Centralna uloga transformirajućeg faktora rasta (TGF-) u razvoju renalne fibroze
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
DIO Ⅰ: Uloga humanog primarnog bubrežnog fibroblasta u TGF- 1-uređajima koji oponašaju fibrozu
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee i dr.
1. Uvod
Bubrežna fibroza, posljednji uobičajeni put bezbrojnih progresivnih bolesti bubrega, karakterizira povećanje proizvodnje proteina ekstracelularnog matriksa (ECM), smanjenje degradacije matriksa, disfunkcija interakcije stanica-matriks, transformacija rezidentnih stanica i infiltracija inflamatornih stanica.Transformirajući faktor rasta-(TGF-) je multifunkcionalni dimerni peptid koji reguliše biološke procese kao što su proliferacija ćelija, diferencijacija i imunološki odgovori [1]. Među brojnim fibrogenim faktorima, TGF- (Transformirajući faktor rasta-) igra centralnu ulogu i djeluje protuupalno. TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)- deficijentni miševi umiru od masivne upale. Transgeni miševi koji prekomjerno eksprimiraju TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)su praktički zaštićeni od razvoja bubrežne fibrozne patologije, uglavnom zbog svog protuupalnog djelovanja [2]. Profibrotička i protuupalna svojstva TGF-a(Transformirajući faktor rasta-)su mač sa dvije oštrice u pogledu terapeutske primjene TGF-a(Transformirajući faktor rasta-)inhibicija. Učinjeni su izuzetni napori da se opstruira TGF-(Transformirajući faktor rasta-)radnja koja sprečava napredovanjebubrežnifibroza[3]. Iako su mnogi pristupi korišteni u borbibubrežnifibroza, eksperimentalni model za procjenu trenutno dostupnih lijekova nije idealan.
cistanche herb spriječitibubrežne bolesti
Općenito, studije na životinjama igraju ključnu ulogu u pretkliničkim testovima u predviđanju farmakokinetike i efikasnosti lijekova. Međutim, postoje različite razlike između životinja i ljudi, što nas navodi da sumnjamo u tačnost testova efikasnosti i bezbednosti lekova zasnovanih na životinjama 4. Prethodni izveštaji su zavisili od pretkliničkih studija na životinjama tokom razvoja leka kako bi se procenila nefrotoksičnost i bezbednost lekova. Funkcionisanje bubrega kod životinja je više nego dvostruko bolje nego kod ljudskih bubrega. Stoga se lijekovi brže metaboliziraju kod životinja nego kod ljudi, što otežava razjašnjavanje rezultata testova toksičnosti lijekova pomoću studija na životinjama. Nadalje, rezultati eksperimenata na životinjama ne mogu se koristiti za predviđanje odgovora na lijekove kod ljudi, jer životinje imaju različite fiziološke funkcije. Na bazi životinjafibroza bubregamodeli imaju poteškoća u reprodukciji čovjekafibroza bubrega; stoga su istraživanja u toku kako bi se prevazišle trenutne prepreke i optimizirale platforme za otkrivanje lijekova [5].
Organ-on-a-chip (OoC) tehnologija se pojavila kao novi koncept za rješavanje ovih problema. Ova platforma je dizajnirana s obzirom na trenutne nedostatke, a pokazala je veliko obećanje u području nefrologije [6]. Osim toga, OoC modeli imaju veliki potencijal kao zamjena za eksperimentalne životinjske modele, pružaju rješenje za razlike među vrstama i mogu pomoći u okončanju okrutnosti životinja i etičkih debata [7]. Malo je in vitro modela koji istovremeno koriste primarne bubrežne fibroblaste s endotelnim i epitelnim stanicama, koje su važne stanice ububregfibroza. Uloga svake ćelije ufibrozaproučava se odvojeno; međutim, postoji ograničeno znanje o interakciji ćelija.
U ovoj studiji smo razvilifibroza-imitiraju uređaje koji koriste ljudske primarne fibroblaste. Potvrdili smo da je TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman ima različite efekte nafibroza bubregamodel. Posebno, fibroblasti igraju ključnu ulogu kao efektorske ćelije, promovišu formiranje profibrotičnog mikrookruženja i luče faktore rasta i citokine. Stoga, na osnovu ove nove metode, fibroblasti mogu pružiti idealan sistem ćelijskog modela za proučavanje bubrežne bolesti. Procijenili smo da li fibroblasti uzrokovani fibroznom bubrežnom bolešću utječu na integritet ćelija kultiviranih u tri dimenzije (3D). Na kraju, predstavljamo studiju dokaza o principu koja pokazuje potencijal čovjekafibroza bubrega- imitirajući uređaji kao model za predviđanje odgovora na čovjekafibroza bubrega.
efekti cistanchea: liječiti infekciju bubrega
2. Rezultati
2.1. Identifikacija alfa aktina glatkih mišića (a-SMA) i keratina-8(KRT-8) od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)u HK-2 ćelijama
U ranoj fazi ispitivali smo poznate markerefibrozai citoskelet u dvodimenzionalnim (2D) kulturama. Imunofluorescentni testovi bojenja su izvedeni da bi se procijenila ekspresija -SMA kod fibroze i tubularnog epitelnog u mezenhimalni prijelaz (EMT) markera i nivoa KRT8 kao markera citoskeleta. Imunofluorescentno bojenje je pokazalo da je ekspresija -SMA prvobitno bila slaba i da su nivoi KRT8 visoki u monoslojnim HK{6}} epitelnim ćelijama. Nije bilo značajne promjene u intenzitetu fluorescencije od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(5 ng/mL) ili tretman specifičnim inhibitorom HK-2 epitelnih ćelija tokom 24 h (Slika 1).
Slika 1. Imunofluorescencija pokazuje da je ekspresija alfa-SMA i keratina-8(KRT8) održavana tretmanom TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili inhibitor u HK-2 ćelijama.(A) Ekspresija alfa-SMA i (B)CCK-8 nije imala efekta na HK-2ćelije od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(5 ng/mL) ili inhibitor. Ćelije su prvobitno bile postavljene u gustinu od 1×10 stepeni po jažici (ac)netretirane kontrole i (df) stimulirane sa 5ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-) ili (gi) 10 μM inhibitor (SB431542) tokom 24 h i fiksiran sa 4 posto paraformaldehida. Ćelije su zatim obojene anti- -SMA i anti-citokeratinom-8 tokom 20 minuta. Izvršeno je zajedničko bojenje Hoechst bojom H33342 za identifikaciju ćelijskih jezgara. Skalirane trake u mikrografijama označavaju 200 um.
cistanche prah poboljšava rad bubrega
2.2. Ekspresija KRT8 smanjena za TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)na čipu
Zatim smo procijenili nivoe ekspresije -SMA i KRT8 u 3D kultivisanom HK-2 i ukupnu dužinu endotelnih ćelija GFP-umbilikalne vene (HUVEC) tretiranih TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)i specifični inhibitor. Da bismo to postigli, prvo smo uspostavili uzorak tkivnog čipa koji se sastoji od dva tipa ćelija, HK-2 epitelnih ćelija i GFP-HUVEC. Nakon potvrde konstrukcije, izložili smo čip tkiva sa TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(5 ng/mL) ili specifični inhibitor (10 um SB431542) tokom 24 h.
Kao što je prikazano na slici 2A-C, TGF- 1 nije posebno promijenio izraz -SMA(Transformirajući faktor rasta-)ili tretman specifičnim inhibitorima. Međutim, ekspresija KRT8 je smanjena u dvoćelijskom tipu kokultivisanog čipa. Štaviše, dodavanje inhibitora TGF-ß1 povećalo je ekspresiju KRT8.
Ispitivali smo formiranje 3D tubularne kapilarne mreže od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman u HUVECs, jer endotelne ćelije mogu spontano formirati 3D tubularnu kapilarnu mrežu. U skladu sa našim kulturnim uslovima, formiranje debelih linija je značajno smanjeno. Međutim, tanke linije poput kapilara bile su povećane u TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretirani GFP-HUVEC. U slučaju TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman inhibitorom na 3D kultivisanom čipu, ukupna dužina debelih i debelih linija pokazala je obrnutu tendenciju prema TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman. Uočeno je povećanje dužine debele linije u odnosu na netretiranu kontrolnu grupu. Sličan obrazac je uočen u prečniku debele linije u GFP-HUVEC nakon TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman i tretman inhibitorima. Prečnik GFP-HUVEC-a je potisnut od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman, ali povećan bez obzira na debljinu linije od strane inhibitora u poređenju i sa kontrolom i TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-). Ukupna dužina i prečnik debele linije su dramatično povećani tretmanom TGF- 1 inhibitorom u poređenju sa netretiranom kontrolom i TGF- 1 tretmanom. Primjetno, dobiveni rezultati ukazuju na povećanu gustinu sitnih žila u TGF-u.(Transformirajući faktor rasta-)-liječenu grupu u poređenju sa njihovim neliječenim kolegama. Nasuprot tome, gustina debelih krvnih sudova u TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretirana grupa je bila niža od one u neliječenoj kontrolnoj grupi (Slika 2D, E).
Slika 2. Ekspresija KRT8 u HK-2 i ukupna dužina i promjer HUVEC-a.(A) Imunofluorescencija pokazuje da je ekspresija -SMA zadržana i da je ekspresija KRT8 dramatično smanjena tretmanom TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)u HK-2. Ćelije su postavljene na pločice i stimulirane sa 5ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili 10 μm inhibitor (SB 431542) tokom 24 h i fiksiran sa 4 posto paraformaldehida. Ćelije su obojene anti- -SMA i anti-citokeratinom-8 tokom 20 minuta. Izvršeno je zajedničko bojenje Hoechst bojom H33342 za identifikaciju ćelijskih jezgara. Ekspresija -SMA(ac) nije bila promijenjena, ali KRT8(df) u HK-2 ćelijama i GFP u HUVEC (gi) ekspresiji su značajno promijenjeni od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(5 ng/mL) i inhibitor (B, C). U ukupnoj dužini HUVEC-a, tanka posuda je povećana, ali debela je smanjena za TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-). Promjer je povećan i kod tankih i debelih posuda. Ovi rezultati su poništeni inhibitorom SB431542 (D, E). Skalirane trake na mikrografijama pokazuju 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
za šta se koristi cistanche: lečenje hroničnih bolesti bubrega
2.3. TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)Utječe na tri tipa ćelija čipa sa strukturom s više odjeljaka
Za proučavanje TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)na odgovore predloženog 3D čipa, izvršili smo imunobojenje svakog odjeljka posebno (slika 3). U ovoj analizi korišteni su primarni humani bubrežni fibroblasti. Uzorci su analizirani pomoću FACS-a i potvrđeno je da su pozitivni na antitijelo markera fibroblasta. Nakon inkubacije tri tipa ćelija sa TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tokom 24 h obavljeno je imunološko bojenje da bi se procijenila ekspresija -SMA i KRT8. Ekspresija a-SMA je pojačana TGF-1 tretmanom, a suprotni rezultati su uočeni sa TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman inhibitorima. S druge strane, ekspresija KRT8 je smanjena od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)i pokazao suprotan odgovor na TGF-(Transformirajući faktor rasta-)inhibitora (Slika 4A-C).
Slika 3. Slika uzorka sa šematskim prikazom uređaja za proizvodnju i eksperimentalni raspored.(A) Gornje dvije slike prikazuju raspored. Lijeva slika prikazuje ukupnu sliku uređaja odozgo prema dolje. Donje slike prikazuju poprečni presjek. Shematski prikaz s detaljima dimenzija vodilica za tekućinu. (B) Ova slika opisuje eksperimentalne rasporede zafibroza- imitirajući uređaji. Proces punjenja u četiri koraka za svaki bunar. Lokacija svakog područja uzorkovanja hidrogela, kao i postavljanje medija u odozgo prema dolje i izometrijski poprečni presjek. (1) Ukupno 1,5 uL hidrogela 1 se spontano vodi u centralni kanal. (2) Centralni kanal je ispunjen sa 5 uL hidrogela. (3) Ukupno 10 uL hidrogela 3 je naslikano na dnu rezervoara. （4）Dozira se ukupno 200 μL medija. Crvena skala bar=9 mm.
Kao što je prikazano na slici 4D-G, dužina tanke linije nalik na kapilaru značajno je povećana za TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman u GFP-HUVEC. Međutim, debljina debele linije je smanjena u TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretirani HUVEC. Promjer je smanjen u prosjeku za tanke i debele posude u HUVEC-ima. U slučaju TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman inhibitorom na 3D kultivisanom čipu, ukupna dužina debelih i debelih linija pokazala je suprotan trend od tretmana TGF- 1. Dalje, dužina debele linije je povećana u poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom.
Slika 4. Promjena 3D kultiviranih HK-2 i HUVEC sa primarnim bubrežnim fibroblastima.Ukupne ćelije su postavljene u gustini od 5×10 stepeni po 3D čipu i stimulirane sa 5 ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili 10 μm inhibitor (SB 431542) tokom 24 h i fiksiran sa 4 posto paraformaldehida. (A) Ćelije u 3D čipu su obojene anti-o-SMA i anti-citokeratinom-8. Ekspresija -SMA (ac) je povećana, a ekspresija KRT8(df) je značajno smanjena za TGF- 1(5 ng/mL). Ukupna dužina HUVEC-a; tanke žile su dramatično povećane, a debele smanjene TGF-ß1(Transformirajući faktor rasta-)（D, E). Promjer je smanjen za tanke i debele posude (F, G). Ovi rezultati su poništeni inhibitorom SB431542. Skalirane trake na mikrografijama označavaju 100 μm.*str<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Modulira medijator upale i faktore rasta
Zatim smo istraživali upalne citokine i faktore rasta u supernatantu; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(Transformirajući faktor rasta-)i TGF- 3(Transformirajući faktor rasta-)lučenje proteina je bilo dramatično veće u 3D kultivisanim čipovima nego u dobro kultivisanim 2D fibroblastima, iako su imali isti ukupan broj ćelija. Međutim, TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-) nivoi su bili slični, jer su 2D ili 3D kultivisani modeli tretirani sličnim koncentracijama TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(Slika 5A-E). Konkretno, oslobađanje FGF-2 iz ljudskih primarnih bubrežnih fibroblasta bilo je 20.9 ± 0.4 pg/dan/5×10 stepeni ćelija 2D jednoslojne kulture i 3094,8±0,2 pg/dan/5×10 stepeni ćelija uključujući HUVEC i HK-2 3D kultivisanog čipa u netretiranoj kontroli. Lučenje FGF-2 od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)stimulacija je bila 31.0±0.2pg/dan/5×10 stepen ćelija za 2D kulturu i 3683,9±0,8 pg/dan/5×10 stepeni ćelija za 3D -kultivisani čips. Ovo povećanje proizvodnje FGF-2 proteina u 2D jednoslojnoj kulturi bilo je uporedo sa povećanjem 3D-kultivisanog čip modela od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman (Slika 5B).
Slika 5. Poređenje 2D i 3D modela kultiviranih kao platforme za oponašanje bubrežne fibroze.Ćelije su postavljene u gustini od 5×10 stepeni po 2D jažici ili 3D čipu i stimulirane sa 5ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili 10 um inhibitor (SB 431542) tokom 24 h. Primarni humani bubrežni fibroblasti korišteni su u 2D kultivisanom i u 3D modelu uzgojenom. Fibroblasti su korišćeni u gustini od 8×10* kultivisani sa HUVECs i HK-2. Primarni ljudski renalni fibroblast-HUVEC omjer, ili F:H odnos, bio je 1:5 za procjenufibroza.HK-2 ćelije su korištene pri gustini od 2×104. Detekcija (A)IL-1,(B)baznog faktora rasta fibroblasta (FGF-2) i (CE)TGF-beta 1, 2 i 3 u supernatantu izvršena je multipleksnom analizom citokine i multipleksni imunotest. Svaka traka predstavlja srednju vrijednost± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Transformirajući faktor rasta-).
cistanche tubolosa prednosti: liječenje bolesti bubrega
Nadalje, procijenili smo ekspresiju mRNA proinflamatornih citokina kao što su IL-1, IL-6, IL-8 i TNF-. Rezultati su značajno smanjeni rekombinantnim ljudskim TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman u 3D kultivisanom čipu kao protuupalno svojstvo TGF-a(Transformirajući faktor rasta-). Otkrili smo da je ekspresija mRNA povećana pomoću TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)inhibitor (SB431542). Nadalje, ekspresija IL-6, IL-8 i TNF- posredovana inhibitorima bila je specifično smanjena u poređenju sa netretiranom kontrolom (Slika 6A-D). Nivo mRNA VEGF-a, fibroznog faktora, značajno je povećan TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman. Nivo mRNA VEGF smanjen je inhibitorom TGF- 1 (slika 6E), dok je ekspresija mRNA IL-10 sa antifibrotskim efektom smanjena u fibrotičnim stanjima izazvanim TGF- 1 . Nasuprot tome, ekspresija I-10mRNA je povećana tretmanom TGF- 1inhibitorom (slika 6F).
Slika 6. PCR u realnom vremenu pokazuje ukupnu ekspresiju mRNA 3D čipa.Ćelije su postavljene na gustinu od 5×10 stepeni po 3D čipu i stimulirane sa 5 ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili 10 um inhibitor (SB431542) za 24h. Ukupna RNK ekstrahirana iz 3D kultivisanog čipa. Ekspresija mRNA za (A)IL-1,(B)TNF-,(C)IL-6 i (D)IL-8 predstavlja protuupalni efekat TGF{ {10}}(Transformirajući faktor rasta-)tretman. Povećana je ekspresija (E)VEGF kao angiogenog faktora. Ekspresija (F)IL-10 kao antifibroznog faktora je značajno smanjena od strane TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Transformirajući faktor rasta-).
