Efikasnost ograničenja kalorija na mitohondrijalnu biogenezu i oštećenje MtDNK u jetri štakora 2

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

2.4. Uticaj starosti i CR na sadržaj i oštećenje mtDNK

Budući da je dinamika mitohondrija usko povezana s održavanjem mtDNK [16,18], odredili smo sadržaj mtDNK kod svih pacova kvantitativnom polimeraznom lančanom reakcijom (qPCR) (Slika 8).

Smanjenje sadržaja mtDNK povezano sa dobi je pronađeno kod AL-28(-27 posto ) i AL-32 pacova (-23 posto ) u poređenju sa AL{{ 5}} životinja, dok nije bilo statističke razlike između AL-28 i AL-32 grupa. CR je bio vrlo efikasan u sprječavanju smanjenja sadržaja mtDNK vezanog za starenje samo nakon 28 mjeseci što je dovelo do povećane (plus 19 posto) vrijednosti u CR-28 grupi u poređenju sa AL hranjenim kolegom sličnim godinama. Nadalje, nije bilo statističke razlike između vrijednosti AL-18 i vrijednosti CR-28 grupe. Kao što se vidi za druge markere u ovom radu, CR nije bio toliko efikasan za 32 mjeseca jer nije bilo razlike između vrijednosti AL-32 i vrijednosti CR-32. Da bismo produbili analizu na nivou oštećenja mtDNK, izmjerili smo relativni sadržaj 4,8 Kb "uobičajene delecije" pomoću qPCR (slika 9).

Nisu nađene značajne promjene s godinama niti sa CR u relativnom sadržaju delecije od 4,8 Kb u svim testiranim grupama.

Konačno, pregledali smo tri specifična regiona mtDNK na pojavu oksidiranih purina, uglavnom 8-okso-deoksiguanozina (8-oksida), koristeći enzim formamidopirimidin DNK glikozilazu (Fpg) osjetljiv na oksidirane purine. Ova tri regiona obuhvataju, respektivno, petlju pomeranja (D-petlja), poreklo replikacije svetlosnog lanca (Ori-L) i delove obe podjedinice NADH dehidrogenaze (ND) 1 i 2 (ND1/ND2)( Slika 10).

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Kao što je prikazano na slici 10, postotak incidencije 8-oksida se značajno razlikovao između grupa pacova u svakoj analiziranoj regiji, iako sa sličnim obrascem. Post-doc test je otkrio značaj smanjenog prisustva 8-oksida kod CR-28 pacova u poređenju sa AL-18 i AL-28 grupom ({{7} } posto CR-28 vs.AL-18 i-43 posto CR-28 vs.AL-28 u D-petlji;-48 posto CR -28 vs.AL-18i-49 posto CR-28vs.Ekstrakt Cistanche protiv zračenjaAL-28 na Ori-L;-54 posto CR-28 vs.AL-18 i -56 posto CR-28 vs.AL{{ 7}} kod ND1/ND2).CR se pokazao efikasnim u prevenciji oksidativnog oštećenja mtDNK do 28 mjeseci, dok se učestalost istih oštećenja nije razlikovala između AL-32 i CR-32 pacovi. Oksidirani purini su već otkriveni kod AL-18 pacova, a da kod AL-28 životinja nije došlo do povećanja vezanog za dob. Poređenje između grupe AL-32 i grupe CR-32 nije pokazalo značajnu razliku. Uzimajući u obzir vrijednosti specifične regije, zanimljivo je naglasiti da je incidencija D-petlje bila najveća među vrijednostima iz testiranih regija u svakoj grupi, čime se podržavaju prethodni nalazi koji ukazuju na ovo područje kao žarište za oksidativna oštećenja [17,{{ 20}}].

Slika 10. Učestalost oštećenja oksidiranih purina na D-petlji, Ori-L i ND1/ND2 regijama mtDNA u jetri od AL-18, AL-28, CR-28, AL -32 i CR-32-mjesečni pacovi. (A). Trake su predstavljale podatke dobijene iz dva nezavisna eksperimenta provedena u tri primjerka i analizirana korištenjem One-way ANOVA testa i Tukeyjevog testa višestrukog poređenja. U grafičkom prikazu, podaci su normalizirani u odnosu na vrijednost AL-18 pacova, fiksirani kao 1, i prikazani kao srednja vrijednost i SD.*p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">cistanche herbaAlikvot svake PCR amplifikacije stavljen je na gel obojen agarozom etidijum bromidom i analiziran na intenzitet trake.

Svi nalazi o efikasnosti CR u grupama koje odgovaraju starosnoj dobi sažeti su u tabeli 1.

3. Diskusija

U dugotrajnoj potrazi za pristupima koji mogu da se suprotstave progresivnom opadanju starenja, CR je stekao izuzetnu važnost zbog svojih pozitivnih efekata, prijavljenih u širokom nizu organizama u rasponu od kvasca do čoveka [22]. Pokazalo se da CR utiče na veliki broj molekularnih puteva. Među njima, neki su posebno učinkoviti u modulaciji mitohondrijalne biogeneze i aktivnosti, kao oni koji osjećaju nutrijente i/ili nivoe energije kao što su AMP-ovisna kinaza (AMPK) i sirtuini, u kojima svi sarađuju s reprogramiranjem mitohondrija izazvanim CR-om. metabolizam [23]. Poboljšanjem oksidativnog metabolizma, CR smanjuje mitohondrijsku proizvodnju ROS-a i molekularna oštećenja uzrokovana porastom ovih reaktivnih vrsta [8-10]. Iako je nekoliko studija istraživalo efekte CR na mitohondrijskom nivou [3,13-15,24], još uvijek nedostaje sveobuhvatan rad o efektima ove nutritivne intervencije na organele. Stoga je ova studija nastojala da testira postojanje granica efikasnosti CR u velikom skupu mitohondrijalnih markera. Posebno smo se fokusirali na poređenje između efekata izazvanih ovim režimom ishrane kod starijih (28-mjesečnih) i ekstremno starih (32-mjesečnih) štakora kako bismo provjerili postoji li međuigra između CR-a i napredovanje starenja. Analiza rezultata otkrila je složenu sliku efikasnosti CR na mitohondrijalnu biogenezu i oštećenje mtDNK, koja je sažeta u tabeli 1.

Cistanche može protiv starenja

3.1.Mitohondrijski markeri kod 28-mjesečnih pacova

CR je pozitivno utjecao na veliki broj mitohondrijalnih markera kod 28-mjesečnih pacova. Naime, zabilježeno je smanjenje aktivnosti citrat sintaze, količine proteina TFAM, MFN2 i DRP1, te sadržaja mtDNA u odnosu na AL-18 kontrolnu grupu sa AL-28 u odnosu na starost. . Sve takve promjene je spriječio CR kod 28-mjesečnih pacova (CR-28). Ovi rezultati podržavaju efekat protiv starenja CR do ove dobi u jetri pacova. Slično, smanjenje incidencije oksidiranih purina u sva tri analizirana regiona mtDNK, izazvano CR, dodatno učvršćuje ovo mišljenje. Treba napomenuti da je ovo oksidativno oštećenje već bilo prisutno kod AL-18 životinja bez porasta u vezi sa starenjem kod AL-28 pacova što sugerira da se njegova pojava može identificirati kao rani marker starenja. Posebnu pažnju treba obratiti na pet mitohondrijalnih markera na koje CR nije utjecao kod 28-mjesečnih pacova, odnosno na količine proteina LonP1. Cvt c, OGGl i APE1 i sadržaj brisanja od 4,8 Kb. U stvari, što se tiče LonP1 i Cyt c, CR nije spriječio smanjenje uzrokovano starenjem pronađeno kod AL-28 životinja, dok količine proteina OGG1 i APE1, kao i sadržaj delecije od 4,8 Kb, nisu bili pod uticajem starosti niti CR. LonP1 je odgovoran za razgradnju iscrpljenog TFAM-a [25-27] i zabilježeno je da se smanjuje sa starenjem [28] u jetri pacova [29] do 27 mjeseci starosti. Prethodno smo sugerirali da bi takva ekspresija LonP1 smanjena starenjem [16] mogla biti povezana s njegovom aktivnošću u uklanjanju TFAM-a nevezanog za mtDNK [26]. Kao moguće objašnjenje za neefikasnost CR da spreči smanjenje ekspresije LonP1 povezanog sa starenjem, uprkos obnovljenoj ekspresiji TFAM i vezivanju TFAM za mtDNA-specifične regione (sadašnji podaci i Picca et al. [15]), je CR. -posredovana aktivacija Sirt3 [30] koja je takođe mogla uticati na količinu proteina LonP1 putem indukovane deacetilacije. Može se predložiti drugačija hipoteza za objašnjenje neefikasnosti CR u sprečavanju smanjenja količine Cyt c. Ovaj protein je glavni pokretač mitohondrijalnog apoptotičkog puta kroz njegovo oslobađanje u citosol, tako da njegova smanjena intramitohondrijska količina kod AL-28 štakora u odnosu na vrijednost AL-18 ukazuje na povećanje intrinzični apoptotički proces sa starenjem [16,31]. Nadalje, što se tiče LonP1, količina Cyt c kod CR-28 pacova je još uvijek bila značajno niža od vrijednosti kod AL-18 životinja, što ukazuje da CR nije bitno utjecao na konačnu regulaciju ekspresije Cyt c /oslobađanje u citosol i, vjerovatno, niti povećanje mitohondrijalnog apoptotičkog puta povezano sa starenjem. Ovo je u skladu sa ranije prijavljenim promocijom apoptoze posredovane CR [23].cistanche rast penisaBudući da apoptotički put može biti pokrenut i akumulacijom oštećenja DNK [32,33], odredili smo proteinsku ekspresiju dva glavna mitohondrijska BER enzima, naime OGG1 i APE1. Na količine proteina oba nije uticalo starenje i CR koji je prošao sa 18. na 28. mjesec. Moguće objašnjenje je da je ekspresija dva BER enzima već povećana i dovoljna kod AL-18 pacova da se suprotstavi povećanom oštećenju mtDNK vezano za starenje. Zaista, zabilježeno je povećanje aktivnosti mitohondrijalnog OGG1 [34,35] i mitohondrijalnog APE1[36] u vezi sa godinama u jetri glodara koji su prešli sa 3-6-mjesečnih životinja na 20-23- mjesec -stare, vjerovatno izazvane da se efikasno suprotstave povećanju oštećenja mtDNK povezane sa starenjem. Sve ovo dalje podržava našu hipotezu da su se oštećenja mtDNK, popravljena pomoću OGG1 i APE1, pojavila vrlo rano u životu glodara (već su bila prisutna kod AL-18 štakora) i inducirana, putem retrogradne komunikacije mitohondrija i jezgra, rano povećanje ekspresije BER enzima. Što se tiče odsustva CR efekta na OGG1 i APE1, predlažemo da je CR smanjeno prisustvo ROS-a i srodna oksidativna oštećenja djelotvorno suzbijana ekspresijom oba enzima koja se ne razlikuje od one kod AL-životinja iste dobi. Što se tiče sadržaja za brisanje od 4,8 Kb, nije došlo do porasta starosti koji je prešao sa AL-18 životinja na AL-28 jer se i ovo oštećenje mtDNK pojavilo prilično rano u životu pacova i njihovoj starosti -povezano povećanje moglo je biti potvrđeno samo u poređenju sa mladim životinjama, kao što je objavljeno u drugim studijama [19,37-39]. Neefikasnost CR da značajno smanji sadržaj delecije od 4,8 Kb kod CR-28 štakora u poređenju sa AL-28 i AL-18 životinjama dalje ukazuje da je dugotrajni CR inducirao značajno smanjenje prisustva ROS u jetri. Ovo je moglo dovesti do neke vrste stabilnog nivoa brisanja od 4,8 Kb, koji se ne razlikuje od onog kod AL-18 pandana i kompatibilan sa odgovarajućim sadržajem mtDNA. Iako popravak mtDNK nije smanjen starenjem, smanjenje sadržaja mtDNK povezano sa starenjem je i dalje bilo prisutno prilikom prelaska sa AL-18 pacova na AL-28, kao što je prethodno opisano u različitim tkivima ostarjeli glodari [3,15,19,39-42]. Ovo se može objasniti povećanim vezivanjem TFAM-a u vezi sa starenjem na specifičnim regionima mtDNK koji su takođe bili oštećena žarišta [19]. Ova hipoteza bi stoga pomirila gubitak mtDNK povezan sa starenjem sa nepromijenjenom ekspresijom i aktivnošću enzima za popravak. U prilog ovoj hipotezi ide i odsustvo gubitka mtDNK kod CR-28 pacova. Zaista, prethodno smo pokazali da je CR spriječio povećanje vezanja TFAM-a na specifične mtDNK regione povezano sa starenjem [15]. Stoga, prema sadašnjim i našim prethodnim podacima, modulacija TFAM-vezivanja može biti jedan od molekularnih mehanizama uključenih u regulaciju mitohondrijalne biogeneze posredovanu starenjem i CR. Takođe se pokazalo da se ova regulacija starenjem i CR ostvaruje kroz ravnotežu mitohondrijalne dinamike na koju utiče starenje [43] i dovodi do prevalencije fuzije nad fisijom [44,45]. Stoga smo izračunali indeks fuzije (FI) za sve ispitane životinje (Slika 6) i pronašli vrijednosti koje su potvrdile i proširile naše prethodne rezultate [16].prednosti cistanche salseOvo istraživanje može prikupiti neke nove indikacije, naime, kod AL-18štakora vrijednosti FI su pokrivale mali raspon, dok je kod AL-28 raspon FI bio mnogo veći, sa označenim starosno povećanje pojedinačnih vrijednosti, kod pacova CR-28 mali raspon vrijednosti ukazuje na pozitivan efekat CR u indukciji fisije, uz generalizovano povećanje pojedinačnih količina DRP1 u poređenju sa onima iz AL-28 grupa. Dok efikasna fisija može ukloniti oštećene organele, slična fuzija entiteta može osigurati difuziju oštećenih makromolekula u mitohondrijalnoj mreži, razblažujući tako njihove negativne efekte [46]. Stoga, CR posredovana restauracija fino podešene ravnoteže mitohondrijske dinamike može izazvati pozitivne posljedice na modulaciju mitohondrijalne biogeneze, djelujući sinergistički s retrogradnom komunikacijom oštećenja mtDNA. Ovo je u skladu sa postojećom literaturom koja izvještava da status nutrijenata i metaboličke promjene mogu modulirati ravnotežu mitohondrijalne dinamike [47] i na taj način utjecati i na biogenezu organela. Konkretno, regulacija mitohondrijalne biogeneze osjetljiva na ROS može se suočiti sa samo ograničenim povećanjem ROS kroz povećanje broja organela [48], a prisustvo ROS-a smanjeno na CR [15] može spriječiti prevazilaženje nivoa sličnog pragu koji bi mogao dovesti do gubitka mitohondrija. Efikasnost CR u smanjenju prisustva ROS dokazana je u ovoj studiji smanjenom akumulacijom oksidiranih purina u mtDNA analiziranim regijama kod CR-28 štakora koji podržavaju ukupno poboljšanje metabolizma mitohondrija, sposoban da se suprotstavi starenju. -povezan pad. Zaista, CR smanjeno prisustvo ROS je naširoko demonstrirano i na nivou mitohondrijalnih proteina i lipida. Posebno se pokazalo da CR smanjuje oksidativne modifikacije mitohondrijskih proteina u srcima štakora |49] i da modificira indeks zasićenosti/nezasićenosti u mitohondrijskim membranama sprječavajući oksidativno oštećenje i održavajući fluidnost membrane [8]. Nadalje, pokazano je da CR smanjuje proizvodnju ROS od strane mitohondrijalnih respiratornih kompleksa u mišjim skeletnim mišićima i jetri [8]. Povoljni efekti CR na nivou ROS takođe uključuju poboljšanu neutralizaciju ROS i povećanu popravku ROS-oštećenih molekula [10]. Pored ovog efekta, promjene u funkcionalnosti mitohondrija su modulirane aktivacijom CR-osjetljivog AMPK i sirtuina koji reguliraju aktivnost faktora transkripcije peroksizomski proliferator aktiviranog gama koaktivator receptora 1-alfa (PGC-1 ), i forkhead box (FoxO), pri čemu je potonji uključen u biogenezu, oksidativni metabolizam i promet mitohondrija [23]. Dakle, CR-posredovan pozitivan utjecaj na metabolizam mitohondrija trebao bi stupiti u interakciju s drugim putevima kako bi se modulirao konačni okidač mitohondrijalne biogeneze, prema modelu retrogradne komunikacije s jezgrom [50].

3.2.Mitohondrijski markeri kod 32-mjesečnih pacova

Što se tiče poređenja između AL-32 i CR-32 pacova, naši podaci pokazuju generalno odsustvo značajnih razlika. Ovo može ukazivati ​​na starosno ograničenje efikasnosti CR u suzbijanju opadanja vezanog za starenje kada se prođe sa 28 na 32 mjeseca. Međutim, što se tiče uticaja starosti, mogu se doneti različiti zaključci u zavisnosti od analiziranog markera. U stvari, u obje 32-mjesečne grupe, smanjenje aktivnosti citrat sintaze, količine TFAM-a, LonP1, OGG1, APE1, sadržaja mtDNA i brisanja od 4,8 Kb održalo se na nivou. koji je bio sličan onom uočenom kod AL-28 pacova ili je djelomično/potpuno spriječen kao u količinama Cyt c, MFN2, DRP1 i incidenci oksidiranih purina u specifičnim regijama mtDNA. Ova različita ponašanja mogu biti vjerovatno zbog međudjelovanja različitih puteva koji uključuju analizirane markere. Još jedan zaključak se može istaknuti poređenjem 32-mjesečnih grupa sa AL-18 i AL-28 za iznose MFN2 i DRP1. U stvari, smanjenje vezano za dob nije bilo prisutno prelazeći iz grupe AL-18 u grupe AL-32 i CR-32 za dva dinamička proteina. S obzirom da je u poređenju između AL-18 grupe i oba 32-mjesečna, kao i za ostale markere došlo do starosnog smanjenja slične ili manje veličine od onog između AL{{ 30}} i AL-28 grupe, možemo dovesti do nekih posljedica. Ovo može ukazivati ​​na to da su promjene markera vezane za starost počele ili su već bile prisutne sa 18 mjeseci, a zatim dostigle najnižu/najvišu vrijednost kod ostarjelih,28-mjesečnih životinja sa "tempom" koji je tipično za proces starenja. Nasuprot tome, kod ekstremno starih životinja (32-mjesečne), činilo se da je "tempo" procesa usporen jer su vrijednosti niže ili jednake vrijednostima AL-18 kolega, ali ne niže /veći od onih iz AL-28, pronađeni su, uprkos dužem proteklom vremenskom periodu. Hipoteza o dva različita koraka u procesu starenja [16] implicira da oštećenja, zbog različitih uzroka, počinju utjecati na fizičke i metaboličke aktivnosti u odrasloj dobi kod svakog štakora. Takva oštećenja se efikasno suzbijaju kompenzacijskim mehanizmima i oštećenja se ne pojavljuju otvoreno, poklapajući se sa stabilnom "srednjom" životnom dobi koju karakterizira uspješna homeostaza. U ovoj studiji identifikovali smo kao štakore koji "brzo stare" one kod kojih ravnoteža između interventnih oštećenja i kompenzacionih mehanizama počinje da bledi kasnije u životu.cistanche tubulosa doza redditKod ovih životinja, koje čine veći dio AL-28 grupe, oštećenja prelaze prag kompatibilan sa normalnim aktivnostima i pojavljuje se izmijenjeno stanje. Suprotno tome, preostali, manji dio ispitane populacije koja stari duže vrijeme održava homeostatsku ravnotežu između oštećenja i popravke i čini grupu životinja koje "sporo stare", uključujući i AL-32 i CR{{2} } pacova. Slična hipoteza o različitim tempom starenja nedavno je predložena i za ljude [51]. Uzeti u cjelini, ovi rezultati ukazuju na to da su ekstremno stare životinje možda dostigle dugovječnost bez značajnog utjecaja CR-a i vjerojatno zbog genetske predispozicije da se bolje nose sa mitohondrijskom disfunkcijom povezanom sa starenjem, ali takva hipoteza opravdava buduća istraživanja. Ova nova otkrića mogu dati odgovor na originalno i ključno pitanje o postojanju granica efikasnosti CR, koje su postavili Ingram i de Cabo u svojoj veoma dubokoj studiji o ovom pitanju 152l, omogućavajući identifikaciju takvih granica sa godinama starosti. 28 mjeseci za jetru pacova. Ipak, zaključak da CR ili bilo koja dijeta nije izazvala korisne posljedice kod onih štakora koji su prirodno predisponirani na dugovječnost ne bi trebao utjecati na cjelokupno povjerenje u efikasnost ove nutritivne intervencije. sprječavaju većinu promjena mitohondrijalne biogeneze i oštećenja mtDNK u jetri 28-mjesečnih pacova povezanih sa starenjem. Ovo dalje potvrđuje CR kao dobro utemeljenu strategiju za efikasno suzbijanje pada starenja u opštoj populaciji.

4. Materijali i metode

4.1. Životinje

Studiju je odobrila institucionalna komisija za njegu i korištenje životinja na Univerzitetu Florida. Sve procedure su izvedene u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) za njegu i korištenje laboratorijskih životinja. Uzorci jetre su od mužjaka pacova Fischer 344× Brown Norway (F344BNF1) dobijeni iz kolonije Nacionalnog instituta za starenje (Indianapolis, IN, SAD) i smješteni pojedinačno na temperaturi (20 plus /-2 stepeni) i svjetlosti kontrolisano okruženje (12-h ciklus svetlosti/tama) sa redovnom hranom za pacove i vodom dostupnim ad libitum na Odeljenju za starenje i gerijatrijska istraživanja, Odsek za biologiju starenja, Medicinski fakultet Univerziteta Floride, Gainesville, FL( SAD). Ograničenje kalorija započeto je u dobi od 3,5 mjeseca (ograničenje od 10 posto), podignuto na ograničenje od 25 posto na 3,75 mjeseci i zadržano na ograničenju od 40 posto od 4 mjeseca do kraja života svake životinje, što je sa 28 mjeseci (CR{ {17}}) ili 32 mjeseca (CR-32) starosti. Životinje s ograničenim unosom kalorija hranjene su prehranom obogaćenom NIH31-NIA kako bi se osiguralo da nisu pothranjene, dok su životinje hranjene ad libitum dobile ishranu za pacove NIH31. Životinje su se sastojale od sljedećih grupa: 18-mjesečne ad libitum hranjene (AL-18, n=6),28-mjesečne ad libitum hranjene (AL -28, n=6),28-mjesečni ograničeni unos kalorija (CR-28, n=6), 32-mjesečni oglas hranjeni libitumom (AL-32, n=6), i 32-mjesečni pacovi sa ograničenim unosom kalorija (CR-32, n =6). Životinje su anestezirane prije žrtvovanja, a uzorci jetre su odmah uklonjeni, brzo zamrznuti u izopetanu ohlađenom tekućim dušikom i pohranjeni u tekućem dušiku do daljnje analize.

4.2. Određivanje aktivnosti citrat sintaze

Određivanje aktivnosti citrat sintaze izvedeno je kao u [17]. Ukratko, 80 ug ukupnih proteina pročišćenih iz uzoraka jetre inkubirano je u reakcionom puferu (0.31 mM acetil-CoA, 100 mM Tris pufera ( pH 8,1), 0,25 posto Triton X-100, 0,1 mM 550-ditiol-bis-2-nitrobenzojeve kiseline i 0,5 mM oksaloacetata (1 mL) na 30 stepeni.

Aktivnost citrat sintaze (umol×min-I×g tkiva-) je spektrofotometrijski određena mjerenjem brzine proizvodnje tionitrobenzojeve kiseline (TNB) na 412 nm.

4.3. Western Immunoblotting

Mitohondrije jetre su izolovane u medijumu koji sadrži 220 mM manitola, 70 mM saharoze, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA i 5 mM EGTA, pH 7,4, na 4 stepena prema 【16】. Osim toga, 10 ug mitohondrijalnih proteina korišteno je za Western imunoblot analizu. Anti-TFAM(1:50,000), anti-VDAC(1:50,000, Abcam, Cambridge, UK), anti-OGG1(1:2500, Abcam, Cambridge, UK) , anti-APE1(1:5000, Abcam, Cambridge, UK), anti-MFN2(1:5000, Abnova, Tajpej, Tajvan), anti-DRP1(1:2500, Abnova, Tajpej, Tajvan) , anti-Cyt c (1:500, Pharmingen, San Diego, Kalifornija, SAD) i anti-Lon proteaza (1:10,000) korišteni su kao primarna antitijela. Antitijela protiv TFAM-a i Lona su napravljena po narudžbi i ljubazno donirana od strane dr. H. Hinagaki (Odjel za hemiju, Nacionalni institut za industrijska istraživanja u Nagoji, Nagoya-shi, Aichi, Japan) i dr. C. Suzuki (Odjel biohemije i molekularne biologije, Medicinski fakultet u New Jerseyu, Univerzitet medicine i stomatologije u New Jerseyu, Newark, NJ, SAD). Proteini su detektovani hemiluminiscencijom, a imunoreaktivne trake su kvantifikovane pomoću softvera Image Lab (BioRad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornija, SAD) i normalizovane u odnosu na VDAC ekspresiju.

4.4.Određivanje mtDNK i mtDNK 4.8 Kb Sadržaj "Zajedničko brisanje"

Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qPCR) korištena je za određivanje relativnog sadržaja mtDNA i mtDNA 4,8 Kb "zajednička delecija". Reakcije su izvedene putem SYBR Green kemije korištenjem 3 ng ukupne DNK kao šablona i sljedećih prajmera: MtDNA za 5-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3'(nt 15.785-15.806), mtDNA rev 5'-TGATTAGACCCGTTACCATCGA-3'(nt 15,868-15,847); -actin za 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA-3'(nt 2181-2200), -actinrev5'-CGTCTCCGGAGTCCATC AC-3'(nt 2266-2248);4.8 del za {{26} }AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA-3'(nt8109-8131), 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA-3'(nt 13,020-12,996). Sadržaj mtDNK u odnosu na nuklearnu Određeni su DNK i sadržaj "uobičajene delecije" od 4,8 Kb u odnosu na mtDNK, kao što je objavljeno u [19].

4.5. Analiza oksidiranih purina

Formamidopirimidin DNK glikozilaza (Fpg) (New England Biolabs, Beverly, MA, SAD) digestija ukupne DNK korištena je za otkrivanje oksidiranih purina [53].

PCR amplifikacija D-petlje, Ori-L i ND1/ND2 regiona mtDNK je sprovedena korišćenjem odgovarajućeg para prajmera:

D-petlja For5'-TCTGGTCTTGTAAACCAAAAATGA-3'(nt 15,302-15,325),D-petlja Rev 5'-TGGAATTTTCTGAGGGTAGGC-3'(nt 16,302-16, 282); Ori-L Za 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA-3' (nt 4414-4433),Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGCTCCA-3'(nt 5407-5388);ND1 Za 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT-3'(nt3390-3409),ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3'(nt 4399-4380) na 5 ng Fpg tretirane i netretirane ukupne DNK. Uslovi ciklusa su bili: Pre-inkubacija od 10 minuta na 95 stepeni, nakon čega je usledilo 18 ciklusa od 15s95 stepeni,15s na 58 stepeni C i 1 min na 72 stepena. Alikvot svake PCR amplifikacije je napunjen na 1,3% agaroznog gela. Intenzitet traka traka obojenih etidij bromidom analiziran je softverom Image Lab (BioRad Laboratories Inc., Kalifornija, SAD). Da bi se poboljšala grafička vizualizacija, omjer između intenziteta opsega tretiranih i netretiranih Fpg izražen je kao postotak komplementa prema 100.

4.6. statistika

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost i standardna devijacija (SD). Korištena je jednosmjerna ANOVA sa Tukeyjevim testom višestrukog poređenja. Za sve testove, statistička značajnost je postavljena na nivo od 5 posto. Analize su rađene korišćenjem specifičnog statističkog paketa (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software: Release. College Station, TX, SAD).

Ovaj članak je preuzet iz Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms