Anti-apoptoza podocita i pro-apoptoza mezangijalnih ćelija za Telmisartan u ublažavanju dijabetičke ozljede bubrega

SAŽETAK

Oštećenje podocita i ekspanzija mezangijalnih ćelija dvije su važne patološke manifestacije glomerularne ozljede u ranom dijabetesu. Telmisartan, kao inhibitor receptora angiotenzina tipa 1 (AT1), mogao bi poboljšati produkciju kraja glikacije (AGE) ili ozljedu podocita izazvanu angiotenzinom Ⅱ (Ang Ⅱ), uključujući odvajanje ili apoptozu. U ovom tekućem radu prvo smo potvrdili zaštitni učinak telmisartana na ranu dijabetičku ozljedu bubrega kod pacova sa dijabetesom tipa 1. Telmisartan je smanjio gubitak podocina i inhibirao ekspresiju -SMA, odražavajući njegov zaštitni efekat na povredu podocita i mezangijalnu proliferaciju, respektivno. Što je još zanimljivije, uočili smo suprotan efekat telmisartana na vitalnost ćelija i apoptozu podocita i mezangijalnih ćelija u okruženju sa visokim sadržajem glukoze in vitro. Anti-apoptotički efekat telmisartana na podocite može biti povezan sa njegovom inhibicijom ekspresije swiprosina-1 (proteina koji može posredovati visokom glukozom indukovanom apoptozom podocita). Dok je telmisartan inducirao visoku ekspresiju PPAR u mezangijalnim ćelijama, a GW9662 (antagonist PPAR) je delimično inhibirao apoptozu izazvanu telmisartanom i smanjio vitalnost mezangijalnih ćelija. Pored toga, ekspresija PKC 1/TGF 1 indukovane glukozom u mezangijalnim ćelijama može biti blokirana telmisartanom. Ovi podaci pružaju precizniji ćelijski mehanizam za otkrivanje zaštitnog efekta telmisartana kod dijabetičke ozljede bubrega.

KLJUČNE RIJEČI

dijabetička bolest bubrega, podociti (MeSH: D050199), mezangijalne ćelije, telmisartan (PubChem CID: 65, apoptoza

Kliknite ovdje za kupovinu Cistanche proizvoda

UVOD

Dijabetička bolest bubrega (DKD), dobro poznata kao kronična bolest bubrega uzrokovana dijabetesom melitusom (DM) tipa 1 ili 2 (Podgórski et al., 2019.), može pogoršati brzinu glomerularne filtracije (GFR) progresivno se smanjuje, a zatim se na kraju razvija do kraja -stadijum bubrežne bolesti (Hou et al., 2018; Ruiz-Ortega et al., 2020; Ekspertska grupa Kineskog društva za nefrologiju, 2021). Postoje dva mehanizma u kojima hiperglikemija posreduje preko povrede podocita bubrega i promjena bazalne membrane glomerula (GBM) izazvanih ekspanzijom ili proliferacijom mezangijalnih ćelija (Anders i sur., 2018).

Podociti su specijalizirane visceralne epitelne stanice, koje oblažu vanjski sloj GBM-a, čiji se procesi stopala interdigitiraju stvarajući krajnju barijeru za sprječavanje gubitka proteina u urinu (Podgórski et al., 2019.). Broj i/ili gustina svakog glomerula je proučavan kod pacijenata sa DM (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Povreda podocita doprinosi gubitku njihovih adhezivnih svojstava i glavni je uzrok razvoja DKD (Podgórski et al., 2019). Još jedna značajna karakteristika podocita je da su zreli podociti ograničene proliferativne ćelije (Podgórski et al., 2019.), (Griffin et al., 2003.). Gubitak podocita dovodi do proliferacije mezangijalnih ćelija, međutim, značajniji gubici dovode do glomerularne fibroze i povećane proteinurije kao naknadne denudacije GBM (Fukuda et al., 2012). Loša kontrola glikemije rezultira podocitopatijom (Anders et al., 2018), morfološkim promjenama koje karakterizira hipertrofija podocita, epitelno-mezenhimalna transdiferencijacija podocita (Chang et al., 2017), odvajanje podocita (Zhang et al., 2020 aptosis). Wang et al., 2018a) i gubitak podocita, koji dovode do progresivnih aberacija podocita, rezultiraju odvajanjem GBM-a s posljedičnom glomerulosklerozom.

Mesangijalne ćelije imaju značajan uticaj ne samo na prilagođavanje glomerularne i intraglomerularne cirkulacije već i na očuvanje glomerula, kao što je odbrana glomerularnih endotelnih ćelija i odliv supstanci iz seruma i tečnosti iz mikrožila (Wakisaka et al., 2021). Zadebljani GBM i prošireni mezangijal su uočljiva glomerularna oštećenja kod dijabetesa (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). GBM zadebljanje je rana histopatološka u DKD i na njega utiču aberantni prihod i varijacija ekstracelularnog matriksa koji luče endotelne ćelije i podociti (Anders et al., 2018). Hiperglikemija pobuđuje mezangijalne ćelije na proliferaciju i proizvodnju matriksa (Kriz et al., 2017.) putem aktivacije transformirajućeg faktora rasta (TGF), što direktno uzrokuje transkripcijsku aktivaciju matriksnih kolagena (Ziyadeh et al., 2000.) što dovodi do ekspanzije mezangijala. matrica.

Rana intervencija sa hipoglikemijskom i antihipertenzivnom terapijom je korisna za odlaganje pojave i razvoja DKD (Martins i Norris, 2001). Inhibitor enzima koji konvertuje angiotenzin (ACEI) ili blokator angiotenzinskih receptora (ARB) je posebno preporučen kod odraslih osoba sa DM i albuminurijom (Liew et al., 2020). Blokada renin-angiotenzin sistema poboljšava ekspresiju ANGPTL2 i integrina koji održavaju glomerularnu barijeru (Tawfik et al., 2021). Razlog zašto je odabran telmisartan je taj što je opisan kao efikasniji od drugih ARB lijekova u ublažavanju proteinurije (Naruse et al., 2019; Guo et al., 2020). Štaviše, telmisartan može smanjiti nefrotoksičnost izazvanu cisplatinom, kao što je apoptoza podocita i nivoi ekspresije proteina povezane sa autofagijom (Malik et al., 2015). Fascinantno, telmisartan ima takve karakteristike uzimajući u obzir njegovu dvostruku ulogu blokade AT1 receptora i djelomično agonističko svojstvo receptora gama (PPAR) aktiviranog proliferatorom peroksizoma (Balakumar et al., 2012). Cilj ovog rada je bio da se ispita zaštitni uticaj telmisartana na povredu podocita i mezangijalnu ekspanziju u ranoj fazi DM tipa 1.

Cistanche prah

MATERIJALI I METODE

1. Životinje

SD mužjaci pacova kupljeni su od SLRC Laboratory Animal Ltd. (Šangaj, Kina). Pacovi su držani na kontrolisanoj temperaturi od 22 ± 2 stepena C, relativnoj vlažnosti od 50-60 procenata, 12-h svjetlosnih i 12-h tamnih ciklusa (svjetlo, 08:00–20). :00, mrak, 20: 00–08:00), i dozvoljen slobodan pristup standardnoj suvoj ishrani i vodi iz slavine. Sve životinje su dobile humanu njegu, a eksperimentalne protokole odobrio je Komitet za brigu o životinjama na Mornaričko medicinskom univerzitetu.

2. Model i liječenje dijabetesa

Weight 180–200 g male rats were treated with STZ (Sigma, Deisenhofen, Germany) to induce type 1 diabetes. STZ was dissolved in sterile citrate buffer (pH 4.5) and injected intraperitoneally (65 mg/kg body weight) within 10 min of preparation. The non-diabetic rats initially injected with STZ vehicles served as controls (group Con, n = 10). Diabetes mellitus was confirmed by measuring glucose levels in tail venous blood using a B-glucose analyzer (HemoCue, Angelholm, Sweden) 7 days later. Rats with random blood glucose levels>U eksperimente je uključeno 16,7 mmol/L.

Štakori dijabetičari su zatim primili telmisartan (Merck, PHR 1855, 10 mg kg−1 ·d−1 po, grupa DM plus Tel, n=10) ili vehikulum (grupa DM, n=10) putem sonde za 4 sedmice. Telmisartan koji se koristi u ovom radu dobijen je od Sigma-Aldrich Germany, Inc., čija je čistoća 98 posto plus (HPLC). Povremeno su mjereni glukoza u krvi i tjelesna težina, a uzorci urina za kvantitativno mjerenje albuminurije su prikupljani u metaboličkim kavezima. Pacovi su žrtvovani pod anestezijom nakon 4 nedelje, bubrezi su uklonjeni i izmereni za histološku analizu i ekstrakciju proteina.

3. Urinarni albumin

Uzorci urina su centrifugirani na 10,000 o/min tokom 5 minuta da bi se uklonili nerastvorljivi materijali. Supernatant je alikvotan i čuvan na -80 stepeni C do upotrebe. ELISA komplet za urinarni albumin štakora iz Chondrexa (Redmond, WA) korišten je prema uputama proizvođača.

4. Stopa klirensa kreatinina

Komplet za analizu kreatinina (Nanjing Jiancheng, C011-2-1) je korišten za određivanje kreatinina u krvi i urinu. Ccr je izračunat prema formuli: Ccr=(kreatinin u urinu*24 h zapremine urina)/(kreatinin u krvi*24 h*60 min/h)/krajnja težina (kg).

5. Imunohistohemijsko i TUNEL bojenje

Bubrezi su izrezani u mikrotomu za rezanje na 7-8 μm i fiksirani sa 4 posto paraformaldehida u PBS-u u trajanju od 10 min. Blokiranje je izvršeno puferom (PBS, 2 posto BSA, 10 posto FBS) u trajanju od 1 h, nakon čega je uslijedila 10 minuta inkubacije s drugim puferom (PBS, 0,4 posto Triton). Primarno antitijelo protiv -SMA (Servicebio, GB13044) ili NPHS2 (Abcam, ab229037) je inkubirano 3 h na sobnoj temperaturi u vlažnoj komori. Nakon pranja, sekcije su inkubirane sa Cy3 kozjim anti-mišjim IgG (H plus L) (Servicebio, GB21301), HRP konjugiranim kozjim anti-zečjim IgG (H plus L) (Servicebio, GB23303) ili imunofluorescentnim TUNEL-om (Service1bio, G150 ) reakcija u vlažnoj komori (mrak, 37 stepeni, 1 h). Sekcije su zatim obojene sa DAPI (Servicebio, G1012) za detekciju jezgara. Konačno, obojeni delovi su ugrađeni u tečnost za zaptivanje otpornosti na gašenje fluorescencije i slikani pomoću fluorescentnog mikroskopa (NIKON ECLIPSE C1, Japan).

Ekstrakt Cistanche

6. Ćelijska kultura

Ljudske bubrežne mezangijalne ćelije (HRMC) su dobijene iz ScienCell Research Laboratories, Santiago, CA, i uzgajane u medijumu Mesangial Cell (MsCM, ScienCell Research Laboratories). HRMC su stavljeni na tikvicu obloženu poli-L-lizinom (2 ug/cm2) i uzgajani na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2. Ćelije u ovom eksperimentu korištene su u 3-4 pasusa i ispitane su kako bi se osiguralo da pokazuju specifične karakteristike mezangijalnih ćelija. Ćelijska linija mišjih podocita MPC-5 je dobijena od ATCC, Maryland, Sjedinjene Američke Države. Ćelije su uzgajane na kolagenu tipa I u RPMI 1640 (10 posto FBS) sa 50 U/ml IFN- na 33 stepena do 85 posto konfluentnosti, a zatim prebačene na 37 stepeni bez IFN-a tokom 10-14 dana radi diferencijacije.

7. Test vitalnosti i proliferacije ćelija

Komplet za brojanje ćelija-8 (CCK-8) je korišten za mjerenje proliferacije ćelija i vitalnosti ćelija. Ćelije su posađene u svaku jažicu ploča za kulturu 96-jažica (5 × 103/bunarić). Nakon tretmana, dodano je 10 ul CCK-8 (Beyotime, Šangaj, Kina) i inkubirano 1 h na 37 stepeni C. Apsorpcija je mjerena pomoću čitača mikroploče (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Sjedinjene Države) na talasnoj dužini od 450 nm.

8. Aneksin V i bojenje propidijum jodidom

Ćelije su postavljene na pločice i uzgajane dok nisu dostigle 60 posto konfluencije, a zatim tretirane visokom glukozom (50 mmol/L) ili telmisartanom. Nakon 96 h, sakupljene ćelije su isprane hladnim PBS-om i resuspendirane u puferu za vezivanje. Annexin V-FITC i PI (eBioscience, Santiago, CA, Sjedinjene Države) su dodani u ćelijsku suspenziju prema uputama proizvođača, a uzorak fluorescencije 10,000 ćelija je analiziran protočnom citometrijom sprovedenom sa FACScan ( Becton, Dickinson, and Company, Franklin, NJ, Sjedinjene Američke Države).

9. Western blotting

Bubrežni korteks, HRMC i MPC-5 su homogenizirani u reagensu za ekstrakciju tkiva ili ćelijskog proteina (Beyotime) sa dodatkom inhibitora proteaze i fosfataze (Merck, Whitehouse Station, NJ, Sjedinjene Države). Uzorci su razdvojeni na 10% SDS PAGE i prebačeni na nitroceluloznu membranu (Pall Corporation, NY, Sjedinjene Države). Membrana je blokirana sa 5 posto goveđeg serumskog albumina i pročišćena antitijelima. Anti-PKC 1 (Tehnologija ćelijske signalizacije, 46.809), anti-swiprosin-1 (Abcam, ab24368), TGF- 1 (Abcam, ab215715), Tubulin (Beyotime, AT819) i GAPDH (Beyotime, AF5009 ) korišteni su u koncentraciji 1:1,000. Proteini su vizualizirani korištenjem IRDye-konjugiranih anti-mišjih ili anti-zečjih sekundarnih antitijela (Rockland, Limerick, PA, Sjedinjene Države) u 1:5,000. Korištenje ODYSSEY INFRARED IMAGING SYSTEMA (LI-COR) za analizu rezultata.

10. Statističke analize

Obrada podataka je analizirana pomoću Origin 6.1 (OriginLab, Northampton, MA) i izražena kao srednja vrijednost ± SD za najmanje tri nezavisna eksperimenta. Statistička značajnost je određena korištenjem ANOVA. Vrijednost p < 0.05 se smatra statistički značajnom.

Cistanche tubulosa

DISKUSIJA

Telmisartan je selektivni blokator AT1 receptora koji se klinički koristi za smanjenje povišenog krvnog pritiska i izlučivanja proteina u urinu kod hipertenzivnih pacijenata (Baden et al., 2008; Mann et al., 2009). Nekoliko kliničkih studija sugerira da je telmisartan efikasan u smanjenju proteinurije kod pacijenata s makroalbuminurijom i odgađanju početka i progresije dijabetičke nefropatije (Makino et al., 2005.; Nakamura et al., 2010.; Fujita et al., 2011.; Schmieder et al. ., 2011). U ovoj studiji, oralno liječenje telmisartanom kod STZ-induciranog dijabetesa štakora spriječilo je nastanak ranih abnormalnosti u bubrezima i općenito, uključujući smanjenje tjelesne težine, glukoze u krvi i proteina u urinu. Ovi rezultati su potvrdili da telmisartan ima renoprotekciju kod miševa dijabetičke nefropatije u ranoj fazi. Što je još važnije, ova studija je otkrila da se zaštitni učinak telmisartana na dijabetičke glomerule ogleda u anti-apoptotičkim i pro-apoptotičkim efektima na podocite i mezangijalne ćelije, respektivno.

Napredni krajnji proizvodi glikacije (AGE) mogu uzrokovati ozljedu i odvajanje DNK podocita dijelom kroz stimulaciju osovine Ang II-AT1R, pružajući tako inovativnu korisnu osobinu telmisartana u DKD (Fukami et al., 2013). Kod normotenzivnih, proteinurijskih glomerularnih bolesti niskog stepena, liječenje telmisartanom u ranoj fazi bolesti ublažava glomerularna i tubulointersticijska oštećenja (Villa i sar., 2011). Nekoliko puteva je vjerovatno povezano s pleiotropskim posljedicama, uključujući signalizaciju faktora rasta, cilj signalizacije rapamicina kod sisara, ubikvitinaciju proteina, put Wnt-beta katenina i signalizaciju hipoksije (Villa et al., 2011).

Nedavno smo izvijestili da je swiprosin-1 (Wang et al., 2018b), drugo ime za EF-hand domenu koja sadrži 2 (EFhd2), odigrao ključnu ulogu u napredovanju DKD-a započetog nakon indukcije, dok je locirao u podocitima mišjeg glomerula. Odsustvo swiprosina-1 poboljšalo je apoptozu podocita zavisnu od mitohondrija stimulisanu hiperglikemijom ili visokim nivoom glukoze kroz signalni put p38 MAPK. Ovdje smo također otkrili da telmisartan inhibira hiperglikemiju ili ekspresiju swiprosina-1 izazvanu visokim sadržajem glukoze i in vivo i in vitro, što ukazuje da anti-apoptozni efekat telmisartana na podocite može biti povezan s regulacijom swiprosina{ {12}} izraz.

Utvrđeno je da proliferacija mezangijalnih ćelija i prekomerno taloženje proteina ekstracelularnog matriksa doprinose razvoju DKD (Lee et al., 2004). Prethodne studije su pokazale da visoka glukoza može inducirati ekspresiju mezangijalnih ekstracelularnih matriksnih proteina pod hiperglikemijom (Taniguchi et al., 2013). -SMA se generalno koristi za razlikovanje mezangijalnih ćelija od drugih glomerularnih ćelija kod STZ-indukovanih dijabetesnih miševa, a povećana ekspresija -SMA može biti marker fenotipskih pomaka mezangijalnih ćelija iz neaktivirane faze u proliferativnu, sekretorno aktiviranu fazu (Niu et al., 2014). Ovdje smo otkrili da telmisartan smanjuje ekspresiju -SMA u dijabetičkom glomerulu. Pored toga, objavljeno je da proliferacija mezangijalnih ćelija ima značajan uticaj na patogenezu DKD (Zeng et al., 2013). Naši rezultati u ovoj studiji odražavali su vremenski i dozno ovisan depresivni učinak telmisartana na proliferaciju mezangijalnih ćelija povezanu s proapoptotičkim karakteristikama.

Klinički dokazi preporučuju da je telmisartan efikasniji od losartana u ublažavanju proteinurije kod hipertenzivnih osoba sa DKD, što može biti povezano sa njegovom sposobnošću da djelimično agonizuje PPAR (Bichu et al., 2009). Nadalje, ove korisne promjene poput prevencije bubrežne atrofije i fibroze telmisartana povezane su sa smanjenjem ekspresije TGF 1 i drugih proinflamatornih i profibrotičkih citokinskih gena putem PPAR/HGF aktivacije (Kusunoki et al., 2012), nezavisno od toga. blokade receptora Ang II tipa 1. Ovdje smo također otkrili da telmisartan specifično aktivira ekspresiju PPAR gena u mezangijalnim stanicama, a pro-apoptotički efekat uzrokovan telmisartanom na mezangijalne ćelije mogao bi se ublažiti PPAR inhibitorima.

PKC 1 je jedna od ekstenzivno eksprimiranih familija serin-treonin kinaza koje transduciraju širok spektar ćelijskih progresija fosforilacijom specifičnom za supstrat (Newton, 1995). Prijavljeno je da se u biopsijama humane dijabetičke nefropatije uočava ne samo povećana aktivnost PKC, već i nivoi njegove mRNA (Langham et al., 2008). Ekspresija i aktivacija PKC izazvana hiperglikemijom ima pleiotropne efekte u mezangijalnim ćelijama, uključujući promociju prekomerne akumulacije ECM proteina (Brownlee, 2001). Studije su pokazale da inhibicija PKC smanjuje glomerularnu hipercelularnost i ekspanziju ekstracelularnog matriksa kod db/db miševa i glomerularnu disfunkciju kod STZ pacova (Ishii et al., 1996; Koya et al., 2000). Slično, PKC inhibitor je oslabio proliferaciju mezangijalnih ćelija i proizvodnju kolagena izazvanu trombocitnim faktorom rasta (PDGF) (Tokuyama et al., 2011). U našoj studiji, telmisartan je smanjio regulaciju PKC 1 mRNA i ekspresiju proteina u mezangijalnim ćelijama stimulisanim hiperglikemijom. Pored toga, ekspresija TGF 1 u mezangijalnim ćelijama indukovana visokim nivoom glukoze takođe može biti inhibirana telmisartanom.

I AT1 i AT2 receptori, dobro poznati kao sedam transmembranskih receptora vezanih za G protein, klonirani su i farmakološki ilustrovani (Touyz i Berry, 2002). AT1 receptore može selektivno antagonizirati telmisartan, dok blokatori AT1 receptora mogu inducirati ekspresiju AT2 receptora (Touyz i Berry, 2002). Istraživanja su pokazala da AT1 receptori vrše svoj uticaj ograničavanjem rasta ćelija i provociranjem apoptoze (Horiuchi et al., 1997; Touyz et al., 1999). Štaviše, AT2 receptori indukuju ćelijsku apoptozu u specifičnoj konformaciji putem apoptotske signalizacije posredovane p38 MAPK (Miura i Karnik, 2000). U našem ovom radu, ekspresija AT1 i AT2 mRNA bila je nepromijenjena u kultivisanim mezangijalnim ćelijama stimulisanim telmisartanom ili hiperglikemijom. Stoga, apoptoza mezangijalnih ćelija izazvana telmisartanom i smanjena ekspresija PKC 1 možda neće biti posredovani AT1 i AT2 receptorima.

Cistanche kapsule

U zaključku, telmisartan je ublažio ranu glomerularnu ozljedu kod pacova sa dijabetesom tipa 1 inhibirajući apoptozu podocita i promovirajući mezangijalnu apoptozu. Antiapoptotički efekat telmisartana u podocitima može biti povezan sa njegovom inhibicijom ekspresije swiprosin-1, dok je proapoptotički efekat na mezangijalne ćelije bio delimično povezan sa njegovim agonističkim dejstvom na PPAR. Dodatno, telmisartan je selektivno blokirao ekspresiju PKC 1/TGF 1 u mezangijalnim ćelijama, ali ne i u podocitima. Potrebne su napredne studije kako bi se razjasnili suprotni, ali korisni efekti telmisartana na podocite i mezangijalne ćelije i osnovne molekularne mehanizme.

Xin Wei 1, Yabin Ma2, Ya Li 3, Wenzhao Zhang4, Yuting Zhong5, Yue Yu6, Li-Chao Zhang5, Zhibin Wang4 i Ye Tu2

1 Zavod za kliničku farmaciju, bolnica Xinhua, Medicinski fakultet Univerziteta Jiaotong u Šangaju, Šangaj, Kina,

2 Odsjek za farmaciju, bolnica Shanghai East, Univerzitet Tongji, Šangaj, Kina,

3 Odjel za kliničku farmaciju, Centar za klinička ispitivanja, Prva pridružena bolnica Prvog medicinskog univerziteta Shandong i bolnica Qianfoshan provincije Shandong, Jinan, Kina,

4 Odsjek za kritičnu medicinu, Fakultet anesteziologije, Mornaričko medicinski univerzitet, Šangaj, Kina,

5 Odeljenje farmacije, Šangajska opštinska bolnica tradicionalne kineske medicine, Šangaj, Kina,

6 Institut za vaskularne bolesti, Shanghai TCM-Integrated Hospital, Šangaj, Kina