Otkriće novih STING inhibitora zasnovanih na strukturi mišjeg STING agonista DMXAA
Nov 27, 2023
sažetak:
Protein stimulator gena interferona (STING) je uključen u urođeni imunitet. Lijek DMXAA (5,6-dimetilksantenon-4-sirćetna kiselina) pokazao se snažnim agonistom mišjeg uboda (mSTING), ali je imao mali učinak na ljudski ubod (hSTING). U ovom radu oslanjamo se na poređenje različitih kristalnih struktura i analizu odnosa protein-ligand kako bismo došli do hipoteze da dizajn lijeka DMXAA varijanti ima potencijal da pretvori STING agoniste u inhibitore. Na osnovu našeg prethodnog otkrića dva analoga DMXAA, 3 i 4 (oba bi se mogla vezati za STING), strukturno smo ih optimizirali i sintetizirali nove derivate, respektivno. U testovima vezivanja, otkrili smo da jedinjenja 11 i 27 predstavljaju STING veziva koja su bila superiorna u odnosu na originalne strukture i raspravljali smo o odnosima strukture i aktivnosti. Sva ciljna jedinjenja su bila neaktivna u ćelijskim testovima za skrining STING agonističke aktivnosti. Na zadovoljstvo, identifikovali smo 11 i 27 kao STING inhibitore sa mikromolarnom aktivnošću u oba hSTING i mSTING putevima. Osim toga, 11 i 27 inhibiraju indukciju interferona i inflamatornih citokina koje aktivira 20 3 0 -cGAMP bez očigledne citotoksičnosti. Ovi nalazi razbijaju kruto mišljenje da DMXAA pruža strukturnu osnovu specifično za agoniste STING-a i otvara više mogućnosti za razvoj novih agonista ili inhibitora STING-a.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Ključne riječi:
STING; DMXAA; selektivnost vrsta; STING agonist; STING inhibitor
1. Uvod
Stimulator interferon-gena (STING) je esencijalni signalni molekul za intrinzičnu imunost, prvenstveno posredujući prirodnim imunološkim odgovorima izazvanim citoplazmatskom DNK [1]. Kada DNK receptor ciklička gvanozin-adenozin fosfat sintaza (cGAS) otkrije intracelularnu dvolančanu DNK, cGAS katalizira sintezu 2 0,30 -cGAMP (slika 1), cikličkog dinukleotida (CDN) sposobnog direktnog vezivanja i aktiviranja STING-a na endoplazmatskom retikulumu [2–4]. Nakon aktivacije, STING formira agregate koji se regrutuju nizvodno do TANK-vezujuće kinaze 1 (TBK1) i vezuju regulatorni faktor 3 interferona (IRF3), koji fosforilira IRF3, aktivira IRF3 dimere u jezgru, inducira ekspresiju interferona tipa I (IFN) interferonski imuni odgovor [1]. Mnoga istraživanja su pokazala da je STING uključen u patogenezu višestrukih bolesti i da stimulacija STING-a izaziva efikasne imune odgovore na patogene infekcije i karcinome; međutim, neuspjeh u moduliranju kronične upalne signalizacije dovodi do autoimunih i upalnih bolesti [5-8]. Zbog fundamentalne uloge STING-a u regulaciji urođenog imuniteta, veliki broj timova je počeo da razvija STING agoniste ili inhibitore.
Slika 1. Reprezentativni STING modulatori
Istraživanja na STING agonistima prve generacije fokusirana su na strukturnu modifikaciju CDN analoga kako bi se zaobišla neka ograničenja endogenih CDN-a, kao što su slaba propusnost membrane i podložnost hidrolizi fosfatazama [9,10]. Mali molekul STING agonista 5,6-dimetilksantenon-4-sirćetne kiseline (DMXAA), koji je pokazao terapijsko obećanje protiv solidnih tumora na mišjim modelima, mogao bi suprotstaviti nedostatke CDN derivata [11]. Međutim, lijek nije uspio u kliničkim ispitivanjima na ljudima [12]. Dalje je potvrđeno da se DMXAA selektivno vezuje za mišji ubod (mSTING), a ne za ljudski ubod (hSTING) [13,14], što ometa terapeutski potencijal DMXAA kod ljudi. 10-Karboksimetil-9-akridinon (CMA) je još jedan reprezentativni mišji specifični STING agonist koji se koristio kao moćan induktor IFN tipa I za antivirusnu terapiju početkom 1970-ih [15]. Stoga je selektivnost vrsta vitalni faktor u razvoju malomolekularnih agonista STING-a. Neumorni napori istraživača, uključujući diABZI, SR717, MSA02, i druge [16–19].
cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem
Sve veći broj dokaza pokazuje da je hiperaktivacija STING-a povezana s autoinflamatornim i autoimunim bolestima. Neophodno je ograničiti prekomjernu aktivaciju STING signalnog puta, što naglašava potencijalnu vrijednost STING inhibitora. Za razliku od STING agonista, razvoj STING inhibitora je još uvijek u povojima, a nijedan kandidat za lijek još nije ušao u kliničke studije. Poznati STING inhibitori uključuju dvije vrste jedinjenja: kompetitivne antagoniste (SN-011 i Merck-18) i kovalentne inhibitore (H151) [20–22]. Ranije identifikovani kovalentni STING inhibitori interaguju sa Cys88/91 ili Cys91 koji se nalazi u N-terminalnom transmembranskom domenu STING-a izvan CDN-vezujućeg džepa [22]. Nedavno su dva tima sukcesivno prijavila dva strukturna tipa STING antagonista koji zauzimaju 20 3 0 -cGAMP vezni džep kako bi inhibirali aktivaciju 20 3 0 -cGAMP-a, što sugerira dvosjekli efekat u CDN-vezujućem džepu [20 ,21].
Ovdje nudimo novu perspektivu. Predlažemo da donji džep u kojem se nalaze DMXAA i CMA olakšava razvoj STING inhibitora na osnovu našeg dubokog istraživanja podataka i poređenja informacija o ko-kristalnoj strukturi identifikovanih STING proteina. Naša prethodna studija je objavila niz analoga CMA i DMXAA i identifikovala jedinjenja 3 i 4 koja se vezuju za hSTING, ali sa slabom ćelijskom potencijom [23] (Slika 2).
Slika 2. Hemijske strukture jedinjenja 3 i 4 sa podacima o njihovoj biološkoj aktivnosti. EC50 vrijednosti jedinjenja 1-4 mjerene su STING reporterskim ćelijama, a IC50 vezivanja mjerene su STING kompetitivnim setovima za vezivanje.
U ovom radu, u vezi sa dizajnom STING inhibitora za otkrivanje snažnijih vezivnih agenasa sa više kontakata u donjem džepu, izvršili smo strukturne optimizacije za 3 i 4, respektivno. Nakon toga, sproveli smo SAR studiju zasnovanu na testovima vezanosti za konkurenciju. U proceni bioaktivnosti, jedinjenja 11 i 27 delovala su kao veziva širokog spektra i pokazala su mikromolarne nivoe STING inhibitorne aktivnosti u više prijavljenih ćelija. Što se tiče strukture spajanja, dva molekula jedinjenja 11 drže hSTING u neaktivnoj "otvorenoj" konformaciji, na taj način kompetitivno inhibirajući endogeno 20 3 0 -vezivanje cGAMP-a, koje je slično kristalnoj strukturi Merck-a-18 i doking strukturi od SN-011 [20,21].
2. Rezultati
2.1. Strategija dizajna derivata DMXAA kao STING inhibitora
2.1.1. Identifikacija dizajniranih mjesta za STING inhibitore poređenjem različitih kristalnih struktura
Apo-protein STING domene za vezivanje liganda (LBD) kristalizirao se kao simetrični dimer u ne-ligandu, za koji je dokazano da nije uzrokovan gel filtracijom i analitičkom ultracentrifugiranjem [24–26]. STING dimer usvaja konformaciju nalik leptiru sa mestom vezivanja liganda pozicioniranim na interfejsu između dva monomera. Prvo, ovaj rad ispituje infrastrukturne i aktivacijske mehanizme proteina hSTING i mSTING, upoređujući razlike između njih, kao i otkriva neke intrigantne uvide. Za apo strukturu, prirodna konformacija oba proteina pokazuje da je mSTING koncentrisaniji od hSTING (slika 3). Shih et al. koristio je simulacije molekularne dinamike (MD) za proučavanje razlika između hSTING i mSTING, pokazujući da hSTING preferira otvorenu neaktivnu konformaciju, a mSTING preferira zatvoreno-aktivnu konformaciju čak i bez vezanog liganda [27].
Kada je vezan za 20,30 -cGAMP, konformaciona tranzicija hSTING-a je iz otvorenog (apo-protein, bočna udaljenost ~57 Å) u zatvoren (cGAMP-vezan protein, bočna udaljenost ~40 Å), dok je suprotan važi za mSTING (29 Å do 40 Å). Struktura apo-hSTING dramatično se razlikuje od strukture apo-mSTING, ali strukture STING kompleksa sa 20,30 -cGAMP se preklapaju. DMXAA, CMA i cGAMP su STING agonisti sa različitim strukturnim okvirima, ali njihove aktivacijske konformacije nakon vezivanja za mSTING proteine su takođe u suštini iste (Slika 3). Gore opisani scenariji svjedoče da su mehanizmi stimulacije hSTING-a i mSTING-a upadljivo divergentni; konformacije koje aktivira STING su, međutim, relativno konstantne, nezavisne od selektivnosti vrste i tipa kičme agonista (dok su ograničene na agoniste ŽBOKA koji dovode do konformacionih promena). Zapremine džepova za vezivanje različitih kristalnih kompleksa su generalno konvergentne (~300 Å3, tabela S1), što je dodatni dokaz stabilnosti konformacije aktivacije proteina STING.
Slika 3. Poređenje STING kristalnih struktura vezanih za apo i spojeve. Protein mSTING je pšenica (udaljenost testirana crvenom linijom), PDB kod: 4KC0 (apo), 4LOJ (vezan-cGAMP), 4LOL (vezan-DMXAA) i 4JC5 (vezan-CMA)
Drugo, na osnovu gornjih nalaza aktivacijske konformacijske stabilnosti, superponirali smo kokristalne strukture cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 i MSA02, koji su agonisti STING zatvorene konformacije, kako bismo istražili položaj različitih strukturnih agonista u STING mjesta za vezivanje proteina. Proteinski džep se može podijeliti u dva regiona: donji džep i gornji džep, prateći distribuciju STING agonista u proteinskom džepu (slika 4a). Osim što su mSTING agonisti DMXAA i CMA u potpunosti u donjem džepu, ostali agonisti bi mogli aktivirati hSTING put i ležati u gornjem dijelu. Zatim smo mapirali interakcije pet STING agonista sa aminokiselinskim ostacima vezanim za STING protein (unutar 5 Å od liganda; slika S1), pokazujući da primarne aminokiseline uključuju R238, Y167, R232, S162, T263 i T267 (mSTING odgovarajući redni broj ostataka minus jedan). Usklađivanje ostataka uzastopno sa džepovima pokazalo je da T267, T263 i S162 leže u donjem džepu; gornji džep sadrži R238, R232 i Y167 (slika 4b). Kako je objavljeno, R238, Y167 i R232 su esencijalni za vezivanje agonista za STING, posebno R238 (mSTING protein odgovara R237), čija bi mutacija rezultirala potpunim gubitkom stabilizacije (vezivanje liganda) [28–30]. Che et al. takođe je otkrio da ključ-ostatak R238 dominira u vezivanju DMXAA, a tačkaste mutacije (S162A/E260I) mogu poboljšati interakciju R238 sa DMXAA pomoću MD simulacija [31].
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity
【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Da bi zauzeli mSTING proteinski džep, DMXAA ili CMA su usvojili jedinstveni način vezivanja u kojem se dva agonista malih molekula vezuju za jedan homodimer mSTING. DMXAA se čvrsto postavljaju na donji džep vodoničnim vezama između keto grupe i bočnog lanca T266 (hSTING odgovara 267), dok karboksilatna grupa stupa u interakciju sa bočnim lancima R237 i T262 (slika 5a). Interakcija DMXAA sa R237 (jedinom ključnom amino kiselinom u gornjem džepu) je ključna za aktivnost mSTING-a. Detalj koji se često zanemaruje je da DMXAA može djelovati samo na R237 simetričnih monomernih proteina, na primjer, DMXAA (molekul A) koji utiče na R237B (slika 5a). Budući da se DMXAA nalazi na dnu, udaljenost između molekula A i R237B je 3,06 Å, dok je udaljenost do R237A veća od 5 Å (slika 5b). Koristeći kompaktniji džep mSTING proteina, DMXAA bez napora stupa u interakciju sa R237 simetričnog mSTING monomera, ali ne postoji način da se DMXAA poveže sa bilo kojim od R238 u konformaciono otvorenom apo-hSTING proteinu (slika 3). Dakle, džepni položaj DMXAA umanjuje stimulaciju hSTING puta. Nedavno je Merck, inspirisan odnosom vezivanja 2:1 DMXAA, otkrio STING antagoniste koji su sposobni da zauzmu džep za vezivanje [21]. Kristalni kompleks Merck 18 i hSTING proteina pokazuje da je jedinjenje uglavnom locirano ispod proteinskog džepa i da je u interakciji sa S162, T263 i T267, a svi oni odgovaraju svojstvima DMXAA (slika 5c). Iz ovoga su stvorene hipoteze: gornji džep je odlična šupljina za dizajniranje agonista STING-a; donji džep je pogodnije gnezdo za inhibitore, a struktura DMXAA ili CMA je optimizovana da ima potencijal da postane antagonist UBODA.
Slika 4. Podjela mjesta vezivanja STING i distribucija sa ključnim aminokiselinama. (a) Lokacija dva regiona u STING monomeru. Donji džep je u boji magenta, a gornji džep je zelen. PDB kodovi za kristalne komplekse koji se preklapaju su sljedeći: 4LOH (cGAMP, zelena), 6UKV (MSA-02, žuta), 6XNP (SR717, narandžasta), 4LOL (DMXAA, magenta) i 4JC5 (CMA, ljubičasta). (b) Raspodjela ključnih aminokiselina u gornjoj i donjoj regiji. Ostaci u donjem džepu su prikazani magenta, a zeleni su u gornjem delu.
Slika 5. Kristalni kompleksi DMXAA i Merck 18. (a) Intermolekularni kontakti u kompleksu DMXAA i mSTING. Vezani DMXAA je prikazan sivom bojom, sa pojedinačnim STING podjedinicama u simetričnom dimeru prikazanom zelenom i ljubičastom bojom. A i B superskripti označavaju proteinski monomer ili individualni identitet liganda. (b) Udaljenosti između ključnih ostataka R237A i R237B, respektivno, i DMXAA (molekula A). R237A prema karboksilu DMXAA je 6,02 Å, R237B prema karboksilu DMXAA je 3,06 Å. (c) Kristalna struktura Merck 18 vezanog za hSTING protein (PDB 6MXE) i detalji njegovih međumolekularnih kontakata. Vezani ligand je prikazan sivom bojom, sa pojedinačnim STING podjedinicama u simetričnom dimeru prikazanom zelenom i ljubičastom bojom. A i B superskripti označavaju proteinski monomer ili individualni identitet liganda
Slika 6. Osnova istraživanja i naše optimizirane vruće tačke za DMXAA i CMA derivate. (a) Superpozicija strukture DMXAA vezane za mSTING (PDB: 4LOL, prikazano kao tamnoplavo) sa strukturom DMXAA vezane za hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, prikazano narandžasto). (b) Detalji o DMXAA vezanom za mutirani hSTING (PDB: 4QXR). Isprekidani okviri predstavljaju potencijalna mjesta modifikacije. Amino ostaci prikazani zelenom bojom su mutirani ostaci (S162A/Q266I).
Otkrili smo da je nemogućnost DMXAA da aktivira hosting put povezana sa lokacijom DMXAA u donjem džepu (prema odjeljku 2.1.1), što nam je također dalo ideju dizajna STING inhibitora: povećanje kontakata derivata DMXAA sa donjom regijom kroz strukturne modifikacije kako bi se STING održao u neaktiviranoj konformaciji. S162 i Q266 leže na odgovarajući način na dnu mjesta vezivanja, tako da DMXAA mogu biti dobro pozicionirani u direktnom kontaktu s oba, olakšavajući istraživanje efekta aminokiselina donjeg džepa na ligande. Analiza odnosa strukture i aktivnosti (SARs) otkrila je da su 5,6-dimetil dio i metoksi na položaju C7- bili ključni za biološku aktivnost 3 i 4. Kao što je prikazano na slici 6b, 5 ,6-dimetil grupa stvorila je hidrofobne interakcije sa više aminokiselina u donjem džepu; zbog blizine C7 pozicije DMXAA aminokiselini Q266, odgovarajuća metoksi modifikacija je omogućila 3 i 4 da se vežu za hosting. Stoga su naše strukturne razrade pretpostavljale zaključavanje 5,6-dimetila i C7 metoksi, a dizajn novih derivata fokusiran na modificiranje polarne grupe na poziciji C1/C2 (utječe na S162) i promjenu grupe karboksilne kiseline ( proširenje strukturne raznolikosti). Dizajnirali smo i sintetizirali niz derivata koristeći spojeve 3 i 4 kao skele, čime smo potvrdili našu predloženu hipotezu o inhibitoru.
2.2. hemija
Priprema svih međuprodukta i ciljnih jedinjenja je prikazana u Šemi 1. 1-metoksi-2,3-dimetil-4-nitrobenzen (5) i 2-bromobenzojeva kiselina ( 7) bili komercijalno dostupni. U početku, 1-metoksi-2,3-dimetil-4-nitrobenzen je pretvoren u 4-metoksi- 2,3-dimetilanilin (6) putem redukcije željeznim prahom. Zatim su 6 i 7 podvrgnuti Ullmannovoj reakciji sa kalijum karbonatom uz katalizu bakra i bakar (I) oksida u N,N-dimetilformamidu da bi se dobio odgovarajući intermedijer 8. Intramolekularna reakcija kondenzacije 8 je izvedena sa Eatonovim reagensom da bi se dobio intermedijer 2-metoksi-3,4-dimetilakridin-9(10H)-on (9). Naknadna supstitucija 9 je izvedena sa etil bromoacetatom, a gubitak 1 ekviv. HBr dao je etil 2-(2-metoksi-3, 4-dimetil-9- oksoakridin-10(9H)-il)acetat (10). Konačno, etil acetat u 10 je hidrolizovan u karboksilnu kiselinu natrijum hidroksidom dajući 2-(2-metoksi-3,4- dimetil-9-oksoakridin-10 (9H)-il)sirćetna kiselina (11).
Šema 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. Eatonov reagens; d. BrCH2COOC2H5, NaH; e. NaOH; f. CCl3CH(OH)2, NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.
Za kasniju sintezu više ciljnih jedinjenja, prvo moramo sintetizirati jedinjenje 2-amino-5-metoksi-3,4-dimetilbenzojeva kiselina (14). 6 je reagovao sa hloral hidratom i hidroksilaminom, formirajući acetamid i hidroksiamino, sa intermedijerom (E)-2-(hidroksilamin)-N-(4-metoksi-2,3-dimetilfenil )acetamid (12). Naknadna Beckmannova reakcija preraspodjele hidroksiamino spoja 12 izvedena je sa sumpornom kiselinom kako bi se dobio derivat laktama 13. Konačno, intermedijer 13 je hidroliziran sa vodikovim peroksidom i natrijum hidroksidom u otopini etanola dajući 14. Koristeći 14 kao početni materijal za reakciju, mi smo dalje sintetizirao niz 8-metoksi-9,10-dimetil-6Hpirolo[3,2,1-de]akridina-1,6( Derivati 2H)-diona sa supstituentima na R1 i R2. U početku, 14 i 15-19 su bili podvrgnuti Ullmannovoj reakciji sa kalijum karbonatom uz katalizu bakra i bakar(I) oksida u N,N-dimetilformamidu da bi se dobili odgovarajući intermedijeri 20-24. Reakcije intramolekularne kondenzacije 20-24 izvedene su sa Eatonovim reagensom da se dobije 8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,{{46} }de]akridin-1,6(2H)-dionski derivati (25–29). Slično, koristeći 14 kao početni materijal za reakciju, dalje smo sintetizirali niz 7-metoksi-5,6-dimetil-9-okso-9,{{ 59}}dihidroakridin-4- derivati karboksilne kiseline sa supstituentima na R. U početku, 14 i 7 ili 30 su bili podvrgnuti Ullmannovoj reakciji sa kalijum karbonatom uz katalizu bakra i bakar(I) oksida u N,N-dimetilformamidu da se dobije odgovarajući intermedijari 31 i 32. Intramolekularne reakcije kondenzacije 31 i 32 izvedene su sa Eatonovim reagensom da se dobije 7-metoksi-5,6-dimetil-9-okso-9 ,10-dihidroakridin-4-derivati karboksilne kiseline (33,34). Stoga smo dizajnirali, sintetizirali i pregledali 16 analoga akridona, čije su strukture sažete u tabeli 1.
Tabela 1. Strukture novih analoga sadašnje studije.
2.3. Vezivanje potencijala novih spojeva za STING i njihove SAR-ove
Potencije vezivanja novih jedinjenja za STING i njihove SAR Da bismo direktno potvrdili efikasnost strukturne modifikacije, prvo smo pregledali sva sintetizovana jedinjenja pomoću cGAMP testova pomeranja. Pored selektivnosti vrsta, postoji pet varijanti STING koje su polimorfne kod ljudi, R232 (WT, 58% populacije), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%) i Q ( 2%) [32]. Stoga smo koristili komercijalne komplete za testiranje konkurencije pomoću tehnologije homogene vremenski razlučene fluorescencije (HTRF) da testiramo biohemijsku moć novih jedinjenja na mSTING i različitim hSTING izoformama (WT, H232 i AQ) i uporedili smo ih sa kontrolom. Kao što se očekivalo, sva kontrolna jedinjenja 1-4 vezana su za mSTING; sa hSTING ekrana, jedinjenja 3 i 4 su imala IC50 vrednosti na mikromolarnom nivou.
Tabela 2. Rezultati jedinjenja sa različitim hSTING izoformama i testovima kompetitivnog vezivanja mSTING.
Prvo, na osnovu spoja 3, atom halogena ili metoksi grupa je uveden na C1/C2 mjesto (Tabela 1). Jedinjenje 27, kao optimalni derivat jedinjenja 3 (C1 pozicija supstituisana sa F), ima bolju ukupnu aktivnost od jedinjenja 3 (jednocifrena mikromolarna aktivnost u svim biohemijskim testovima, tabela 2). R1-modifikovano jedinjenje 25 ima efekat vezivanja širokog spektra, ali nije tako aktivno kao F-supstituisana ili nesupstituisana verzija. U poređenju sa jedinjenjem 3, jedinjenja (26, 28 i 29) sa uvedenom grupom na C2-mjestu su pokazala različite stepene smanjenja afiniteta vezivanja, posebno jedinjenje 29. Drugo, zadržavanje kičme jedinjenja 4 i zamjena atoma halogena naspram C1/C2 mesta, dobili smo jedinjenja 35–38 (tabela 1). Ova jedinjenja su bila neaktivna u sva četiri testa pomeranja pri koncentracijama do 100 µM, pokazujući da se supstitucija sa atomom halogena na mestu C1/C2 ne toleriše. Zatim smo acetatnu grupu na spoju 4 pretvorili u karboksilnu grupu (33) i uveli metoksi na mjesto C2 (34). Nažalost, ova promjena je bila neuspješna jer su oba spoja ostala neaktivna. Učeći iz našeg neuspjeha, dalje smo istraživali SAR-ove derivata jedinjenja 4 tako što smo pomjerili acetatnu grupu na N poziciju i ostavili C1/C2 pozicije nepromijenjene. Jedinjenje 11 pokazuje vezivanje za širok spektar STING varijanti, sve sa IC50 ispod 20 µM; aktivnost je superiornija od jedinjenja 4 i uporediva sa jedinjenjem 27. Osim toga, jedinjenje 9 (bez karboksilne grupe na N mestu) i jedinjenje 10 (N-acetat etil) su sintetički prekursori jedinjenja 11 koji se ne mogu vezati za STING, što indirektno pokazuje važnost grupe karboksilne kiseline.
2.4. Cellular Biological Evaluation
2.4.1. In vitro skrining novih analoga sa STING Agonističkim aktivnostima
Sistematski smo testirali sva jedinjenja na aktivnost agonista STING-a koristeći 293T hSTING-WT, 293T-mSTING i THP1-KO-STING reporterske ćelijske linije (obavlja Invivo Gen). Koristeći ćelije 293T-hSTING-R232 i ćelije 293T-mSTING, pokazali smo aktivaciju IRF puta kao indirektnu meru indukcije IFN tipa I praćenjem aktivnosti sekretorne embrionalne alkalne fosfataze (SEAP), doprinoseći našem istraživanju selektivnosti vrsta spojeva. THP1-KO-STING ćelije su generisane iz THP1-Dual ćelija stabilnim nokautom STING gena, a koristili smo THP1-KO-STING ćelije da potvrdimo da li jedinjenje pokazuje funkciju STING zavisne indukcije citokina. Uporedili smo aktivnosti STING agonista svih ciljanih derivata sa onima referentnih agonista za mišji (DMXAA) i ljudski (20,30 -cGAMP) STING. Iznenađujuće, nijedno od sintetiziranih spojeva nije moglo aktivirati ni hSTING ni mSTING puteve (maksimalna koncentracija na 200 µM), što je ozbiljno u suprotnosti s rezultatima testova vezivanja. Stoga, naši testirani STING vezivni agensi mogu imati potencijalne obrasce vezivanja kao novi STING antagonisti.
2.4.2. In vitro skrining STING veziva sa STING inhibitornim aktivnostima
Prvo smo uradili pre-eksperimente: sa 1 µM kovalentnim inhibitorom H151 kao pozitivnom referencom, istražili smo njegove inhibitorne nivoe u mSTING i hSTING reporterskim ćelijskim linijama koje su zajedno kultivisane sa različitim koncentracijama 20 3 0 -cGAMP-a kako bismo odredili optimalne uslove za skrining inhibitora (pogledajte odeljak 4.2.3 za detalje o protokolu). Drugo, inicijalno smo testirali inhibitornu moć novih spojeva tretiranjem pre-eksperimentalnim metodama u koncentraciji od 100 µM. Otkrili smo da su jedinjenja 11 i 27 koja se vezuju za STING širokog spektra pokazala odličnu inhibiciju u mišjim i ljudskim STING reporterskim ćelijama, pri čemu jedinjenja 3 i 4 i druga jedinjenja nisu bila tako efikasna. Treće, postavili smo gradijente koncentracije za spojeve 11 i 27 da bismo testirali obje vrijednosti IC50 i uporedili ih sa H151. Jedinjenja 11 i 27 bila su aktivna u mikromolarnim koncentracijama inhibirajući 20 3 0 -cGAMP-indukovanu ekspresiju IFN-a u oba hSTING i mSTING putevima.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Sa IC50 vrijednostima, jedinjenje 11 (hSTING 19,93 µM i mSTING 15,47 µM) nadmašilo je jedinjenje 27 (hSTING 38,75 µM i mSTING 30,81 µM) (Slika 7a). Za poređenje, IC50 vrijednosti H-151 u 293T-hSTING i 293T-mSTING ćelijama bile su 1,04 i 0,82 µM (slika 7a), što ukazuje da kovalentni inhibitor H-151 pokazuje bolji inhibitorni efekat na STING -zavisna signalizacija u testovima baziranim na ćelijama. Da bismo dodatno potvrdili inhibitorno svojstvo jedinjenja 11 i 27, upotrijebili smo drugu THP-1 reportersku ćelijsku liniju ljudskih monocita THP1-Dual-hSTING-R232, koja koristi sistem dvostrukog reportera za izvještavanje o IRF aktivaciji kao indirektna mjera indukcije IFN tipa I i aktivacije NF-κB kao indirektne mjere indukcije proinflamatornih citokina. Nakon stimulacije THP-1 reporterske ćelijske linije sa 20,30 -cGAMP, dodali smo STING inhibitore odgovarajućih koncentracija za inhibiciju indukcije I IFN-a i proinflamatornog citokina. Kao što se i očekivalo, jedinjenja 11, 27 i H151 značajno inhibiraju STING aktivirane IRF i NF-κB puteve aktivacije (Slika 7b). Pored toga, da bismo isključili efekat citotoksičnosti jedinjenja na inhibitornu aktivnost, koristili smo komplet CellTiter-Glo za ispitivanje ćelijske aktivnosti. Zadovoljstvo je da jedinjenja 11 i 27 nisu pokazala dokaze citotoksičnosti na 293T i THP-1 ćelije testom vitalnosti ćelija kada su dodana u koncentracijama (5 do 100 µM) koje inhibiraju STING, za razliku od H151, koji je već pokazao značajnu citotoksičnost kod 10 µM (slika 7c). Ove studije su identifikovale jedinjenja 11 i 27 kao umerene STING inhibitore, narušavajući osetljivost vrsta i inhibirajući IRF i NF-κB dvostruke puteve bez očigledne citotoksičnosti.
2.5. Pristajanjem je istražena strukturna osnova djelovanja spoja 11
Mehanizam kompetitivnih STING antagonista je da zauzmu mesto vezivanja i poremete aktivacionu konformaciju STING proteina [20,21]. Specifično za hSTING, antagonisti ostavljaju hSTING dimer u "otvorenoj" konformaciji. Koristili smo Glide docking da bismo odredili interakciju između ljudskog STING CTD (PDB ID kod 6MXE) i najboljeg aktivnog jedinjenja 11. U strukturi pristajanja, dva jedinjenja 11 su delimično paralelna jedno drugom i leže na dnu rascepa hSTING dimer (Slika 8a), zaključavajući hSTING u neaktivnoj otvorenoj konformaciji (Slika S2). Jedinjenje 11 proizvodi uglavnom hidrofobne interakcije, sa tricikličkom strukturom liganda koja omogućava veći kontakt sa interfejsom u donjem džepu. Kao i kod DMXAA ili CMA, karboksilna grupa formira vodoničnu vezu sa bočnim lancem T263, dok keto grupa formira vodoničnu vezu sa bočnim lancem T267. Metoksi na poziciji C2 usko je u interakciji sa S162, što rezultira blizinom ligand-ligand jedan prema drugom. Bis-metil supstituenti ne samo da stvaraju interakcije ligand-ligand, već su i pogodno locirani na ulazu u gornji džep, što sprečava vezivanje prirodnih agonista STING-a za ključne ostatke (slika 8b).
Slika 7. STING-veziva širokog spektra 11 i 27 su STING antagonisti. (a) Hemijske strukture jedinjenja 11 i 27 i inhibitorna aktivnost STING inhibitora prema putevima m- i h-STING. 293T ćelije (mSTING ili hSTING), prethodno tretirane različitim koncentracijama jedinjenja, stimulisane su 20,30 -cGAMP; inhibicija aktivnosti IRF puta indirektno je mjerena vrijednostima optičke gustine (OD). Inhibicijska kriva zavisna od doze je postavljena za izračunavanje IC50 jedinjenja. (b) Jedinjenja 11 i 27 mogu inhibirati aktivaciju hSTING dvostrukih puteva. THP1-hSTING-R232 reporterske ćelijske linije su stimulirane sa 20,30 -cGAMP i tretirane jedinjenjima, inhibirajući indukciju IFN-a (procjena aktivnosti prema relativnim svjetlosnim jedinicama (RLU) Lucia luciferaze ) i indukcija proinflamatornih citokina (praćenje aktivnosti SEAP-a mjereno OD vrijednostima). (c) Novi analozi pokazuju nisku citotoksičnost u poređenju sa kovalentnim inhibitorom. 293T (ili THP-1 ćelije) su inkubirane sa naznačenom koncentracijom inhibitora za naznačene vremenske periode. Vijabilnost ćelija je merena CellTiter-Glo kompletima. Prikazani podaci su srednji iz tri nezavisna eksperimenta. NS (neznačajno) p > 0,05, *** p < 0,001. p vrijednosti su izračunate dvostranim t-testom.
Slika 8. Docking struktura jedinjenja 11 vezanog za STING protein. (a) Način vezivanja jedinjenja 11. Vezani ligand je prikazan sivom bojom, sa pojedinačnim STING podjedinicama u simetričnom dimeru prikazanom zelenom i ljubičastom bojom. U džepovima za vezivanje STING monomera donji deo je magenta boje, a gornji je zelen. (b) Intermolekularni kontakti jedinjenja 11 su vezani za STING. Spoj 11 i kontaktirane STING aminokiseline prikazani su kao model štapića. Intermolekularni kontakti i vodikove veze prikazani su žutom isprekidanom linijom. A i B superskripti označavaju proteinski monomer ili individualni identitet liganda.
3. Diskusija
U svetlu opsežnih izveštaja o mehanizmu i kristalnoj strukturi STING-a, imamo priliku da objasnimo naučni problem zašto DMXAA ne poseduje humanu STING agonističku aktivnost. U ovoj studiji, poređenjem različitih STING kristalnih struktura, dobili smo nekoliko zanimljivih nalaza: 1. STING aktivaciona konformacija je stabilna; 2. Postoje različiti mehanizmi aktivacije za hSTING i mSTING; 3. DMXAA i CMA se nalaze na dnu vezivnog mesta što ih razlikuje od drugih agonista. S obzirom na različite mehanizme aktivacije mSTING-a i hSTING-a, mSTING agonisti DMXAA ili CMA smješteni u donjem džepu ne mogu izvršiti aktivaciju u hSTING-u jer apo-hSTING ima veću vezujuću šupljinu koja sprječava da se ligand poveže sa R238.
Gao et al. objavili su da pojedinačne mutacije (G230I, S162A i Q266I) daju hSTING istom DMXAA osjetljivošću kao mSTING [33]. MD simulacije su otkrile da je bočni lanac mutacije regije kapaka G230I dovoljan da formira steričku barijeru da spriječi izlučivanje DMXAA, dok DMXAA lako izlazi u hSTING WT [27]. Na osnovu strukturne modifikacije koja odgovara tačkastim mutacijama hSTING (S162A/Q266I) na mestu vezivanja, dostupni su značajni analozi DMXAA i CMA, ali ne i moćni hSTING agonisti. Razlog za ovo bi mogao biti taj što suptilna strukturna nesklad između "prirodnih" i "mutiranih" hSTING-a može igrati ključnu ulogu u procesu prepoznavanja. Kroz MD simulacije, Che et al. otkrili su da neprirodno mutirani hSTING remete koordinirano kretanje molekula vode i mijenjaju količinu vode koja se izbaci nakon vezivanja liganda, što je pogodnije za obnavljanje DMXAA aktivacije hSTING-a [31].
Ohrabreni istraživanjem otkrića STING inhibitora na donjem mestu vezivanja [21], usuđujemo se da zamislimo da DMXAA, koji se nalazi u istoj regiji, ima potencijal da se transformiše u nove STING inhibitore. U prethodnoj studiji, spojili smo strukture DMXAA i CMA sa suptilnim strukturnim modifikacijama i uspješno otkrili 3 i 4 koji bi se mogli vezati za hSTING, ali njihova slaba STING agonistička aktivnost ne odgovara njihovoj moći vezivanja. U ovom radu, ideja dizajna je da se dodatno poboljša kontakt DMXAA analoga sa donjim džepom kako bi se kompetitivno oduprli vezivanju 20,30 -cGAMP, tako da smo dizajnirali i sintetizirali optimizirane strukture jedinjenja 3 i 4.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Prvi korak skrininga bio je testiranje biohemijske aktivnosti pomoću kompleta za vezivanje višestrukih STING varijanti kako bi se okarakterisala moć vezivanja novih derivata. Rezultati testova vezivanja dokazali su ispravnost naših smjernica dizajna; identifikovali smo 11 i 27 kao STING veziva širokog spektra (superiorne u odnosu na 3 i 4) i razgovarali o SAR-ovima. Za analoge jedinjenja 3, modifikacije na poziciji C1 značajno su poboljšale vezivanje za različite STING varijante, dok C2-modifikovana jedinjenja nisu imala efekta. Međutim, jedinjenje 4 nije bilo dobro tolerirano za strukturne modifikacije u C1/C2. Nakon premeštanja položaja karboksilne kiseline (C4 u N), pronašli smo bolje STING vezivo 11 i utvrdili da je grupa karboksilne kiseline neophodna za aktivnost. Zatim smo testirali sva jedinjenja na aktivnost na ćelijskom nivou koristeći tri reporterske ćelijske linije, i nijedno od ciljnih jedinjenja nije bilo aktivno. Zatim smo uspostavili metodu skrininga za STING inhibitore i ponovo pregledali sve nove analoge. STING vezivni agensi 11 i 27 su pokazali mikromolarne inhibitorne aktivnosti, sa podacima uporedivim sa testom kompetitivnog vezivanja. Kovalentni inhibitor H151 pokazao je nešto bolju STING inhibitornu aktivnost od 11 i 27 in vitro. Osim toga, dodatno smo potvrdili da 11 i 27 mogu efikasno inhibirati 20,30 -cGAMP-indukovanu aktivaciju STING dvostrukih puteva. Najimpresivnije, 11 i 27 održavaju visok nivo vitalnosti ćelija pri visokim koncentracijama, što nije moguće sa H151. Citotoksičnost je čest problem kod kovalentnih inhibitora i ograničava primjenu H151.
Docking analizom stekli smo uvid u strukturnu osnovu aktivnosti najbolje aktivne supstance 11. Jedinjenje 11 savršeno zauzima donji džep, držeći hSTING u neaktivnoj otvorenoj konformaciji i na taj način kompetitivno inhibirajući 20,30 -cGAMP vezivanje. Struktura tricikličkog prstena akridina ključna je za stvaranje hidrofobnih interakcija, s grupom karboksilne kiseline i ketonskim dijelom koji učvršćuju spoj na dnu džepa. Nagađamo da metoksi proizvodi intimne asocijacije sa S162, povlačeći konformaciju proteina marginalno zatvorenom, ali ne dovoljno da je pretvori u agonističku konformaciju. Bis-metil struktura stvara prostorno blokiranje mjesta koje pojačava interakcije ligand-ligand i odvraća od ulaska agonista u gornji džep. Trenutno nema prijavljenih ko-kristalnih struktura antagonista mSTING i STING, tako da ne možemo objasniti mehanizam djelovanja jedinjenja 11 sa mSTING koristeći pristup pristajanja. Međutim, pretpostavljamo da postoje dvije mogućnosti: jedna je da je princip djelovanja identičan onom kod hSTING-a; drugi je da jedinjenje 11 drži mSTING u agregiranijoj apo konformaciji, a 20,30 -cGAMP ne može ući u džep da bi izvršio agonistički efekat. Ukratko, naše suptilne strukturne optimizacije slabijih STING agonista uspješno su preokrenule biološku funkciju otkrivanja STING inhibitora. Ovi nalazi ilustruju složenost veznih džepova za STING i pružaju nova istraživačka saznanja za razvoj lijekova agonista ili inhibitora STING-a.
4. Materijali i metode
4.1. hemija
Rastvarači i reagensi korišteni u sintezi su nabavljeni od Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Peking, Kina). Strukture proizvoda su identifikovane 1H i 13C-NMR spektroskopijom (JNM-ECA-400, Japan). Molekularne težine proizvoda mjerene su masenom spektrometrijom visoke rezolucije (HRMS) sa elektrosprej jonizacijom (ESI) kao načinom jonizacije (Agilent 1260-G6230A, Njemačka). NMR i maseni spektri jedinjenja dati su u Dodatnim materijalima. Jedinjenja 35–38 smo sintetizirali i identificirali; molimo pogledajte prethodno objavljen članak za detalje [23].
Etil {{0}}(2-metoksi-3,4-dimetil-9-oksoakridin-10 (9H)-il)acetat (1{ {25}}): U rastvor 4-metoksi{{10}},3-dimetilanilina (6) (0.97 g, 6.4 mmol) i 2-bromo-benzojeva kiselina (7) (1,29 g, 6,4 mmol) u DMF (6 mL) na sobnoj temperaturi, naknadno smo dodali Cu u prahu (0.05 g), Cu2O ({{60}}.05 g) i K2CO3 ({{186}}.71 g, 5,1 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na 110 ◦C tokom 12 h. Nakon uklanjanja rastvarača pod vakuumom, ostatak je otopljen u 1 N rastvoru NaOH (25 mL). Sirovi proizvod je dobijen taloženjem nakon zakiseljavanja filtrata sa konc. HCl. Nakon sušenja, sirovi proizvod je dodat u Eatonov reagens (5 mL) na sobnoj temperaturi, a zatim je smeša zagrevana na 90 ◦C tokom 1 h. Ohlađena reakciona smeša je ukapana u zasićeni vodeni rastvor NaHC03. Talog je filtriran da bi se prikupio grubi proizvod. Prečišćavanje ostatka hromatografijom na koloni silika gela dalo je 9, blijedožutu čvrstu supstancu (0,61 g, prinos 37,7%). Rastvor NaH (1,43 mmol) i 9 (0,33 g, 1,3 mmol) u DMF (5 mL) na sobnoj temperaturi je mešan 1 h, a zatim ohlađen na 5–7 ◦C. Etil bromoacetat (0,43 g, 2,6 mmol) je dodat u rezultujuću smešu i neprekidno mešan na sobnoj temperaturi tokom 20 h. Nakon završetka reakcije (TLC), reakciona smeša je izlivena u ledenu vodu (15 mL). Nastali precipitati su filtrirani, osušeni i zatim ekstrahovani hloroformom. Isparavanje rastvarača dalo je sirovi estar koji je prečišćen rekristalizacijom da se dobije 10, žuta čvrsta supstanca (0,33 g, 76% prinos). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,30 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,75–7,67 (m , 1H), 7,57–7,50 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 4,22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H) , 2,77 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,21 (t, J=7.1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 169.25, 157.87, 155.96, 147.46, 146.72, 135.46, 132.15, 130.17, 128.2, 128.5, 130.17, 128.25. 119.46, 95.26, 72.06, 61.28, 56.06, 14.59 , 14.34, 13.77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C20H21NO4: 339,3910 pronađeno: 340,1546. 2-(2-metoksi-3,4-dimetil-9-oksoakridin-10(9H)-il)octena kiselina (11): rastvor 10 (0,37 g, 1,1 mmol) i NaOH (0,05 g, 1,3 mmol) u etanolu (20 mL) i vodi (2 mL) zagrevani su na 60 ◦C 1 h. Nakon uklanjanja rastvarača, nastali ostatak je otopljen u vodi i filtriran. Nakon neutralizacije filtrata konc. HCl, smeša je filtrirana da bi se dobila sirova čvrsta supstanca, zatim rekristalizovana metanolom da bi se dobio 11, blijedo žuti prah (0,29 g, 85,7% prinos). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 10,51 (s, 1H), 8,33 (d, J=6,9 Hz, 1H), 8,04 (d, J=8,5 Hz, 1H ), 7,69 (s, 1H), 7,67–7,62 (m, 1H), 7,45 (t, J=6,8 Hz, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 159.04, 155.63, 147.47, 146.64, 134.86, 131.52, 129.56, 128.98, 128.98, 1216.21, 1216.21. 101.77, 96.02, 74.81, 55.69, 14.42, 13.33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H17NO4: 311,3370 pronađeno: 312,1229.
{{0}}kloro-8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo [3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dion (25): U rastvor 6-karboksi-4-metoksi-2,3-dimetilbenzenaminija (14) (1,3 g, 6,4 mmol) i 2-(2-bromo-4-klorofenil)sirćetne kiseline (15) (1,6 g, 6,4 mmol) u DMF (6 mL) na sobnoj temperaturi, naknadno smo dodali Cu u prahu (0.05 g), Cu2O (0.05 g) i K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na 110 ◦C tokom 12 h. Nakon uklanjanja rastvarača pod vakuumom, ostatak je otopljen u 1 N rastvoru NaOH (25 mL). Sirovi proizvod je dobijen taloženjem nakon zakiseljavanja filtrata sa konc. HCl. Nakon sušenja, sirovi proizvod je dodat u Eatonov reagens (5 mL) na sobnoj temperaturi, a zatim je smeša zagrevana na 90 ◦C tokom 1 h. Ohlađena reakciona smeša je ukapana u zasićeni vodeni rastvor NaHC03. Talog je filtriran da bi se prikupio grubi proizvod. Prečišćavanjem ostatka hromatografijom na koloni silika gela dobije se 25, žuta čvrsta supstanca (0,80 g, prinos 38,6%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.17 (d, J =8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J=6.9 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H14ClNO3: 327,7640 pronađeno: 328,0734. 4-hloro-8-metoksi-9, 10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dion (26): Sinteza ovog jedinjenja bila je slična 25. 15 je zamijenjen sa 2-(2-bromo-5-hlorofenil)sirćetnom kiselinom (16). Dobili smo 0,82 g 26 kao blijedožutu čvrstu supstancu sa prinosom od 38,7%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 7,73 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,64 (s, 2H), 2,36 (s, 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H14ClNO3: 327,7640 pronađeno: 328,0734.
{{0}}fluoro-8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dion (27): Sinteza ovog jedinjenja bila je slična 25. 15 je zamijenjen sa 2-(2-bromo-4-fluorofenil)sirćetnom kiselinom (17). Dobili smo tamno žutu čvrstu supstancu 27 sa 0,84 g (42,1% prinos). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.21 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.23 (d, J {{39} },5 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H14FNO3: 311,3124 pronađeno: 312,1030. 4-fluoro-8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dion (28): Sinteza ovog jedinjenja bila je slična 25. 15 je zamijenjen sa 2-(2-bromo-5-fluorofenil)sirćetnom kiselinom (18). Dobijeno je 0,81 g tamno žute čvrste supstance (prinos 40,5%). 1H NMR (400 MHz, DMSOD6) δ 7.86 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H14FNO3: 311,3124 pronađeno: 312,1030.
4,8-dimetoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin-1,6(2H )-dion (29): Sinteza ovog jedinjenja bila je slična 25. 15 je zamijenjeno sa 2-(2-bromo-5-metoksifenil) sirćetnom kiselinom (19). {{20}}.73 g žute čvrste supstance je dobijeno sa prinosom od 35,2%. 1H NMR (400 MHz, DMSO D6) δ 7,93 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 ( s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C19H17NO4: 323,3480 pronađeno: 324,1230. 7-metoksi-5,6-dimetil-9-okso-9,10-dihidroakridin-4-karboksilna kiselina (33): U rastvor 6-karboksi-4-metoksi-2,3-dimetilbenzenaminijuma (14) (1,30 g, 6,4 mmol) i 2-brom-benzojeve kiseline (7) (1,29 g, 6,4 mmol) u DMF (6 mL) na sobnoj temperaturi, naknadno smo dodali Cu u prahu (0,05 g), Cu2O (0,05 g) i K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na 110 ◦C tokom 12 h. Nakon uklanjanja rastvarača pod vakuumom, ostatak je otopljen u 1 N rastvoru NaOH (25 mL). Sirovi proizvod je dobijen taloženjem nakon zakiseljavanja filtrata sa konc. HCl. Nakon sušenja, sirovi proizvod je dodat u Eatonov reagens (5 mL) na sobnoj temperaturi, a zatim je smeša zagrevana na 90 ◦C tokom 1 h. Ohlađena reakciona smeša je ukapana u zasićeni vodeni rastvor NaHC03. Talog je filtriran da bi se prikupio grubi proizvod. Prečišćavanje ostatka hromatografijom na koloni silika gela dalo je 33, blijedožutu čvrstu supstancu (1.00 g, prinos 52,7%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 13,00 (s, 1H), 10,28 (s, 1H), 8,01 (d, J=9,7 Hz, 1H), 7,69 (d , J=8.5 Hz, 1H), 7.48 (t, J=9.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 3.67 (s, 3H), 2.32 (s, 3H ), 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C17H15NO4: 297,3100 pronađeno: 298,1073. 2,7-dimetoksi-5,6-dimetil-9-okso-9,10-dihidroakridin-4-karboksilna kiselina (34): sinteza ovog jedinjenja bila je slična 33. 7 je zamijenjena 2-bromo-5- metoksibenzojevom kiselinom (30). Žuta čvrsta supstanca je dala 1,05 g sa prinosom od 50,2%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12,96 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H17NO5: 327,3360 pronađeno: 328,1179.
4.2. Biološki test
Kompleti za vezivanje miša STING, kompleti za vezivanje humanog STING WT, kompleti za vezivanje AQ STING za ljude i kompleti za vezivanje humanog H232 STING kupljeni su od Cisbio-a. 293T mSTING (ISG/KI-IFNb) ćelije, 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb) ćelije, THP1-KI-hSTING-R232 ćelije, THP1-KO-STING ćelije su kupljene od Invivogen. 293T mSTING ćelije i 293T hSTING-R232 ćelije su uzgajane upotrebom DMEM (Gibco, Waltham, MA, USA), 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), 4,5 g/L glukoze (Sigma- Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocina (Invivogen, San Diego, CA, SAD) i dopunjen selektivnim antibioticima (Invivogen ) blasticidin (10 µM), higromicin (100 µM) i zeocin (100 µM). THP1-KO-STING ćelije i THP1-KI-hSTING-R232 ćelije su uzgajane pomoću RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES-a (Sigma-Aldrich), 10% toplotno inaktivirani FBS (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen) i dopunjen sa selektivnim antibioticima (Invivogen) blasticidinom ( 10 µM) i zeocin (100 µM). QUANTI-Blue rješenje, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP su kupljeni od Invivogena. H151 je nabavljen od Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Peking, Kina). CellTiter-Glo luminescentni komplet za ispitivanje vitalnosti ćelija dobijen je od Promega.
4.2.1. HTRF STING Binding Competitive Assay
Prema uputama STING kompleta za vezivanje, sljedeće otopine su sukcesivno dodavane u svaku jažicu u 384-jažicu ploče: 5 µL jedinjenja za detekciju ili 2 0,30 -cGAMP (pozitivna kontrola ) sa različitim koncentracijama ili razblaživačem (negativna kontrola); 5 µL humanog STING 6His-označenog proteina (u pufer za detekciju je dodat negativan kontrolni bunar); 10 µL STING liganda d2 i Anti 6His-Tb3+ prethodno pomiješanog radnog rastvora. Nakon zatvaranja ploče i inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 3 h, očitane su vrijednosti fluorescencije na 665 nm i 620 nm. Omjer dva intenziteta fluorescencije (665 nm/620 nm) korišten je za procjenu potencijala vezivanja jedinjenja. Vrijednosti IC50 (50% inhibitorne koncentracije) su izračunate korištenjem softvera GraphPad Prism.
4.2.2. Ćelijski test za skrining jedinjenja za agonističku aktivnost
Količine od 180 µL 293T mSTING ćelija, 293T hSTING-R232 ćelija i THP1-KOSTING suspenzije ćelija su raspoređene u 96-ploče ravnog dna sa gustinom od ~50,000 ćelija /bunar (293T) ili ~100,000 ćelija/bunarić (THP1). Dodata je količina od 20 µL fiziološkog rastvora ili fiziološkog rastvora test jedinjenja, ili 20,30 -cGAMP kao pozitivne reference, a ćelije su inkubirane na 37 ◦C sa 5% CO2 tokom 48 h. Nakon toga, količina od 20 µL supernatanta je dodana u ploču s ravnim dnom 96- bunarčića, a zatim 180 µL QUANTI-Blue rastvora u svaku jažicu. Ploča je inkubirana na 37 ◦C 3 h, a nivoi SEAP-a (aktivnost IRF puta) su određeni spektrofotometrom na 620–655 nm.
4.2.3. Ćelijski test za skrining jedinjenja na inhibitornu aktivnost
Pre-eksperiment: 180 µL 293T mSTING ćelija, 293T hSTING-R232 ćelija (~50,000 ćelija/jažicu) stimulirano je 48 h na 37 ◦C u 5% CO2 inkubator sa 10 µL 20,30 -cGAMP (3,125 µM, 6,25 µM) i 10 µL H151 (1.0 µM ). Nakon toga, količina od 20 µL supernatanta je dodana u ploču s ravnim dnom 96- bunarčića, a zatim 180 µL QUANTI-Blue otopine u svaku jažicu. Ploča je inkubirana na 37 ◦C 3 h, a nivoi SEAP-a (aktivnost IRF puta) su određeni spektrofotometrom na 620–655 nm. 180 µL suspenzije 293T mSTING ćelija, 293T hSTING-R232 ćelija je raspoređeno u 96-ploče ravnog dna sa gustinom od ~50,000 ćelija/bunariću. Količina od 10 µL 2 0,30 -cGAMP (3.125 µM) i jedinjenja 11 ili jedinjenja 27 (0.78 µM, 1.56 µM, 3.13 µM, 6.25 µM, 12.5 µM, 12.5 µM, 5µM, 5µM µM) ili H151 (0,08 µM, 0,16 µM, 0,31 µM, 0,63 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM) su dodani, a ćelije su inkubirane na 37 ◦ 8 µC h. Nakon toga, količina od 20 µL supernatanta je dodana u ploču s ravnim dnom 96- bunarčića, a zatim 180 µL QUANTI-Blue rastvora u svaku jažicu. Ploča je inkubirana na 37 ◦C 3 h, a nivoi SEAP-a (aktivnost IRF puta) su određeni spektrofotometrom na 620–655 nm. IC50 vrijednosti su izračunate pomoću softvera GraphPad.
4.2.4. Ćelijski test za inhibiciju STING Dual Pathways
180 µL THP1-KI-hSTING-R232 suspenzije ćelija je raspoređeno u 96-ploče ravnog dna sa gustinom od ~100,000 ćelija/bunariću. Dodata je količina od 10 µL 20,30 -cGAMP i 10 µL jedinjenja 11 (20 µM) ili jedinjenja 27 (33 µM) ili H151 (2 µM), a ćelije su inkubirane na 37 ◦C sa 5% CO2 24 h. Nakon toga, količina supernatanta je dodana u 96-bijelu (prozirnu) ploču, nakon čega je u svaku jažicu dodana otopina QUANTI-Luc ili QUANTI-Blue, a nivoi luminiscencije ili SEAP nivoi su očitani prema uputstvima proizvođača. Ovo omogućava istovremeno proučavanje puta regulatornog faktora IFN (IRF), procjenom aktivnosti Lucia luciferaze i NF-κB puta, praćenjem aktivnosti SEAP-a.
4.2.5. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
Vijabilnost ćelija je merena CellTiter-Glo luminescentnim kompletom za ispitivanje vitalnosti ćelija prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ćelije su inkubirane sa tri različite koncentracije (5 µM, 10 µM, 100 µM) jedinjenja 11, jedinjenja 27, ili H-151 tokom 48 sati. 100 µL CellTiter-Glo reagensa je dodano u 96-opitnu ploču u trajanju od 10 minuta, a zatim je zabilježena luminiscencija.
4.3. Molekularno spajanje jedinjenja 11
Kristalna struktura STING kompleksa (PDB ID: 6MXE) preuzeta je iz unosa u Protein Data Bank i korištena kao početna tačka. Protein je pripremljen korištenjem proteinskog preparata Maestro i podijeljen na lanac A i lanac B. Generirali smo mjesto vezivanja u LBD monomera STING na osnovu originalnog liganda (Merck-18) korištenjem Receptor Grid Generation. Koristili smo SP preciznost Glide-dockinga za dio molekularnog spajanja, omogućavajući spoju 11 da stvori najviše 20 poza. Na kraju smo proizveli 16 vezanih konformacija (sve u donjem džepu) i testirali vezujuće slobodnu energiju kompleksa koristeći Prime MM-GBSA modul u Schrödingerovom softveru. Nadalje, na osnovu rezultata pristajanja, rezultata modela klizanja i MMGBSA dG Bind rezultata, odabrali smo optimalnu konformaciju koja je bila prva u dvije i rangirana kao treća u jednom (vidjeti u Tabeli S2). Konačno, spojili smo najbolje konformacije A i B lanaca kako bismo dobili potpunu strukturu pristajanja.
Reference
1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING Prepoznavanje citoplazmatske DNK podstiče staničnu odbranu. Mol. Cell 2013, 50, 5–15. [CrossRef]
2. Wu, J.; Sun, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ Cyclic GMP-AMP je endogeni drugi glasnik u urođenoj imunološkoj signalizaciji putem citosolne DNK. Science 2013, 339, 826–830. [CrossRef]
3. Abe, T.; Barber, GN Indukcija proinflamatornog gena posredovana citosolnom DNK, STING-ovisna, zahtijeva kanonsku aktivaciju NF-κB preko TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [CrossRef]
4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ cGAS-cGAMP-STING put citosolne DNK senzora i signalizacije. Mol. Cell 2014, 54, 289–296. [CrossRef] [PubMed]
5. Gao, D.; Li, T.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ Aktivacija cikličke GMP-AMP sintaze vlastitom DNK uzrokuje autoimune bolesti. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]
6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, PJSR Antitumorska aktivnost cGAMP-a putem stimulacije cGAS-cGAMP-STING-IRF3 posredovanog urođenog imunološkog odgovora. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]
7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA DNK sensing putem cGAS-STING puta u zdravlju i bolesti. Nat. Rev. Genet. 2019, 20, 657–674. [CrossRef]
8. Zhang, H.; Ti, QD; Xu, XL Stimulator ciljanja interferonskih gena (STING): perspektiva medicinske hemije. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785–3816. [CrossRef]
9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X.; Jiang, Z. Identifikacija i karakterizacija fosfodiesteraza koje specifično razgrađuju 30 3 0 -ciklički GMP-AMP. Cell Res. 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]
10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubenski, TW; Gajewski, TF Domaćin STING put na sučelju raka i imuniteta. J. Clin. Investig. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]
11. Baguley, BC; Ching, LM DMXAA: Antivaskularni agens sa višestrukim odgovorima domaćina. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 54, 1503–1511. [CrossRef]
12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, I.; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Fan, X.; et al. Randomizirana faza III placebom kontrolirano ispitivanje karboplatina i paklitaksela sa ili bez vaskularnog ometajućeg agensa Vadimezan (ASA404) u uznapredovalom karcinomu pluća ne-malih ćelija. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [CrossRef]
13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Ratinam, VAK; Monks, B.; Jin, T.; Xiao, TS; et al. Miš, ali ne i ljudski ubod, vezuje se i signalizira kao odgovor na vaskularni ometajući agens 5,6-dimetilksantenon-4-sirćetnu kiselinu. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]
14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, TJ Antikancerogeni flavonoidi su mišje-selektivni agonisti uboda. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]
15. Cavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. Specifična detekcija antivirusnog jedinjenja malih molekula CMA pomoću STING-a. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [CrossRef]
16. Ramanjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Dizajn agonista STING receptora amido benzimidazola sa sistemskom aktivnošću. Nature 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]
17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; et al. Antitumorska aktivnost sistemskog STING-aktivirajućeg nenukleotidnog mimetika cGAMP. Science 2020, 369, 993–999.
18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Cash, B.; et al. Oralno dostupan nenukleotidni STING agonist s antitumorskim djelovanjem. Nauka 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]
19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andrew, L.; Iris, A.; Rebecca, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP karakterizacija novog agonista uboda specifičnog za ljude koji izaziva antivirusnu aktivnost protiv alfa virusa u nastajanju. PloS Patog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]
20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Sun, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. STING inhibitori ciljaju na džep za vezivanje cikličkog dinukleotida. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]
21. Siu, T.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Hatch, H.; Ho, T.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. Otkriće novog cGAMP kompetitivnog liganda neaktivnog oblika STING. ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]
22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. Ciljanje STING sa kovalentnim inhibitorima malih molekula. Nature 2018, 559, 269–273. [CrossRef]
23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Sun, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Dizajn, sinteza i biološka evaluacija analoga akridona kao novih agonista STING receptora. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]
24. Ouyang, S.; Song, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; et al. Strukturna analiza STING adapterskog proteina otkriva sučelje hidrofobnog dimera i način cikličkog vezivanja di-GMP. Imunitet 2012, 36, 1073–1086. [CrossRef] [PubMed]
25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. Struktura STING-a vezanog za ciklički di-GMP otkriva mehanizam cikličkog prepoznavanja dinukleotida od strane imunološkog sistema. Nat. Struktura. Mol. Biol. 2012, 19, 722–724. [CrossRef]
26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. Strukturna osnova za otkrivanje i vezivanje cikličkog di-GMP od strane STING-a. Nat. Struktura. Mol. Biol. 2012, 19, 728–730. [CrossRef]
27. Shih, AY; Damm-Ganamet, KL; Mirzadegan, T. Dinamičke strukturne razlike između ljudskog i mišjeg uboda dovode do različite osjetljivosti na DMXAA. Biophys. J. 2018, 114, 32–39. [CrossRef]
28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Šuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. Strukturno-funkcionalna analiza STING aktivacije pomoću c[G(20,50 )pA(30,50 )p] i ciljanja antivirusnim DMXAA. Cell 2013, 154, 748–762. [CrossRef] [PubMed]
29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Strukturna osnova STING vezivanja i fosforilacije pomoću TBK1. Nature 2019, 567, 394–398. [CrossRef]
30. Vavrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Protein-ligand interakcije u STING vezivnom mjestu ispitane racionalno dizajniranim jednostrukim mutacijama: eksperiment i teorija. Biochemistry 2021, 60, 607–620. [CrossRef] [PubMed]
31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; Long, ZR; Ye, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Pojedinačne mutacije preoblikuju strukturnu korelacionu mrežu DMXAA-ljudskog STING kompleksa. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]
32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE Senzor urođene imunološke DNK cGAS proizvodi nekanonski ciklični dinukleotid koji aktivira ljudski ubod. Cell Rep. 2013, 3, 1355–1361. [CrossRef] [PubMed]
33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; Zamene Patel, DJ Binding-Pocket i Lid-Region čine ljudski STING osetljivim na lek DMXAA specifičan za vrstu. Cell Rep. 2014, 8, 1668–1676. [CrossRef] [PubMed]
34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Dizajn, sinteza i biološka evaluacija C7-funkcionalizovanih derivata DMXAA kao potencijalnih agonista humanog STING-a. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]
