Očuvani sekretorni protein bogat cisteinom MaCFEM85 u interakciji sa MsWAK16 kako bi aktivirao odbranu biljaka

sažetak: Metarhizium anisopliaeje entomopatogena gljiva koja može poboljšati rast i otpornost biljaka kada djeluje kao endofit u biljkama domaćinima. Međutim, malo se zna o interakcijama proteina ili njihovim aktivacijskim mehanizmima. Uobičajeni proteini ekstracelularne membrane gljivica (CFEM) identificirani su kao biljni imuni regulatori koji potiskuju ili aktiviraju reakcije otpornosti biljaka. Ovdje smo identificirali protein koji sadrži CFEM domen, MaCFEM85, koji je uglavnom bio lokaliziran u plazma membrani. Testovi dvohibridne kvasca (Y2H), povlačenja glutation-S-transferaze (GST) i komplementarne bimolekularne fluorescencije pokazali su da je MaCFEM85 u interakciji s ekstracelularnom domenomMedicago sativa(lucerna) membranski protein, MsWAK16. Analize ekspresije gena su pokazale da su MaCFEM85 i MsWAK16 značajno povećane uM. anisopliaeiM. sativa12 do 60 sati nakon ko-inokulacije. Dodatni dvohibridni testovi kvasca i mutacija specifična za aminokiselinsko mjesto pokazali su da su CFEM domen i 52. cistein specifično potrebni za interakciju MaCFEM85 sa MsWAK16. Testovi odbrambene funkcije su pokazali da je JA bio pojačano reguliran, ali veličina lezije Botrytis cinerea i reprodukcija Myzus persicae su potisnuti prolaznom ekspresijom MaCFEM85 i MsWAK16 u modelnoj biljci domaćinu Nicotiana benthamiana. Zajedno, ovi rezultati pružaju novi uvid u molekularne mehanizme koji su u osnovi interakcija M. anisopliae sa biljkama domaćinima.

prednosti dodatka cistanche-povećavaju imunitet

Ključne riječi: kinaza asocirana na zid; CFEMs; Metahizium anisopliae; imunitet biljaka; Medicago sativa

1. Uvod

Interakcije između biljaka i mikroba su široko rasprostranjene i rezultat su prošle i tekuće koevolucije. Ove interakcije mogu imati ili korisne, neutralne ili negativne ishode za svakog učesnika [1–3]. Korisna mikrobiota rizosfere može poboljšati rast biljaka i poboljšati cjelokupno zdravlje tako što štiti od bolesti koje se prenose iz tla ili povećavaju unos hranjivih tvari [4,5]. Širok spektar korisnih mikroba može poboljšati sposobnosti biljaka kao što su uzimanje hranjivih tvari, rast i odbrana od patogena i insekata [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın je važan rod entomopatogenih gljiva sa sposobnošću kolonizacije biljaka [8], ali postoje i dokazi koji ukazuju na to da članovi roda mogu povećati otpornost biljaka na patogene. Na primjer, laboratorijska studija je otkrila 60% inhibicije Fusarium solani (Mart.) Sacc. u prisustvu Metarhizium robertsii (ranije poznat kao M. anisopliae) u poređenju sa kontrolama bez M. robertsii [9]. Neki sojevi Metarhizium imaju potencijal da poboljšaju otpornost biljaka na štetočine i bolesti insekata mijenjajući ekspresiju gena za odbranu biljaka. Endofitska kolonizacija sa M. Robertsom aktivira ekspresiju odbrambenih puteva jasmonske kiseline (JA) i salicilne kiseline (SA) u listovima kukuruza; nadalje, takva kolonizacija je povezana s promocijom rasta biljaka i suzbijanjem razvoja larvi Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense je aktivirao -1,3-glukanazu i hitinazu u kori ploda Lansium paraziticum što je rezultiralo inhibicijom rasta Botrytis sp. i Fusarium sp. na plodu Aglaia dookkoo Griff [11]. Štaviše, kada je M. anisopliae primijenjen na sadnice kikirikija, aktivirali su se različiti faktori transkripcije uključujući WRKY, MYC, TGA i transkripcijski faktori koji reagiraju na etilen, dok su transporteri nitrata i proteini koji se vezuju za elemente koji reagiraju na dehidraciju također različito eksprimirani [12] . Ovo sugerira da M. anisopliae reguliše gene za odbranu biljaka dok kolonizira biljku. Međutim, relativno se malo zna o mehanizmima koji leže u osnovi odbrambenih reakcija biljaka nakon infekcije Metarhiziumom. Efektori su uobičajeno sredstvo pomoću kojeg mikroorganizmi regulišu otpornost biljaka [13]. Aktivaciju otpornosti biljaka obično karakterizira oksidativni nalet i indukcija hormona, metabolita i drugih signala [13]. Biljni hormoni SA i JA igraju važnu ulogu u izazivanju rezistencije biljaka, posredujući u dva odvojena odbrambena signalna puta [14]. Signalni put SA prvenstveno funkcioniše u alergijskom odgovoru biljaka i u sistemskoj stečenoj rezistenciji na patogene, ali može biti uključen i u indirektne odbrambene odgovore biljaka izazvane hranjenjem ubodnih insekata [15]. Akumulacija SA je povezana sa povećanom ekspresijom gena koji kodiraju proteine ​​za prijenos lipida (LTP) i fenilalanin amonijak-liazu (PAL) [16], koji posreduju u sintezi i akumulaciji nizvodno specijalizovanih metabolita kao što su flavonoidi i lignin [17]. JA signalni put funkcionira u direktnim i indirektnim odgovorima na mehanička oštećenja, gljivične patogene i štetočine insekata. Studije su pokazale da JA signalizacija ima regulatorni učinak na sintezu specijaliziranih metabolita kao što su terpenoidi, fenilpropanoidi i alkaloidi, koji imaju širok raspon bioloških funkcija [18]. Pokazalo se da se neki specijalizovani metaboliti akumuliraju u biljnim ćelijama nakon tretmana sa metilJA (MeJA), uključujući paklitaksel u vrstama Taxus [19,20], terpenoide u Centella Asiatica (L.) Urban [21] i saponine u ginsengu [22]. . Primjena SA i hitozana (CHT) kao elicitora izazvala je akumulaciju lignina i reakcije odbrambenih enzima u paradajzu, što je smanjilo incidencu infekcije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Osim toga, nivoi JA i SA u pšenici su značajno akumulirani primjenom elicitora PeaT, pojačavajući odbrambeni odgovor na zobene lisne uši Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Ovo ukazuje da bi imunitet biljaka mogao biti reguliran ovim efektorima putem biljnih hormona i metabolita.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Uobičajeni proteini ekstracelularne membrane gljivica (CFEM) prisutni su u širokom spektru gljiva. Oni kodiraju domene koje obično imaju 60 aminokiselina (aa) i sadrže osam karakteristično raspoređenih cisteina [25]. CFEM domeni su slični domenima epidermalnog faktora rasta (EGF), koji funkcionišu kao ekstracelularni receptori, pretvarači signala ili adhezioni molekuli u interakcijama domaćin-patogen [26]. Proteini koji sadrže CFEM domene mogu manipulirati odgovorom na otpornost biljaka djelujući kao efektori. U gljivi rđe pšeničnog lista Puccinia triticina Erikas, kandidat za CFEM efektor PTTG_08198 je ubrzao napredak ćelijske smrti i promovirao akumulaciju reaktivnih vrsta kisika (ROS) [27]. Gljivica antraknoze Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils sadrži pet efektora (CgCFEM6, 7, 8, 9 i 15) za koje se pokazalo da potiskuju BAX-indukovanu programiranu ćelijsku smrt u Nicotiana benthamiana Domin [28]. Prijavljeno je da fitosimbiotska mikorizna gljiva Laccaria bicolor (Maire) PDOrton luči nekoliko CFEM proteina, kao što su Lac310796, Lac296573 i Lac296572, u simbiotskim tkivima [29]. Iako kompleksne funkcije ovih proteina nisu dalje proučavane u mikoriznoj simbiozi, prethodni rezultati sugeriraju da CFEM proteini mogu funkcionirati u signaliziranju između gljiva i biljaka. M. anisopliae može funkcionirati ili kao entomopatogena ili kao endofitska gljiva u biljci domaćinu [30]. Međutim, uloge CFEM proteina još nisu prijavljene. Prethodno smo identifikovali protein koji sadrži CFEM domen u M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Ovdje izvještavamo o odnosu između MaCFEM85 i Medicago sativa zidne kinaze MsWAK16. Analizirali smo sekvencu MaCFEM85 i sproveli eksperimente kako bismo utvrdili koji su ostaci kritični za interakciju sa MsWAK16. Konačno, koristeći N. benthamiana kao našu modelnu biljku, procijenili smo odbrambene odgovore biljaka na Botrytis cinerea i lisnu uš Myzus persicae sa i bez prolazne ekspresije MaCFEM85 i MsWAK16.

Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Rezultati

2.1. MaCFEM85 je bio najbliži povezan s nepatogenim gljivičnim CFEM-ima i lokaliziran na plazma membrani

Napravljeno je filogenetsko stablo za analizu odnosa između MaCFEM85 i drugih CFEM proteina iz patogenih i nepatogenih modelnih gljiva. To uključuje Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge i Beauveria bassiana (Bals.) (vidi Odjeljak 4). MaCFEM85 je bio najbliži srodan sa CFEM proteinima u B. bassiana, te je stoga evolucijski bliži nepatogenim nego patogenim gljivama (Slika 1a).

Slika 1a

2.2. MaCFEM85 je povećan tokom interakcije sa M. sativa

Kinaze slične receptorima (WAKs) predstavljaju podgrupu unutar superfamilije protein kinaza sličnih receptorima (RLK), i uključuju ekstracelularni domen, transmembranski heliks i intracelularni kinazni domen. Oni igraju važnu ulogu u regulaciji rasta, razvoja biljaka, odgovora na stres i signalnih puteva otpornosti na patogene [32]. RNK je ekstrahirana iz M. anisopliae hyphae i M. sativa korijena nakon ko-inkubacije da bi se istražili obrasci ekspresije MaCFEM85 i MsWAK16. I MaCFEM85 i MsWAK16 su eksprimirani na značajno višim nivoima tokom koinkubacije od 12 do 60 h (Slika 1c,d). Od 0 do 36 h, ekspresija MaCFEM85 se postepeno povećavala, dostižući vrhunac na 36 h. Bila je × 593 puta više izražena u kombinaciji M. anisopliae i M. sativa u poređenju sa M. anisopliae uzgojenom samostalno. Iako je ekspresija MaCFEM85 bila blago smanjena u periodu od 48-60 h, i dalje je bila izražena na značajno višim nivoima nego u M. anisopliae uzgojenoj samostalno. MsWAK16 je takođe bio značajno povećan, sa vrhuncem ekspresije nakon 36 sati. U M. sativa inficiranoj M. anisopliae, MsWAK16 je × 89,06 puta više izražen nego kod M. sativa bez M. anisopliae. Od 36 do 60 sati, nivoi MsWAK16 su se blago smanjili, ali je njegova ekspresija i dalje bila značajno veća nego u neinokuliranim biljkama.

2.3. MaCFEM85 je u interakciji sa MsWAK16 In Vitro i In Vivo

Da bi se istražio potencijalni funkcionalni mehanizam MaCFEM85 kao odgovor na tretman M. anisopliae, obavljeno je ispitivanje dva hibrida kvasca (Y2H) kako bi se preliminarno identificirali proteini domaćina koji su u interakciji sa MaCFEM85. Interakcija između ekstracelularnog domena MsWAK16 (MsWAK16-ED) i MaCFEM85 ispitana je dvohibridnim testom kvasca jedan na jedan koristeći MaCFEM85 u pGBKT7 kao BD vektor i MsWAK16 u pGADT7 kao AD vektor. Svi transformisani kvasac su dobro rasli na podlozi sa nedostatkom SD-T/L, a pozitivna kontrolna grupa i eksperimentalna grupa su uspešno rasle na podlozi sa nedostatkom SD-T/L/H/A + X- -gal. Ovo ukazuje da bi MaCFEM85 mogao stupiti u interakciju sa MsWAK16-ED (Slika 2a).

Slika 2. Validacija interakcije između MaCFEM85 i MsWAK16.

Za in vitro validaciju, glutation-S-transferaza (GST) označena MsWAK16-ED (kodiranje proizvoda od 60 kDa) je umetnuta u pGEX6-P2, a polihistidinom (His) označena MaCFEM85 ( koji kodira proizvod od 17 kDa) umetnut je u pET-21b. Imunobloting sa His i GST antitelima je pokazao da je rekombinantni protein MaCFEM85-His u interakciji sa GST-MsWAK16-ED plenom, ali ne samo sa GST-om i da je GST-MsWAK16- ED stupio u interakciju sa His -MaCFEM85 (Slika 2b). Da bismo dodatno potvrdili interakciju između MaCFEM85 i MsWAK16, izveli smo test bimolekularne fluorescencije komplementarnosti (BiFC) sa MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC konstruktima. Ko-ekspresija MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC u listovima duhana generirala je žuti fluorescentni signal, što ukazuje da je MaCFEM85 stupio u interakciju sa MsWAK16 (slika 2c).

2.4. Ključne lokacije za interakcije MaCFEM85 i MsWAK16

Da bi se definisao region MaCFEM85 koji je potreban za interakciju sa MsWAK16-ED, proteinski domeni su predviđeni onlajn softverom SMART (slika 3a). MaCFEM85 je sadržavao CFEM domen u 19-86 aa regiji. Predviđena je i tercijarna struktura (slika 3b). Osam cisteina u ovom domenu rezultiralo je sa četiri disulfidne veze (CYS26 i CYS69, CYS30 i CYS64, CYS43 i CYS50 i CYS52 i CYS85), održavajući stabilnost proteina (slika 3b). Da bi se potvrdila pretpostavljena interakcijska mjesta u MaCFEM85, generirano je sedam mutiranih verzija proteina i ubačeno u pGBKT7 kao proteini mamaca. Svaki rekombinantni vektor je kotransficiran sa AD-MsWAK16-ED u Y2H Gold soju. Soj sa mutiranim CYS52 nije rastao na selektivnom mediju (Slika 3c, označena crvenom bojom), što ukazuje da je CYS52 neophodan za interakciju MaCFEM85 sa MsWAK16-ED.

2.5. Interakcija MaCFEM85 sa MsWAK16 aktivira imunološki odgovor biljaka

2.5.1. Procjena uloge MaCFEM85 i MsWAK16 u otpornosti na bolesti protiv B. cinerea

Da bismo istražili moguće učešće MaCFEM85 i MsWAK16 u odgovorima odbrane patogena, ispitali smo da li prekomjerna ekspresija MaCFEM85, MsWAK16 ili MaCFEM85 i MsWAK16 može dati povećanu otpornost na B. cinerea. Ove vektore smo privremeno eksprimirali u listovima N. benthamiana. Western blot test je pokazao da su MaCFEM85 i MsWAK16 eksprimirani na uporedivim nivoima kada su eksprimirani sami ili zajedno, što pokazuje da su MaCFEM85 i MsWAK16 uspješno eksprimirani u duhanu (Slika 4a). Testovi bolesti su također izvedeni korištenjem N. benthamiana infiltrirane sa MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 ili GFP kontrolom. Lezije su bile značajno manje (za ~30% u 2 dana nakon inokulacije) na listovima infiltriranim sa MaCFEM85, MsWAK16 ili MaCFEM85+MsWAK16 u poređenju sa kontrolnim biljkama (Slika 4b). Ovi podaci pokazuju da prolazna ekspresija MaCFEM85 u N. benthamiana daje povećanu otpornost na B. cinerea i da MaCFEM85 i MsWAK16 pozitivno regulišu odbrambeni odgovor protiv B. cinerea.

Slika 3. Identifikacija mjesta interakcije između MaCFEM5 i MsWAK16.

Slika 4. Indukcija otpornosti biljaka prolaznom ekspresijom MaCFEM85 i MsWAK16.

2.5.2. Procjena uloge MaCFEM85 i MsWAK16 u obrani od lisnih uši kod N. benthamiana

Da bi se dalje istražila uloga MaCFEM85 i MsWAK16, biljke N. benthamiana koje prolazno eksprimiraju MaCFEM85 i MsWAK16 bile su zaražene M. persicae i procijenjene su populacije. Za ovaj eksperiment, velika površina svakog lista N. benthamiana je agroinfiltrirana sa rekombinantnim binarnim vektorom pYBA1132 koji sadrži MaCFEM85 i MsWAK16. GFP je korišten kao kontrola. 12 h nakon infiltracije, 20 odraslih jedinki M. persicae stavljene su u kavez na svaki list, izlažući infiltrirano područje lisnim ušima. U naredna tri dana zabilježena je smrtnost odraslih lisnih uši i broj nimfi; nimfe su zatim uklonjene. Nije bilo značajne razlike u riziku od smrtnosti među populacijama M. persicae koje se hrane biljkama koje eksprimiraju MaCFEM85, MsWAK16 ili MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (Slika 4c). Međutim, nakon 24, 48 i 72 h, prosječan broj potomaka koje je proizvela svaka odrasla lisna uš bio je značajno veći na N. benthamiana koja je eksprimirala GFP kontrolu u poređenju sa onima koji eksprimiraju MaCFEM85, MsWAK16 ili MaCFEM85+MsWAK16 (Slika 4d).

2.5.3. Procjena uloge MaCFEM85 i MsWAK16 u akumulaciji hormona i ekspresiji gena povezanih s hormonima

Da bismo analizirali razlike između odbrambenih odgovora biljaka N. benthamiana koje eksprimiraju eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 i MaCFEM{2}}MsWAK16, mjerili smo nivoe JA, SA i ukupnih flavonoida, kao i ekspresiju srodnih gena. Rezultati su pokazali da se nivoi JA i SA razlikuju između biljaka koje eksprimiraju eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16 (Slika 5a). U poređenju sa onima koje eksprimiraju eGFP, nivoi JA su bili značajno niži u biljkama koje eksprimiraju MaCFEM85; Nivoi SA su neznatno povećani, ali razlike nisu bile značajne. Nasuprot tome, biljke koje eksprimiraju MsWAK16 nisu pokazale značajne razlike u nivoima JA u poređenju sa eGFP kontrolom, dok su nivoi SA bili značajno niži nego u kontroli (Slika 5a). Nivoi JA i SA su značajno povećani, odnosno smanjeni, u biljkama koje eksprimiraju MaCFEM85+MsWAK16 u poređenju sa eGFP.

Slika 5. Nivoi hormona i ekspresija gena za hormonski odgovor

Ukupni sadržaj flavonoida bio je značajno veći u biljkama koje eksprimiraju MaCFEM85+MsWAK16 u poređenju sa svim drugim tretiranim grupama (Slika 5a). Nivoi ekspresije biosintetskih gena bili su slični u biljkama koje eksprimiraju MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16. Na primjer, geni povezani s JA odgovorom, odnosno COI1, MYC2 i PDF1.2, značajno su povećani u poređenju sa biljkama koje eksprimiraju GFP (slika 5b). Slično, SA-srodni geni NPR1, WRKY70 i PR1 su značajno različito eksprimirani u biljkama koje eksprimiraju MsWAK16 i MaCFEM{16}}MsWAK16; NPR1 je bio povišen, dok su WRKY70 i PR1 bili smanjeni u poređenju sa kontrolom (Slika 5b). Također smo ispitali ekspresiju ključnih gena u putevima sinteze šikimske kiseline i fenilpropanoida, koji su oba povezana sa sintezom flavonoida. Generalno, ekspresija samo MaCFEM85 nije izazvala značajno veću ekspresiju ovih gena u duhanu. Međutim, ovi geni su pojačano regulirani u duhanu koji eksprimira MsWAK16 ili MsWAK16+MaCFEM85 u poređenju sa GFP kontrolom (Slika 5c).

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

3. Diskusija

3.1. Konzervirani CFEM proteinski motiv služi višestrukim funkcijama u gljivičnim vrstama

CFEM domena je jedinstvena za gljive i obično se javlja u gljivičnim ekstracelularnim membranskim proteinima. Domen potiče od najnovijeg zajedničkog pretka Ascomycota i Basidiomycota [33]. Nedavna istraživanja su pokazala da CFEM proteini u gljivičnim patogenima mogu djelovati kao imunološki regulatori biljaka, uzrokujući supresiju ili aktivaciju imuniteta biljke domaćina ovisno o vrsti infekcije [28,34,35]. Bilo je nekoliko izvještaja o proteinima koji sadrže CFEM domen u M. anisopliae, samo u kontekstu evolucijskog poređenja s drugim gljivama [36]. U ovoj studiji uporedili smo CFEM proteine ​​M. anisopliae sa drugim poznatim CFEM proteinima u patogenim i nepatogenim gljivama. Potvrdili smo da je najbliži homolog MaCFEM85 Cfem5 pronađen u Beauveria bassiana, jednom od 12 CFEM proteina u toj vrsti (dodatna slika S1). BbCfem5 je neophodan za akviziciju gvožđa [37]. Štaviše, na osnovu predviđene tercijarne strukture, CFEM domen u MaCFEM85 je vrlo sličan površinskom antigenu proteinu 2 (CSA2) pronađenom u Candida albicans (CProbin) Berkhout, u kojem je 65 ostataka (96% sekvence) modelirano sa 99,8 % pouzdanosti [31]. Candida albicans je životinjski patogen; CSA2 igra važnu ulogu u rastu i patogenosti ekstrakcijom hema iz hemoglobina i transportom hema iz ćelijskog zida u plazmu [38–40]. Pretpostavljamo da bi MaCFEM85 mogao biti uključen u virulenciju M. anisopliae kod insekata domaćina. Ove kombinovane funkcije MaCFEM85 u patogenim infekcijama životinja i aktivaciji biljnog imuniteta čine protein uzbudljivim budućim istraživačkim fokusom.

3.2. Disulfidne veze su važne strukture za funkciju proteina

Konformacioni integritet proteinske strukture direktno je povezan sa njenom sposobnošću da funkcioniše. Disulfidne veze koje formiraju cisteinski parovi promovišu savijanje proteina i konformacionu stabilnost i smatra se da formiraju ključna mjesta za prepoznavanje i vezivanje specifičnih receptora ili liganada [41]. Na primjer, prekid bilo koje od tri očuvane disulfidne veze u biljnom patogenu Cladosporium fulvum efektor proteina AVR4 rezultira osjetljivošću na proteazu i smanjenom sposobnošću vezivanja hitina [42]. U tri druga proteina C. fulvum (ECP1, ECP2 i ECP5), pojedinačne zamjene alanina za cisteine ​​prigušuju preosjetljivi odgovor paradajza, što ukazuje da su cisteini kritični za održavanje stabilnosti i aktivnosti izazivanja preosjetljivosti [43]. Štaviše, u zrelom proteinu MC69 Magnaporthe oryzae, mutageneza dva konzervirana cisteinska ostatka (Cys36 i Cys46) može poremetiti funkciju MC69 bez utjecaja na sekreciju, što ukazuje na važnost disulfidne veze posebno u patogenosti MC69 [44]. Čini se da je CFEM domen sličan po veličini i uzorku cisteinskih ostataka domenima sličnim EGF-u, koji sadrže tri ili četiri para disulfidnih veza. EGF proteini mogu funkcionirati kao receptori na površini ćelije, pretvarači signala ili molekuli adhezije u interakcijama domaćin-patogen [45]. U ovoj studiji ne samo da smo otkrili da CFEM domena MaCFEM85 sadrži osam konzerviranih cisteina koji formiraju četiri para disulfidnih veza (slika 3b), već smo također potvrdili da je CFEM kritična domena za interakciju između MaCFEM85 i MsWAK16. Nadalje, kroz mutaciju cisteinskih ostataka u alanin usmjerenu na mjesto, otkrili smo da je cisteinski ostatak na poziciji 52 jezgro potrebno za interakciju (slika 3c). Ovi rezultati daju osnovu za dalja istraživanja fizioloških funkcija interakcije CFEM85–WAK16.

3.3. Interakcija MaCFEM85 sa MsWAK16 aktiviranom odbranom biljaka

U interakcijama mikrob-biljka, odbrambene reakcije biljaka općenito se aktiviraju mikrobnim efektorskim proteinima. Inducirana odbrana postaje važan alat u biološkoj kontroli štetočina za promicanje otpornosti. CFEM proteini su identificirani kao efektori uključeni u regulaciju imunološke aktivacije ili inhibicije biljaka [28,46]. Međutim, postoji malo objavljenih istraživanja koja povezuju regulaciju ovih imunoloških faktora s njihovom specifičnom ulogom u biljnim bolestima i otpornosti na insekte. U ovoj studiji koristili smo entomopatogenu i endofitnu gljivu, M. anisopliae, da identifikujemo interakciju između MaCFEM85 i kinaze povezane sa ćelijskim zidom, MsWAK16, u M. sativa. Rezultati su pokazali da je ova interakcija smanjila omjer lezija nakon inokulacije s B. cinerea (Slika 4b) i smanjila stopu rasta populacije M. persicae (Slika 4d), što ukazuje da je interakcija između MaCFEM85 i MsWAK16 povećala otpornost M. sativa na lisne uši. Promjene u razinama JA, SA i etilena (ET) mogu se koristiti kao markeri za procjenu indukcije otpornosti biljaka [47,48]. Ovdje smo pokazali da je MaCFEM85 u interakciji sa MsWAK16 utjecao na otpornost biljaka kroz hormonsku regulaciju i inhibirao stopu reprodukcije M. persicae (Slika 4d). Slične studije su ranije objavljene. Na primjer, pokazalo se da efektorski protein Brevibacillus laterosporus PeBL1 izaziva akumulaciju JA i SA u paradajzu i smanjuje stopu rasta druge i treće generacije populacija M. persicae koje su se hranile tim biljkama. Osim toga, biljke paradajza prskane efektorima imaju repelentni učinak na M. persicae [49]. Primena elicitornog proteina PeBC1 na grah (Phaseolus vulgaris L.) dovodi do izraženih i značajnih subletalnih efekata na lisne uši zelene breskve. Biljke tretirane sa PeBC1 pokazuju značajnu regulaciju gena povezanih sa JA i SA [50]. Beauveria bassiana elicitor PeBb1 smanjuje plodnost M. persicae na duhanu i inducira ekspresiju gena povezanih s JA i ET [51]. U ovoj studiji, prolazna ekspresija MaCFEM85 i MsWAK16 u duhanu značajno je pojačala regulaciju gena COI1, MYC2 i PDF1.2 povezanih s JA odgovorom (slika 5b) i povećala sadržaj JA i ukupnog flavonoida (slika 5a), što je bilo uporedivo s rezultatima u literaturi kao što je gore opisano. Međutim, nismo otkrili visoke nivoe SA u duhanu 12 sati nakon infiltracije, a biljke koje prolazno eksprimiraju MsWAK16 ili MaCFEM85+MsWAK16 pokazale su značajno smanjene nivoe SA i regulaciju gena uključenih u SA odgovor (Slika 5a,b) . Ovo je pokazalo da stimulacija različitih biljnih hormona može dovesti ne samo do sinergijskih aktivnosti već i do preslušavanja i povratnih informacija, omogućavajući biljkama da na odgovarajući način reagiraju na različite podražaje. Povećani nivoi JA, ali niski nivoi SA su ranije prijavljeni u biljkama. Na primjer, kod A. thaliana defektne za akumulaciju SA, nivoi JA su bili 25-putostruko veći nego kod divljeg tipa A. thaliana, a aktivirani su geni koji reagiraju na JA [52]. Također je objavljeno da neke bakterije mogu povećati nivoe JA u biljkama kako bi inhibirali akumulaciju SA, izbjegavajući štetu koju uzrokuje SA. Na primjer, Pseudomonas syringae cilja na COI1 receptor preko toksina, koronatina, koji negativno reguliše JA put [53]. Ovo promoviše MYC2-indukovanu pojačanu regulaciju faktora transkripcije ANAC019, ANAC055 i ANAC072 [54], inhibirajući transkripciju ICS1 (ključnog gena za sintezu SA) i na taj način smanjujući proizvodnju SA i transdukciju signala. U ovoj studiji, interakcija između MaCFEM85 i MsWAK16 dovela je do povećane akumulacije JA i regulacije gena koji reagiraju na JA, ali inhibicije akumulacije SA i transkripcije gena povezanih sa SA. Ovo ukazuje da interakcija između MaCFEM85 i MsWAK16 izaziva JA, čime se poboljšava otpornost biljaka na lisne uši.

U N. benthamiana koja prolazno eksprimira MaCFEM85 i MsWAK16, nivoi JA su povećani, a veličina lezija B. cinerea smanjena (Slika 4b), u skladu sa prethodnim studijama. JA je uključen u otpornost biljaka na insekte i nekrotrofne patogene [52,55]. Kao nekrotrofni patogen, B. cinerea je inhibirana akumulacijom JA i ET [56]. Kod A. thaliana ET-deficijentnog mutanta ein2-1 i JA-response mutanta coi1-1, nivoi nizvodnog odbrambenog gena, PDF1.2 su značajno smanjeni i osjetljivost na B. cinerea je povećana [ 57]. Ovdje smo otkrili da su akumulacija JA i transkripcija gena povezanih sa JA značajno povećani u N. benthamiana koja prolazno eksprimira MaCFEM85 i MsWAK16, dok su akumulacija SA i transkripcija gena povezanih sa SA bili inhibirani. Ekspresija MaCFEM85 i MsWAK16 takođe je pokazala inhibitorni efekat na B. cinerea. Ovo ukazuje da je JA aktiviran od strane MaCFEM85 i MsWAK16 i da je igrao vodeću ulogu u otpornosti biljaka na B. cinerea.

4. Materijali i metode

4.1. Sojevi gljivica, biljni materijali i metode uzgoja

Sojevi izolata Metarhizium anisopliae Ma 9 uzgajani su na podlozi krompir-šećer-agar (PSA) (200 g oljuštenog ekstrakta krompira kuvanog u vodi, 20 g saharoze i 15 g agara/L). Svježi prah sporangijuma sakupljen je nakon 10 d. Biljke Nicotiana benthamiana uzgajane su u vještačkoj klimatskoj komori sa ciklusom svjetlo/mrak od 14/10 h (27/25 ◦C). Za prolaznu ekspresiju gena putem transformacije posredovane Agrobacteriumom, soj Agrobacterium tumefaciens GV3101 uzgajan je u mediju Luria Broth (LB) (10 g triptona, 5 g ekstrakta kvasca i 10 g NaCl/L). Soj kvasca Gold (OE Biotech Co., Ltd., Šangaj, Kina) uzgajan je na mediju ekstrakta kvasca pepton dekstroze (YPDA) (10 g ekstrakta kvasca, 20 g peptona, 20 g glukoze i 0,03 g adenin hemisulfata/L). Za svaki vektor i soj korišćeni su odgovarajući antibiotici, odnosno rifampin, kanamicin ili ampicilin (25, 50, odnosno 50 µg/mL, respektivno). Sojevi i plazmidi korišteni u ovoj studiji navedeni su u Dodatnoj tabeli S1. Sjemenke Medicago sativa površinski su sterilizirane sa 75% etanolom u trajanju od 1 minute, a zatim sa 50% NaClO (5,5%) tijekom 15 minuta. Sjemenke su dobro promiješane i isprane u sterilnoj vodi tri puta po 5 minuta. Sjeme je inkubirano na 4 ◦C u mraku više od 24 sata, a zatim je klijalo na pločama s 1% vodenim agarom na sobnoj temperaturi preko noći. Tri dana nakon nicanja, sadnice u razvoju su prebačene na filter papir na sterilne petrijeve posude od 9-cm, sa 20 sadnica po posudi. Tretmani i kontrola su raspoređeni na po 15 jela. Sadnice su zatim navodnjavane sa 10 mL suspenzije spora M. anisopliae koja je sadržavala 107/mL, a kontrola je navodnjavana sa 10 mL sterilne vode. U 0, 12, 24, 48 i 60 h, slučajni odabir sadnica je uzet iz tri petrijeve posude za svaki vremenski interval. Uzorci su zamrznuti u tečnom dušiku i pohranjeni na -80 ◦C.

4.2. qRT-PCR i konstrukcija plazmida

Ukupna RNK ekstrahirana je iz M. anisopliae (hife) i M. sativa (korijeni) TRIzol reagensom (Invitrogen, Kalifornija, SAD) prema uputama proizvođača. Kvalitet i brojnost rezultirajuće RNK mjereni su NanoPhotometrom® (Implen, München, Njemačka). Sinteza cDNK prvog lanca (do 2 ug RNA) izvedena je korištenjem 5× All-In-One RT Master Mixa (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) prema uputama proizvođača. qRT-PCR je izveden korišćenjem 2×SYBR Green qPCR Master Mixa iz US EVER BRIGHT® INC. i ABI QuantStudio 5 sistema prema uputstvima proizvođača. Prajmeri koji se koriste za svaki gen navedeni su u Dodatnoj tabeli S2. Maury [58], Msactin [59] i Nbactin [60] su korišteni kao interni referentni geni za normalizaciju podataka o ekspresiji. Reakcija je izvedena pod sledećim uslovima: 5 min na 95 ◦C, nakon čega je usledilo 40 ciklusa na 95 ◦C tokom 15 s i na 60 ◦C tokom 40 s. Postojale su tri tehničke replike za svaki uzorak. Relativna ekspresija je izračunata metodom 2−∆∆Ct [61]. Statistička značajnost je određena korištenjem jednosmjerne analize varijanse (ANOVA) i Duncan-ovog testa višestrukih opsega u SPSS v20.0 (SPSS).

4.3. Prolazna ekspresija proteina u N. benthamiana

MaCFEM85 kodirajuća sekvenca (CDS) je amplificirana sa ultra vjernom DNK polimerazom koristeći cDNK kao šablon. Za testove subcelularne lokalizacije, PCR proizvodi koji sadrže CDS za MaCFEM85 su klonirani u pYBA1132-eGFP (svaren sa EcoRI i SalI) i pcambia1300-trešnje (EcoRI i SacI), respektivno. Svi konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Peking, Kina). Prajmeri korišteni u ovoj studiji navedeni su u Dodatnoj tabeli S2. Za prolaznu ekspresiju MaCFEM85-eGFP i MaCFEM85-mCherry u N. benthamiana, A. tumefaciens soj GV3101 je transformisan sa svakim plazmidom i verifikovan PCR-om. Agrobacterium je kultivisan preko noći na 28 ◦C uz mućkanje. Ćelije su sakupljene 5 min centrifugiranjem na 5000 rpm na sobnoj temperaturi, isprane tri puta sterilnom dvostruko destilovanom vodom i resuspendovane u 10 mM MgCl2 puferu (koji sadrži 10 mM MES i 10 mM acetosiringona, pH 5,7). Suspenzija ćelija je podešena na OD600 od 0,5, a zatim infiltrirana u donju stranu od 4- do 5-nedjeljnih listova N. benthamiana sa 1-mL špricem. Svaki list je infiltriran sa 50 µL A. tumefaciens; tretirana su tri lista po biljci i tri biljke su bile u svakoj tretiranoj grupi. Tretirani listovi su sakupljeni nakon 30 h i vizualizirani Zeiss LSM980 konfokalnim mikroskopom (Carl Zeiss, Njemačka) kako bi se odredila subćelijska lokalizacija.

cistanche koristi za muškarce - jača imunološki sistem

4.4. Filogenetska analiza

Filogenetsko stablo je konstruirano korištenjem metode spajanja susjeda u MEGA X. 1000 bootstrap replika je koristilo model P-distance. Aminokiselinske sekvence korišćene za generisanje stabla dobijene su BLASTP pretragama u NCBI bazi podataka o srodnim gljivama (npr. Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigadiatus, G. , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana i Paecilomyces lilacinus) koristeći MaCFEM85 kao upit.

4.5. Testovi dva hibrida kvasca

Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; sada Takara Bio USA, Inc.) je korišten za provjeru interakcije između MaCFEM85 i MsWAK16. MaCFEM85 bez signalnog peptida je uveden u pGBKT7 kao mamac, a ekstracelularni domen MsWAK16 (MsWAK16-ED) je umetnut u pGADT7 kao plijen. Priprema i transformacije ćelija kompetentne za kvasac izvedene su korištenjem Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, SAD) prema uputama proizvođača. Plazmidi mamaca i plijena su ko-transformirani u soj kvasca Gold. Interakcije protein-protein analizirane su na osnovu rasta na SD medijumu dvostrukog ispadanja (DDO, SD/-Trp-Leu) i SD četvorostrukom ispadanju medijuma (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade) pločama.

4.6. BiFC Assay

Da bi se generisali BiFC konstrukti, vektori pUC-SPYNE i pUC-SPYCE su linearizovani digestijom sa BamHI. CDS-ovi pune dužine MaCFEM85 i MsWAK16 su klonirani i umetnuti u linearizirane plazmide korištenjem rekombinantnog enzima da bi se dobili MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC konstrukti. Plazmidi koji sadrže MaCFEM85 i MsWAK16 su ko-transformirani sa praznim vektorima kao negativnim kontrolama (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE i pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Svi vektori su uvedeni u N. benthamiana putem transformacije posredovane Agrobacteriumom kao što je gore opisano. Signali fluorescencije su uočeni u epidermalnim ćelijama lista korišćenjem konfokalnog mikroskopa Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Nemačka). Prajmeri koji se koriste za konstrukciju vektora navedeni su u Dodatnoj tabeli S2.

4.7. GST Pull-Down test

Za GST pull-down testove, MsWAK16-ED je umetnut u pGEX-6P-2 vektor, a MaCFEM85 je umetnut u pET-21b. Pročišćeni fuzioni proteini (GST- MsWAK16- ED) i pGEX-6P-2 protein bez opterećenja (GST) korišteni su kao protein mamca i pročišćeni pET-21 Kao plijen je korišten fuzioni protein b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85). GST pulldown testovi su izvedeni sa Mag-Beads GST Fusion sistemom za pročišćavanje proteina (Sangon Biotech, Šangaj, Kina) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, Mag-Beads su isprane pet puta sa 1× fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom (PBS, pH 7,4) da bi se oslobodio zaštitnik alkohola i zatim je dodano 10 mL GST ili GST-MsWAK16-ED. Zrnca su miješana inverzijom na sobnoj temperaturi 30 min. Nakon uklanjanja supernatanta, Mag-perle su isprane pet puta sa 1× PBS. His-MaCFEM85 je dodat Mag-Beads već vezanim sa GST, a smjesa je inkubirana preko noći na 4 ◦C uz rotaciju. Perle su zatim isprane pet puta sa 1× PBS da bi se uklonili nevezani proteini. Nakon toga, proteini imobilizirani na kuglicama su razdvojeni pomoću SDS-PAGE, prebačeni na nitroceluloznu membranu (100 V, 1 h) i analizirani Western blot-om. Membrane su isprane tri puta po 10 minuta sa PBS + Tween (PBST). Membrane su blokirane 2 h na sobnoj temperaturi sa 5% obranog mlijeka, a zatim inkubirane s ProteinFind anti-His mišjim monoklonskim antitijelom (TransGen Biotech, Peking, Kina) (razrijeđeno 1:3000) ili ProteinFind anti-GST mišjim monoklonskim antitijelom za 2 h na 4 ◦C. Membrane su zatim uronjene u ProteinFind kozje anti-zečje IgG(H+L) (HRP) antitelo (TransGen Biotech, Peking, Kina) (razblaženo 1:5000) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Membrane su vizualizirane pomoću EasySee® Western Blot kompleta (TransGen Biotech, Peking, Kina) prema uputama proizvođača.

4.8. Identifikacija ključne lokacije u MaCFEM85

Da bi se odredila veličina potrebna za interakciju MaCFEM85 sa MsWAK16, izvedena je PCR amplifikacija kako bi se generisali višestruki skraćeni oblici MaCFEM85. CFEM domen (MaCFEM85-CFEM; aa ostaci 19–86) i C terminal bez CFEM domena (MaCFEM85-C, aa ostaci 87–170) su umetnuti u vektor pGBKT7 kao protein mamaca (dodatna tabela S1). Još pet varijanti je konstruisano korišćenjem sinteze polipeptida za mutaciju cisteina u alanin na pozicijama 26, 30, 43, 52 i 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8526, ∆CFEM8530,∆CFEM8530CF8, CFEM8552 i ∆CFEM858 sve, respektivno). Ove varijante su korištene za izvođenje Y2H eksperimenata sa MsWAK16-ED. Transformirane ćelije kvasca ispitane su na rast na sintetičkim SD/- Trp-Leu pločama i SD/-Trp-Leu-His-Ade pločama koje sadrže X- -galaktozidazu (X- -Gal).

4.9. Testovi rezistencije biljaka

Myzus persicae dobijeni su od Henan Quanying Biological Co., Ltd. Nedelju dana pre početka bioloških testova, 150 odraslih lisnih uši postavljeno je na tri biljke N. benthamiana (50 lisnih uši po biljci). Nakon 72 h, sve odrasle jedinke su uklonjene mekom umjetnom četkom, a nimfama je ostavljeno da se hrane još četiri dana prije nego što su prebačene u N. benthamiana na testove performansi lisnih uši.

4.10. Testovi performansi lisnih uši

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) je korišten za procjenu performansi M. persicae, otpornosti biljaka na bolesti protiv B. cinerea i ekspresije gena povezanih s hormonima. Agrobakterije koje nose ili pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 ili pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 su uzgajane u LB uz dodatak odgovarajućih antibiotika tokom 36 h na 28 ◦C. Ćelije su isprane tri puta, zatim resuspendirane u infiltracionom puferu (10 mM MgCl2, 10 mM MES i 100 µM acetosiringona, pH 5,6) do OD600 od 0,6. Za koinfekciju, bakterije koje nose MaCFEM85 i MsWAK16 su podešene na OD600 od 1,2, a zatim pomiješane u jednakim količinama. Potpuno prošireni listovi su infiltrirani bakterijama pomoću 1-mL špriceva bez igle. Tri lista su infiltrirana na svaku biljku i svaki tretman je primijenjen na tri biljke za ukupno 12 biljaka po eksperimentu.

Za analizu performansi lisnih uši, 20 odraslih lisnih uši je naneseno na infiltrirano područje svakog lista 12 sati nakon primjene Agrobacterium. Lisne uši su zatvorene pomoću kaveza sa klipovima prečnika 5 mm. Svaki tretman je ponovljen pet puta. Smrtnost odraslih lisnih uši i broj novoležanih nimfi bilježi se dnevno tri dana. B. cinerea je kultivisan pet dana na PDAY. 12 h nakon infiltracije Agrobacterium, novokultivisana B. cinerea je izbušena u 5-mm pogaču gljivice, a površina rasta micelija je pričvršćena za područje infiltracije na površini lista. Da bi se olakšao razvoj bolesti, biljke su održavane vlažnim pokrivajući ih plastičnom folijom u posudama na 22 ◦C kako bi se olakšalo napredovanje bolesti. Nakon 48 h, napredak bolesti je procijenjen na inokuliranim listovima mjerenjem veličine lezija. Za kvantifikaciju relativne ekspresije relevantnih gena, tri infiltrirana lista su sakupljena sa svake biljke 12 sati nakon infiltracije, zatim zamrznuta u tečnom azotu i pohranjena na -80 stepeni. Ekstrakcija ukupne RNK, sinteza cDNK i qRT-PCR izvedeni su kako je opisano u Odjeljku 3.2. Nivoi salicilne kiseline (SA), jasmonske kiseline (JA) i flavonoida mjereni su u 15 infiltriranih listova N. benthamiana po tretmanu. Listovi su sakupljeni, zamrznuti u tečnom azotu, zatim pohranjeni na -80 stepeni. Biljni hormoni su kvantificirani pomoću ELISA kompleta za saliciličnu kiselinu i jasmonsku kiselinu (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), a flavonoidi su kvantificirani korištenjem kompleta za analizu mikro biljnih flavonoida (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) nakon uputstva proizvođača.

4.11. Statistička analiza

Podaci su analizirani u SPSS v20.0. Značajne razlike u nivoima ekspresije MaCFEM85 i MsWAK16 utvrđene su korišćenjem Studentovog t-testa. Značajne razlike u nivoima SA, JA i flavonoida su određene korišćenjem jednosmerne ANOVA i Duncan-ovog testa višestrukih opsega sa pragom od p < 0,05.

5. Zaključci

U ovoj studiji identifikovali smo i okarakterizirali novi izlučeni protein, MaCFEM85, u M. anisopliae. Utvrđeno je da je to konzervirani efektor koji može stupiti u interakciju sa MsWAK16 i aktivirati odbrambeni odgovor N. benthamiana. Pokazali smo da su CFEM domen i cisteinski ostatak na poziciji 52 u MaCFEM85 kritični za interakciju. Ova interakcija može aktivirati imune odgovore povezane sa JA i mehanizme otporne na bolesti i insekte u biljci.

Reference

1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Partnerstvo između biljaka i mikroba: implikacije na rast i zdravlje biljaka. U simbiozi biljnih mikroba: osnove i napredak; Springer: Berlin/Heidelberg, Njemačka, 2013; str. 105–117. [CrossRef]

2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Razotkrivanje interakcija između biljaka i mikroba: Može li transkriptomika više vrsta pomoći? Trends Biotechnol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]

3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Nahranite svoje prijatelje: Da li eksudati biljaka oblikuju mikrobiom korijena? Trends Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]

4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Rizobakterije koje potiču rast biljaka. Annu. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]

5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Inducirana sistemska rezistencija i odgovori biljaka na agense za biokontrolu gljiva. Annu. Rev. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]

6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Metaboličke i transkriptomske promjene izazvane kod Arabidopsis rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Plant Physiol. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]

7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Komunikacija korijena i mikroba biljke u oblikovanju mikrobioma korijena. Plant Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]

8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Insekti-patogena gljiva Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) je takođe endofit koji stimuliše razvoj korena biljke. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]

9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonizam patogene gljive endofitnih insekata Metarhizium robertsii protiv patogena biljke graha Fusarium solanif. sp. phaseoli. Može. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]

10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii promovira rast kukuruza, potiskuje rast insekata i mijenja ekspresiju gena za odbranu biljaka. Biol. Kontrola 2020, 144, 104167. [CrossRef]

11. Chairin, T.; Petcharat, V. Indukcija odbrambenih reakcija u voću Hongkonga (Aglaia dookkoo Griff.) protiv gljivica truleži voća Metarhizium guizhouense. Biol. Kontrola 2017, 111, 40–44. [CrossRef]

12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Odgovor korijena Arachis hypogaea kikirikija na prisustvo korisnih i patogenih gljiva transkriptomskom analizom. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Poglavlje 11—Uloga gljivičnih elicitora u odbrambenom mehanizmu biljaka. U Molekularnim aspektima biljnih korisnih mikroba u poljoprivredi; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, SAD, 2020; str. 143–158. [CrossRef]

14. Dong, X.; Sa, JA Etilen i otpornost biljaka na bolesti. Curr. Opin. Plant Biol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]

15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Odvojeni putevi obrambenog odgovora zavisni od jasmonata i salicilata u Arabidopsisu su neophodni za otpornost na različite mikrobne patogene. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]

16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanine amonia liase (PAL) Promoviše antivirusnu odbranu protiv virusa mozaika Panicum i njegovih satelita. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]

17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Profil ekspresije PAL gena iz Astragalus membranaceus var. Mongholicus i njegova ključna uloga u fluksu u biosintezu flavonoida. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]

18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkripcijski strojevi u sekundarnom metabolizmu biljaka izazvanog jasmonatom. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]

19. Mirjalili, N.; Linden, JC Efekti sastava gasne faze na suspenzijske kulture Taxus cuspidata. Biotechnol. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]

20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Transkripcijski profil ćelija taxus chinensis kao odgovor na metil jasmonat. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]

21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, ​​PA; Dubery, IA Metabolomics izvedeni uvidi u manipulaciju sintezom terpenoida u ćelijama Centella asiatica pomoću metil jasmonata. Plant Biotechnol. Rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]

22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Efekti elicitacije na proizvodnju saponina u ćelijskoj kulturi Panax ginsenga. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]

23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Odbrambeni odgovori izazvani Elicitorom u Solanum lycopersicum protiv Ralstonia solanacearum. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francis, F.; Qiu, D. Protein elicitor PeaT1 pojačava otpornost na lisne uši (Sitobion avenae) u pšenici. Pest Manag. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]

25. Bujalowski, W. Proširivanje fiziološke uloge heksamerne DnaB helikaze. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]

26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Tri Aspergillus fumigatus CFEM-domena GPI-usidrena proteina (CfmA-C) utiču na stabilnost ćelijskog zida, ali ne igraju ulogu u virulenciji gljivica. Gljivične. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]

27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genom-Wide Identifikacija kandidata za efektor sa konzerviranim motivima iz gljive rđe pšeničnog lista Puccinia triticina. Front. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]

28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Bioinformatička analiza i funkcionalna karakterizacija CFEM proteina u gljivi antracnoze kukuruza Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agric. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]

29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; et al. Genom Laccaria bicolor pruža uvid u mikoriznu simbiozu. Nature 2008, 452, 88–92. [CrossRef]

30. Stefan, V.; Lara, RJ Entomopatogene gljive kao endofiti: interakcije biljaka-endofita i biljojeda i izgledi za upotrebu u biološkoj kontroli. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.

31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Bioinformatička analiza i funkcionalna karakterizacija CFEM proteina Metarhizium anisopliae. J. Fungi. 2022, 8, 661. [CrossRef]

32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; i Kanyuka, K. WAK-imunitet biljaka, bolesti koje nestaju. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]

33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Sistematske analize otkrivaju jedinstvenost i porijeklo CFEM domena u gljivama. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Novi efektorski gen SCRE2 doprinosi punoj virulenciji Ustilaginoidea virens na pirinač. Front. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]

35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, protein koji sadrži CFEM domen sa navodnim GPI-sidrenim mjestom, uključen je u patogenost, konidijalnu proizvodnju i toleranciju na stres kod Botrytis cinerea. Front. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]

36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Komparativna analiza na nivou genoma pretpostavljenih receptora vezanih za Pth11- G protein u gljivama koje pripadaju pezizomycotinu. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]

37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Sistematski doprinosi proteina koji sadrže CFEM domene akviziciji gvožđa su od suštinske važnosti za međuvrstnu interakciju filamentozne patogene gljive Beauveria bassiana. Environ. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]

38. Roy, U.; Kornitzer, D. Stjecanje heme-gvožđa u gljivama. Curr. Opin. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]

39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, član porodice proteina Rbt5, uključen je u iskorištavanje gvožđa iz ljudskog hemoglobina tokom rasta Candida albicans hyphal. FEMS Yeast Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]

40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Formiranje biofilma od strane mutanata Candida albicans za gene koji kodiraju gljivične proteine ​​koji pokazuju CFEM domen koji sadrži osam cisteina. FEMS Yeast Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]

41. Hogg, PJ Disulfidne veze kao prekidači za funkciju proteina. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]

42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Mutanti AVR4 patogena paradajza Cladosporium fulvum s poremećenom prirodnom disulfidnom vezom osjetljivi su na proteolizu, zaobilaze otpornost posredovanu Cf-4-, ali zadržavaju svoju sposobnost vezivanja hitina. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et al. Poboljšanje višestrukih agronomskih svojstava genom otpornosti na bolesti putem ojačanja ćelijskog zida. Nat. Biljke 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et al. Poremećaj gena velikih razmjera kod Magnaporthe oryzae identificira MC69, izlučeni protein potreban za infekciju gljivičnim patogenima jednosupnica i dvosupnica. PLoS Patog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]

45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. CFEM domena koja sadrži osam cisteina jedinstvena za grupu proteina gljivične membrane. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Sistemska identifikacija i funkcionalna karakterizacija čestih u gljivičnim ekstracelularnim membranskim proteinima u Lasiodiplodia theobromae. Front. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]

47. Bari, R.; Jones, JD Uloga biljnih hormona u odgovorima odbrane biljaka. Plant Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]

48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Regulacija odgovora na stres posredovana biljnim hormonima. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]

49. Javed, K.; Qiu, D. Protein elicitor PeBL1 Brevibacillus laterosporus povećava otpornost na Myzus persicae u paradajzu. Patogeni 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Molekularna i funkcionalna karakterizacija elicitora PeBC1 ekstrahiranog iz Botrytis cinerea uključenog u indukciju otpornosti na zelenu breskvinu lisnu uš (Myzus persicae) u grahu (Phaseolus vulgaris L.). Insekti 2019, 10, 35. [CrossRef]

51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Pretpostavljena uloga još nekarakteriziranog proteinskog elicitora PeBb1 Izveden iz Beauveria bassiana ARSEF 2860 soja protiv Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) u Brassica rapa ssp. pekinensis. Patogeni 2020, 9, 111. [CrossRef]

52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; et al. NPR1 modulira unakrsne razgovore između odbrambenih puteva ovisnih o salicilatu i jasmonatu kroz novu funkciju u citosolu. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [CrossRef]

53. Xin, XF; He, SY Pseudomonas syringae pv. paradajz DC3000: Model patogena za ispitivanje osjetljivosti bolesti i hormonske signalizacije u biljkama. Annu. Rev. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]

54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sun, Y.; Mou, Z. Podjedinica posredničkog kompleksa Arabidopsis16 pozitivno reguliše sistemsku stečenu rezistenciju posredovanu salicilatom i odbrambene puteve izazvane jasmonatom/etilenom. Plant Cell 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]

56. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Salicilna kiselina inhibira sintezu inhibitora proteinaze u listovima paradajza izazvanu sisteminom i jasmonskom kiselinom. Plant Physiol. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]

56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Umrežavanje hormona malih molekula u imunitetu biljaka. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]

57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Za indukciju biljnog defenzinskog gena u Arabidopsisu potrebna je istovremena aktivacija puteva odgovora jasmonata i etilena. Plant Cell 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]

58. Fang, W.; Bidochka, MJ Ekspresija gena uključenih u klijanje, konidiogenezu i patogenezu u Metarhizium anisopliae koristeći kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]

59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa Cellulose synthase gen ekspresija pod abiotskim stresom: Autostoperski vodič za normalizaciju RT-qPCR. PLOS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]

60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. A Verticillium dahliae pectate lyase inducira imunološki odgovor biljaka i doprinosi virulenciji. Front. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]

62. Livak, KJ; Schmittgen, TD Analiza relativnih podataka o ekspresiji gena korištenjem kvantitativne PCR u realnom vremenu i 2(-Delta Delta C(T)) metode. Metode 2001, 25, 402–408. [CrossRef]