Tetrahymena Thermophila je korištena kao eksperimentalni materijal

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

U ovom eksperimentu kao eksperimentalni materijal korištena je Tetrahymena thermophila. T. thermophila je slobodno živuća trepavica koja je široko rasprostranjena u globalnim vodenim ekosistemima i slična je ćelijama metazoana u strukturi i funkcionalnoj složenosti5. Otkriće ribozinela6 i telomerasela7 u Tetrahimeni dalo je veliki podsticaj istraživanju mehanizama protiv starenja, koje je nagrađeno sa dve Nobelove nagrade18. Zbog svog kratkog ciklusa rasta, jednostavne kulture i jasne genetske pozadine, T. thermophile bi mogao pružiti dvostruko istraživanje in vivo i in vitro u jednom eksperimentalnom dizajnu. T. thermophila se uspješno koristi u skriningu lijekova i farmakološkim mehanizmima20. Što je još važnije, otkrivene su informacije o molekularnoj evoluciji porodice glutation peroksidaze T. thermophila9-2. Informativni profil T.cistanche genghis khanthermophila GPX geni se mogu dobiti iz Tetrahymena Functional Genomics Database (TetraFGD) (http://tfgd.ihb.ac.cn/) i TGD (http://ww. ciliate.org)22. Deset od dvanaest navodnih GPX identificirani su kao fosfolipid hidroperoksid glutation peroksidaza (PHGPx) u komparativnoj bazi podataka Tetrahymena genoma. PHP, GPX ovisan o selenu, može posebno smanjiti fosfolipidni hidroperoksid kako bi zaštitio lecitinske liposome i biofilmove od oksidativnog oštećenja23.PHGPxin T. thermophila ima prosječnu molekulsku masu od približno 21,7 kDa22, što je slično molekulskoj masi (20-22 kDa) proteina monomera PHGPx opisanog kod sisara24. Štaviše, veliki broj izvještaja je pokazao da je GPX ekspresija Tthermophile kvantitativno različita i ovisi o izvoru stresa (oksidans, induktor apoptoze ili metal)2122 i vremenu izlaganja20-24

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Poređenjem efekata vodenog ekstrakta i glavnih monomera G.lucidum na krivulju rasta i maksimalnu gustinu T. thermophila, ova studija je dobila najbolji ekstrakt G. lucidum protiv starenja. Mehanizam protiv starenja G. lucidum, posebno određivanje tipa delovanja porodice GPX, istražen je na molekularnom, ćelijskom i individualnom nivou. Očekuje se da će rezultati ove studije doprinijeti kliničkoj primjeni proizvoda G. lucidum.

materijali i metode

Vodeni ekstrakt i monomeri Ganoderme lucidum. Pozivajući se na izvještaj Cuonga, 25,20 g sušenog G. lucidum (Changbai Mountain Senbao Specialty Store, Jilin) ​​je mljeveno i ekstrahirano u 1000 mL ddHO. Vodeni ekstrakt je sakupljen centrifugiranjem, koncentrisan do 100 mL sušenjem u vakuumu i čuvan na -20 stepeni do upotrebe.

Polisaharid G. lucidum, Ganoderična kiselina A, Ganoderal A i G. lucidum ergosterol kupljeni su od Chengdu Must Biotechnology Co.,Ltd. Ova tri standarda su rastvorena u metanolu prema uniformnom dizajnu i dodata u SPP medijum. Ćelijska kultura i liječenje lijekovima. Tetrahymenathermophila (SB210) je obezbijedio Institut za hidrobiologiju Kineske akademije nauka, Wuhan, IPR Kina. T. thermophila je uzgajana u inkubatoru na 28 stepeni. SPP medij je sadržavao 2 posto (w/v) proteoznog peptona,0.1 posto ekstrakta kvasca (Oxoid),0,2 posto glukoze i 0.003 posto sekvestrena. Prema uniformnom dizajnu (dopunske tabele S1 i S2), vodeni ekstrakt G. lucidum,G. lucidum polisaharid, ganoderična kiselina A, ganoderal A i G. lucidum ergosterol su dodani u medijum za kulturu. Kontrolna grupa je zamijenjena istom zapreminom dvostruko destilovane vode, sa 3 paralelna uzorka u svakoj grupi. Nakon ulaska u logaritamsku fazu, uzorci su uzimani svaka 2 h do faze opadanja. Gustoća T. thermophila je prebrojana pomoću ploče za brojanje krvnih zrnaca, a izvučena je veza između gustine T. thermophila i vremena.

Transkripciona analiza. Eksperiment je izveden sa 24-pločom za jažice, a svaka jažica je sačinjena od 900 μL SPP. U eksperimentalnoj grupi dodano je 100 μL 200 mg/mL G. lucidum vodenog ekstrakta. Umjesto toga, kontrolna grupa je tretirana sa 100 μL ddHO. U svakoj grupi su postavljena tri paralelna uzorka.produžetak životnog vijeka cistancheKontrolna i eksperimentalna grupa su bile u logaritamskoj fazi (20 h), a faza opadanja (27 h) je prikupljena za transkriptomsku analizu. Svaka grupa je biološki duplicirana, a svi uzorci su podvrgnuti mikromrežnom testu cijelog transkripta (Biomarker Technologies, Peking, Kina). Profil ekspresije gena je detektovan pomoću Affymetrix 3'IVT Expression Array Da bi se smanjio efekat ekspresije vrednih gena, RPKM veći ili jednak 5 i FC (Fold Change) veći ili jednak 2 korišćeni su kao kriterijumi za skrining diferencijalno eksprimirani geni (DEGs) KOBAS je korišćen za realizaciju analize puta Geneontologije (GO) i Kjoto enciklopedije gena i genoma (KEGG). Put obogaćivanja određen je korigovanom P-adj vrijednošću manjom ili jednakom 0,05. Rezultati transkriptoma su potvrđeni korištenjem kvantitativne reverzne transkripcije PCR (RT-qPCR) (metoda vidi Dodatni fajl). Zatim je uspostavljena mreža protein-protein interakcije (PPI) na osnovu STRING baze podataka, a centralni gen je pregledan korištenjem CytoHubla za identifikaciju centralnog čvora u softveru Cytoscape.

Bojenje srebra i posmatranje transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM). Postupak bojenja srebrom bio je prema Foissnerovoj metodi26. thermophila je promatrana pod uljnim mikroskopom. Ultrastruktura T. thermophila je uočena TEM-om. Ćelije tretirane vodenim ekstraktom G.lucidum i kontrolna grupa sakupljene su centrifugiranjem na 600×g tokom 2 min. Ćelije su prefiksirane u 2,5 posto glutaraldehida i održavane na 4 stepena 8 sati. Uzorci su isprani PBS (pH7,5) tri puta, centrifugirani na 3000xg tokom 5 minuta, a zatim fiksirani sa 1% osmijum tetraoksida (4h). Nakon toga, dehidracija je izvedena korištenjem gradijentnog acetona od 15 do 100 posto. Zatim su ćelije ugrađene u Embed 812(TAAB) nisko viskoznu smolu. Nakon stvrdnjavanja ultratanki rezovi (60-80 nm) su izrezani ultratankim rezačem. Ultrastruktura je posmatrana transmisijskim elektronskim mikroskopom (JEOL JEM-1010, Japan).

Određivanje oštećenja ćelija. Unutarćelijski lROS je detektovan osjetljivom fluorescentnom sondom 2',7'-dihlorodihidrofluorescein diacetat (DCFH-DA)27. Aktivnost malondialdehida (MDA) određena je komercijalnim kompletima koje je obezbijedio Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Jiangsu). Metoda za određivanje sposobnosti eliminacije hidroksilnih radikala (·OH) je opisana od strane Takemura28. Sposobnost vodenog ekstrakta G. lucidum da eliminiše slobodne radikale OH izražena je kao optička gustina eksperimentalne grupe minus optička gustina kontrolne grupe.

Cistanche može protiv starenja

PHGPx aktivnost. Nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH)/NADP* omjer i omjer glutation/glutation disulfida (GSH/GSSG) određeni su pomoću NADP*/NADPH Kvantifikacijskog kompleta (S0179, Beyotime), GSH/GSSG kompleta za testiranje (S0053). testovi su obavljeni prema protokolu proizvođača.

Rezultati

Efekti vodenog ekstrakta G.lucidum i monomera G.lucidum na rast T. ther-mochila. Kao što su prethodne studije7,G. lucidum polisaharid je bio glavna komponenta vodenog ekstrakta G. lucidum u ovom eksperimentu prema identifikaciji spektrofotometra (dodatna slika S1). Aktivne tvari vodenog ekstrakta G. lucidum također su analizirane GC-MS. Ukupni ionski dijagram vodenog ekstrakta G. lucidum pokazao je da u vodenom ekstraktu postoje sve komponente (dopunska slika S2). Među spojevima vodenog ekstrakta G.lucidum (dopunske tabele S3 i S4), G. lucidum acid A, Ganoderal A i G. lucidum ergosterol su odabrani prema njihovom vremenu zadržavanja i stepenu podudaranja.

Da bi se uporedili efekti vodenog ekstrakta G. lucidum i ovih glavnih monomera na rast T. thermophila, vodeni ekstrakt G. lucidum i rastvor monomera G. lucidum dodani su u medijum za kulturu T. thermophila. Rezultati su prikazani na slici 1. Maksimalna gustina kontrolne grupe bila je 6×104 ćelija/mL za 24 h. Gustoća ćelija u grupi sa vodenim ekstraktom G. lucidum od 12 do 20 sati bila je skoro ista kao u kontrolnoj grupi, ali je od 20 do 25 sati bila značajno veća od gustine ćelija kontrolne grupe.cistanche nzIstovremeno, logaritamska faza je produžena za 1 h, maksimalna gustina je bila 1,15×105 ćelija/mL. Iako je maksimalna gustina polisaharidne grupe G. lucidum bila veća od one u kontrolnoj grupi za 9,7×104 ćelija/mL, bila je manja od grupe sa vodenim ekstraktom G.lucidum. Maksimalna gustina G. lucidum acid A, Ganoderala A i G. lucidum ergosterola nije bila veća od one u kontrolnoj grupi, što je pokazalo da alkoholne otopljene materije ovih monomera ne doprinose rastu T. thermophila. Moglo bi se zaključiti da vodeni ekstrakt G.lucidum koji sadrži različite aktivne supstance može pospješiti rast T. thermophila više nego njeni monomeri.

Anti-age efekat vodenog ekstrakta G. lucidum. S povećanjem vremena kulture, intenzitet svjetlosti ROS u fazi opadanja (slika 2b) bio je veći nego u logaritamskoj fazi (slika 2a). Nakon dodavanja vodenog ekstrakta G. lucidum, iako je intenzitet fluorescencije faze opadanja (slika 2d) i dalje bio pojačan u odnosu na logaritamsku fazu (slika 2c), bio je značajno niži nego u kontrolnoj grupi. Sadržaj MDA u kontrolnoj grupi takođe je bio veći u fazi opadanja nego u logaritamskoj fazi (Sl.2e). U međuvremenu, sposobnost čišćenja OH u fazi opadanja bila je niža od one u logaritamskoj fazi (slika 2e). Izgubljena je ravnoteža između oksidacije i redukcije i tijelo je ostarjelo. Nakon dodavanja vodenog ekstrakta G. lucidum, sadržaj MDA je bio niži od onog u kontrolnoj grupi (lijevi stupac na sl. 2e), a količina OH koju su ćelije pokupile u logaritamskoj fazi i fazi opadanja bila je veća od one u fazi opadanja. kontrolna grupa (desna kolona na sl. 2e). Rast T[ thermophila može se uporediti sa procesom starenja višećelijskih organizama kroz njegovo oštećenje ćelija. Kako su se ROS i MDA akumulirali, rast je inhibiran, a gustina T. thermophila smanjena. Dodatak vodenog ekstrakta G. lucidum mogao bi održati redoks ravnotežu u T. thermophila i postići efekte protiv starenja.

Analiza diferencijalno eksprimiranih gena i verifikacija RT-qPCR. U poređenju sa kontrolnom grupom, ekspresija 11.519 gena u logaritamskoj fazi T. thermophila značajno se promenila nakon dodavanja vodenog ekstrakta G. lucidum u SPP. Među njima, 6201 gen je bio reguliran naviše, a 5318 gena je regulirano naniže.veličina penisa cistancheEkspresija 8772 gena se značajno promijenila tokom faze opadanja, među kojima je 4721 gen bio reguliran naviše, a 4051 gen je bio reguliran naniže. U prethodnim studijama u našoj laboratoriji,

Efekat protiv starenja G.lucidum na Stylonychia ogleda se u indeksu antioksidansa, tako da je 10 gena (dopunska tabela S5) vezanih za antioksidanse nasumično odabrano između DEG-ova, a tačnost RNA-seq podataka je verifikovana od strane RT-a. qPCR. Obrasci ekspresije ovih 10 gena u logaritamskoj fazi i fazi opadanja bili su u skladu s trendom podataka RNA-seq (dodatna slika S3). Rezultat je pokazao da su podaci RNA-seq pouzdani i da se mogu koristiti za kasniju analizu.

GO obogaćivanje i KEGG analiza puta. DEG-ovi u logaritamskoj fazi bili su uključeni u 14 bioloških procesa (BP) sa 6 tipova molekularnih funkcija (MF) i postojali su u svim ćelijskim komponentama (CC) (Sl. 3a). DEG-ovi u fazi opadanja bili su uključeni u 12 BP sa 4 vrste MF i postojali su u 12 CC Najveći uključeni BP u dvije faze bio je metabolički proces, MF je bio vezivanje, a CC je bila membrana. Među metaboličkim procesima, vezivanjem i membranom, geni sa povećanom regulacijom su činili 70 posto u logaritamskoj fazi (slika 3b) i 75 posto u fazi opadanja (slika 3c). Ovi rezultati pokazuju da vodeni ekstrakt G. lucidum može promovirati održavanje integriteta ćelijske membrane u obje faze.

Analiza obogaćivanja KEGG puta je izvršena kako bi se dalje analizirali DEG između dvije faze. U logaritamskoj fazi koncentrirana su 94 puta, među kojima je 68 posto ukupnih gena uključeno u metabolizam. U fazi opadanja, obogaćen je 91 put, među kojima je i dalje najveći put bio metabolizam sa 68 posto. Prvih 20 puteva u logaritamskoj fazi (slika 3d) i fazi opadanja (slika 3e) korišteno je za crtanje mjehuraste karte i pokazalo je da bez obzira na značaj ili broj uključenih gena, efekat G.cistanche prahlucidum vodeni ekstrakt prvenstveno fokusiran na put metabolizma glutationa. U logaritamskoj fazi, 38 različito eksprimiranih gena je obogaćeno ovim putem, što čini 45 posto. U fazi opadanja,43 različito eksprimirana gena su obogaćena ovim putem, što čini 50 posto.

Protein-protein interakcija (PPI) mreže DEG. Razjašnjenje DEG-ova u putu metabolizma glutationa i uvid u njihove interakcije sa drugim proteinima pomoći će u daljem istraživanju potencijalnog regulatornog mehanizma vodenog ekstrakta G. lucidum. I logaritamska faza (slika 4a) i faza opadanja (slika 4b) imale su najvažnije efekte na GPX1, GPX2, GPX7 i GPX11. Kroz upit baze podataka TetraFGD, ovi GPX enzimi pripadali su PHGPx-u (Dopunska tabela S6). Stoga, antioksidativni enzimi, posebno PHGPx, igraju važnu ulogu u promociji rasta T. thermophila putem indukcije vodenog ekstrakta G. lucidum.

GPS aktivnost i provjera funkcije. Aktivnost PHGPx se odnosi na stopu smanjenja apsorpcije NADPH2". Vrijednost NADPH/NADP* u fazi opadanja kontrolne grupe bila je niža od one u logaritamskoj fazi (Slika 5a). Rezultat sugerira da aktivnost PHGPx Nakon dodavanja vodenog ekstrakta G. lucidum, NADPH/NADP plus vrijednost u fazi opadanja je i dalje bila niža od one u logaritamskoj fazi, ali viša od obje faze kontrolne grupe.Ovaj rezultat je pokazao da G.lucidum vodeni ekstrakt mogao bi promovirati aktivnost PHGPx.

PHP može specifično katalizirati redukciju fosfolipidnog hidroperoksida reduciranim glutationom (GSH), tako da efikasno pretvara toksični lipidni peroksid (PL-PUFA-OOH) u netoksične polinezasićene masne kiseline (PL-PUFA-OH)30. Promjena omjera GSH/GSSH može odražavati promjenu PL-PUFA-OOH i PL-PUFA-OH Zbog smanjenja aktivnosti PHGPx (slika 5a), odnos GSH/GSSH u kontrolnoj grupi se također smanjio sa povećanje vremena kulture (slika 5b). Međutim, nakon dodavanja vodenog ekstrakta G.lucidum, odnos GSH/GSSH je povećan u logaritamskoj fazi i fazi opadanja. Intracelularni toksični PL-PUFA-OOH u eksperimentalnoj grupi je transformisan u netoksični PL-PUFA-OH, što je više nego u kontrolnoj grupi. Promatranje mikroskopske morfologije i ultrastrukture. Zaštitni učinak vodenog ekstrakta G. Luci-dum na membranu vizualiziran je bojenjem amonijak srebrom i TEM. Poređenjem logaritamske faze kontrolne grupe (slika 6a) i faze opadanja kontrolne grupe (slika 6c), ustanovljeno je da je morfologija ćelija T. thermophila ozbiljno deformisana produžetkom vremena kulture, a jezgro je bilo zamućeno, što ukazuje da su ćelije izgledale u stanju starenja. Međutim, u grupi sa vodenim ekstraktom G.lucidum, morfologija i integritet ćelija bili su dobro zaštićeni u logaritamskoj fazi (slika 6e) i fazi opadanja (slika 6g). Ultrastrukturne promjene u ćelijama su uočene TEM. Greben i kontura mitohondrija bili su zamagljeni u fazi opadanja (slika 6d) u poređenju sa logaritamskom fazom (slika 6b) u kontrolnoj grupi. Propadanje mitohondrija se povećava sa produžavanjem vremena kulture. Dodavanje vodenog ekstrakta G. lucidum poboljšalo je morfologiju mitohondrija u logaritamskoj fazi (slika 6f) i fazi opadanja (slika 6h). Vodeni ekstrakt G. lucidum garantovao je funkciju mitohondrija, što je usko povezano sa integritetom membrane. Treba napomenuti da su u logaritamskoj fazi mitohondrije u eksperimentalnoj grupi pokazale morfološke promjene (sl. 6f, h), ali integritet membrane nije bio narušen.

Diskusija

Primjena ekstrakta G.lucidum ima dugu povijest kako u tradicionalnoj kineskoj medicini tako iu istočnoj Aziji. Veliki broj studija je pokazao njihovu efikasnost. Prethodni izvještaji su otkrili da vodeni ekstrakt G.lucidum sadrži ne samo polisaharide G. lucidum već i glucidum triterpenoide. Prema prethodnim izveštajima, Ganoderma kiselina, Ganoderma aldehid i Ganoderma ergosterol su glavni sastojci G. lucidum triterpena 3. Oni deluju sa različitim funkcijama popravljanja ćelija (Tabela 1). Vodeni ekstrakt Ganoderme lucidum sadrži različite aktivne supstance, integrišući funkcije ostale četiri aktivne supstance, koje ne samo da mogu da se odupru oksidaciji već i da sačuvaju integritet membrane. U ovoj studiji,

poticanje rasta vodenog ekstrakta G. lucidum na T. thermophila potvrdilo je ovaj odnos uključivanja. Analizom vodenog ekstrakta G. lucidum pomoću total-ionske protočne hromatografije (dopunska slika S2), moglo se utvrditi da je vrijeme otapanja različitih aktivnih tvari različito. Tako vodeni ekstrakt G. lucidum postaje složeni organski rastvarač sa produženjem vremena ključanja. Smatramo da aktivne tvari u vodenom ekstraktu G.lucidum mogu djelovati u različito vrijeme, što rezultira sinergijom. Ovo bi trebalo da bude dalja studija u budućnosti.

Analiza transkriptoma T. thermophila istraživala je uticaj vodenog ekstrakta G. lucidum na ekspresiju gena tokom rasta. Nakon tretmana vodenim ekstraktom G. lucidum, PHGPx je pokazao ključni uticaj na gustinu ćelija i vreme generisanja. Ovaj rezultat je potvrdio da vodeni ekstrakt G.lucidum djeluje na tip GPX porodice zavisan od selena. PHP je multifunkcionalni seleno-protein koji je široko rasprostranjen u tijelu koji ne samo da može sudjelovati u antioksidativnim reakcijama već i direktno smanjiti lipide u membrani kako bi zaštitio integritet membranskog sistema40. U poređenju sa drugim GPX-ovima, PHGPx ima manji volumen i veću hidrofobnost. Mnogi izvještaji su pokazali da prekomjerna ekspresija PHGPx u stanicama može odoljeti ćelijskom odgovoru na endogenu (npr. starenje) fl i egzogena (npr. okolišna) oštećenja peroksidacije 2-45.PHP je jedini enzim koji može direktno smanjiti PL-PUFA- OOH membrane u odgovarajuća hidroksilna jedinjenja, čime se omogućava prekid peroksidacije i štiti biološka membrana od oštećenja peroksidacijom4647. Povećanje sadržaja PL-PUFA-OOH bio je razlog za oštećenje ćelijske membrane u kontrolnoj grupi tokom faze opadanja koja je postala začarani krug i ubrzano starenje ćelija. U ovom istraživanju sadržaj ROS i MDA (Sl.2) T.thermophila u kontrolnoj grupi povećavao se sa povećanjem vremena kulture. Na membrani se morfološkim posmatranjem ukazala ozbiljna deformacija u fazi opadanja. Međutim, kada je dodat G. lucidun vodeni ekstrakt, ekspresija PHGPx je bila pojačana. Tako je PL-PUFA-OOH na membrani transformiran u netoksični PL-PUFA-OH, a stabilnost strukture membrane je poboljšana kako u logaritamskoj fazi tako iu fazi opadanja. Na osnovu posmatranja membrane bojenjem amonijak srebrom i TEM, moglo bi se zaključiti da je vodeni ekstrakt G.lucidum prodirao u ćelijsku membranu tokom procesa rasta. Ovaj efekat popravljanja na ćelijskoj membrani mogao bi da indukuje aktivne supstance vodenog ekstrakta G. lucidum da uđu u citoplazmu i zaštite membransku strukturu jezgra i mitohondrija kako bi podstakli metabolizam T. thermophila i postigli efekte protiv starenja. Kao što pokazuju rezultati obogaćivanja lKEGG, veliki broj diferencijalnih gena je koncentrisan u metaboličkim putevima. Ovi rezultati su pokazali da je vodeni ekstrakt G. lucidum bio koristan za metabolizam glutationa i eliminaciju toksičnih peroksida nastalih starenjem stanica.

Općenito, vodeni ekstrakt G. lucidum promovirao je ekspresiju enzima ovisnog o selenu PHGPx u porodici GPX. Povećanje aktivnosti PHGPx ne samo da može smanjiti odgovor na oksidativni stres in vivo, već i specifično i efikasno smanjiti taloženje lipida u biološkoj membrani i održati integritet membrane (slika 7). Posljedično, aktivne tvari u vodenom ekstraktu G. lucidum ulaze u stanice kroz netaknutu membranu i pospješuju njihov metabolizam. Ovo je stvorilo pravi ciklus za postizanje efekta protiv starenja.

Ovaj članak je preuzet iz Scientifc Reports|(2022) 12:3139|https://doi.org/10.1038/s41598-022-06985-z