnji neuronskog amiloida (Flores-Leon et al., 2019). U ćelijama glioblastoma, fotodinamički terapijski stres smanjio je deacetilazu Sirt1 i aktivirao acetilazu Ep300, što je povećalo nivoe RelA-K310ac i dovelo do povećane proizvodnje dušikovog oksida za preživljavanje (Fahey et al., 2019). Naša studija je otkrila da Cd podstiče nivo acetilacije RelA K310 povećanjem ekspresije Ep300 i smanjenjem ekspresije Sirt1, što ukazuje da Cd utiče na regulatornu funkciju BRD4 povećanjem nivoa acetilacije RelA K310.

Značajno, naši rezultati su pokazali da je tretman JQ1 bio efikasniji od obaranja BRD4 u ublažavanju upalnog odgovora izazvanog Cd-om. JQ1 ima visok afinitet vezivanja sa BRD4 i može gotovo u potpunosti blokirati vezivanje BRD4 za hromozom, dok siBRD4 može samo ometati ekspresiju BRD4 proteina kako bi smanjio vezivanje BRD4 na ciljno mjesto, što sugerira da BRD4 posreduje u Cd-okidanom upalnom odgovoru koji može ovisiti o vezivanje sa acetiliranim NF-κB RelA. Nedavne studije su pokazale sličan regulatorni mehanizam: nakon NF-κB nuklearne translokacije i aktivacije, BRD4 je zatim stupio u interakciju s acetiliranim RelA kako bi koaktivirao transkripcijsku aktivaciju NF-κB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 je regrutovan za NF-κB ciljne promotore u različitim stanjima upalne stimulacije, dok je tretman JQ1 djelovao tako što je spriječio vezivanje BRD4 za acetilirani NF-κB RelA, smanjujući tako transkripcijsku aktivnost NF-κB (Zou et al., 2014). Naši rezultati su pokazali da inhibicija BRD4 blokira interakciju pojačanu Cd između BRD4 i RelA-K310ac u bubrezima pacova, podržavajući naše gore navedene rezultate da inhibicija BRD4 potiskuje Cd-indukovanu transkripcijsku aktivnost NF-κB, što ukazuje da Cd pojačava BRD4 vezanje za acetil NF-κB RelA za povećanje transkripcije inflamatornih citokina.

Ukratko, naša studija je otkrila regulatorne mehanizme BRD4 u inflamatornom odgovoru izazvanom Cd u bubrezima štakora: (1) BRD4 posreduje u translokaciji i aktivaciji nuklearnog NF-κB izazvanu Cd-om. (2) Cd povećava nivoe acetilacije RelA K310 i pojačava vezivanje BRD4 za acetilirani NF-κB RelA, koji promoviše transkripciju inflamatornih citokina zavisnih od NF-κB. Osim toga, inhibicija BRD4 značajno je ublažila nivoe upalnih citokina povišenih Cd, što sugerira da ciljani BRD4 ima potencijal da se razvije kao efikasno sredstvo za liječenje upalnih bolesti uključujući Cd-induciran nefritis.

CrediT izjava o autorskom doprinosu

Zhongguo Gong: konceptualizacija, metodologija, vizualizacija, formalna analiza, validacija, istraga, formalna analiza, kuriranje podataka, pisanje – originalni nacrt. Gang Liu: konceptualizacija, metodologija, vizualizacija, kuriranje podataka, pisanje – originalni nacrt, administracija projekta, pribavljanje sredstava. Wenjing Liu: softver, resursi, metodologija, formalna analiza. Hui Zou: Administracija projekta, nadzor. Ruilong Song: softver, formalna analiza, nadzor. Hongyan Zhao: softver, formalna analiza, nadzor. Yan Yuan: Nadzor. Jianhong Gu: Nadzor. Jianchun Bian: Pribavljanje sredstava, nadzor. Jiaqiao Zhu: Pisanje – recenzija i uređivanje, nadzor. Zongping Liu: Pisanje – recenzija i uređivanje, nadzor,

Administracija projekta, Pribavljanje sredstava, Konceptualizacija.

Izjava o konkurentskim interesima

Autori izjavljuju da nemaju poznatih suprotstavljenih finansijskih interesa ili ličnih odnosa koji bi mogli uticati na rad prikazan u ovom radu.

Priznanje

Ovaj rad je podržan od strane Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (br. 31872533, 31902329, 32072933), Nacionalnog ključnog istraživačkog i razvojnog programa Kine (br. 2016YFD0501208) i projekta Prioritetnog akademskog programa za razvoj visokog obrazovanja Jiangsu. Institucija (PADP). Rukopis je uredio jedan ili više visoko kvalifikovanih urednika koji govore engleski maternji jezik u ELIXIGEN-u za odgovarajući engleski jezik, gramatiku, interpunkciju, pravopis i sveukupni stil.

Reference

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Matična mliječ smanjuje nefrotoksičnost izazvanu kadmijem kod mužjaka miševa. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Ko-izloženost netoksičnim nivoima kadmijuma i fluorida izaziva hepatotoksičnost kod pacova putem pokrećući oksidativno oštećenje mitohondrija, apoptozu i NF-kB puteve. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Prah sjemenki piskavice ublažava oštećenje testisa uzrokovano kadmijem i hepatotoksičnost kod mužjaka pacova. Exp. Toxicol. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting na Nrf2: kako Nrf2 signalizacija može utjecati na terapeutske aktivnosti inhibitora BET proteina. Bioeseji 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Uloge selenoproteina S u formiranju ekstracelularne zamke neutrofila ovisno o reaktivnim vrstama kisika induciranom selenom deficijentni arteritis. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 usmjerava razvoj hematopoetskih matičnih stanica i modulira upalne odgovore makrofaga. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., rođ, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Izloženost kadmijumu povezana je sa rastvorljivim receptorom aktivatora plazminogena urokinaze, cirkulirajućim markerom upale i budućih kardiovaskularnih bolesti. Environ. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Upstream signalizacijski događaji dovode do povećane proizvodnje dušikovog oksida za preživljavanje u fotodinamički izazvanim ćelijama glioblastoma. Slobodni Radic. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Varijacija različitih metabolita i teških metala u Oryza sativa L., povezana s kroničnom bolešću bubrega nepoznate etiologije u Šri Lanki. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon,M.,Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Deplecija NAD( plus ) izazvana palmitinskom kiselinom povezana je sa smanjenom funkcijom SIRT1 i povećanom ekspresijom BACE1 u neuronima hipokampusa. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Tretman kadmijem izaziva ehinokokozu, oštećenje DNK, upalu i apoptozu u srčanom tkivu albino Wistar štakora. Environ. Toxicol. Pharmacol. 59, 43–52. upala i rak. Biomedicina 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Akutna izloženost kadmiju izaziva produženu neutrofiliju zajedno sa odloženom indukcijom faktora stimulacije kolonije granulocita u jetri miševa. Arch. Toxicol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Efekti izlaganja kadmijumu na indukciju upale. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 42 (1), 1–8.