Nakon što je utvrđeno da je senolitički efekat ouabaina zavisan od tipa ćelije

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Poremećaj K*/Nat homeostaze uzrokovan ouabainom dovodi do različitih fizioloških reakcija u kontrolnom i senescentnom A549 i END-MSC-u

Nakon što smo utvrdili činjenicu da je senolitički efekat ouabaina ovisan o tipu ćelije, pokušali smo dalje da razjasnimo šta može biti u osnovi otkrivenih razlika u odgovorima hMSC i A549. U tu svrhu analizirali smo starenje END-MSC i etopozida izazvano oksidativnim stresom. -indukovano starenje A549 preciznije.cynomorium prednostiGlavni molekularni mehanizam djelovanja različitih srčanih glikozida je inhibicija Nat/K plus -ATPaze [44]. Nat/K plus -ATPaza je enzim plazma membrane koji pumpa natrijum iz ćelije dok pumpa kalijum u ćeliju protiv gradijenata koncentracije i na taj način učestvuje u održavanju K plus i Na plus homeostaze. Stoga smo pitali postoje li razlike u bazalnoj i ouabain-induciranoj ionskoj homeostazi između kontrolnih i senescentnih stanica dva tipa.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Poremećaj u K plus i Na plus homeostazi uzrokovan ouabainom bi u konačnici trebao dovesti do disipacije potencijala plazma membrane. Stoga smo, dalje, koristili specifičnu fluorescentnu sondu DiBAC4(3) za mjerenje transmembranskog potencijala neekscitabilnih ćelija. Povećana fluorescencija ove boje odražava depolarizaciju membrane.pustinjski zumbulU svakom ispitivanom tipu ćelije ouabain je inducirao predvidljivu depolarizaciju membrane, potvrđujući jonski disbalans (slika 10a). Primjetno smo primijetili uporedive nivoe depolarizacije membrane u kontrolnim i starim END-MSC-ovima, dok se stari A549 karakterizira značajno više depolarizirane membrane u odnosu na kontrolne ćelije A549.

Druge važne posljedice ionske deregulacije su promjene u potencijalu mitohondrijske membrane (MP).

Tako smo, koristeći fluorescentnu sondu JC-1, procijenili MMP u kontrolnim i senescentnim ćelijama nakon tretmana ouabainom. Treba posebno naglasiti da stare ćelije obično karakterizira smanjeni MMP što odražava neispravnost mitohondrija, promjene u energetskom metabolizmu i povećani nivoi intracelularnih reaktivnih vrsta kisika[45]. Očekivano, MMP u starim END-MSC i A549 ćelijama bio je niži nego u kontrolnim,

iako ovo smanjenje nije uticalo na održivost ćelija koje se staraju (slike Id, 6a,10b).metoda ekstrakcije flavonoida pdfSlično gore navedenim rezultatima, ouabain je izazvao izraženu depolarizaciju MMP u senescentnom A549 u poređenju sa njihovim proliferirajućim kolegama, dok je efekat na MMP kontrolnih i senescentnih END-MSC bio minimalan (Sl.10b). Sumirajući rezultate opisane u ovom dijelu, možemo zaključiti da blokiranje Na plus /K plus -ATPaze od strane ouabaina dovodi do dramatične depolarizacije plazma membrane i pada MMP u slučaju starenja A549, za razliku od senescentnog END-MSCS.

Promjene u mehanizmima K plus uvoza posreduju u ouabain-otpornosti senescentnih END-MSC-a

Da bismo razjasnili mehanizme koji posreduju ouabain-induciranim promjenama u polarizaciji membrane i MMP-u između starenja A549 i END-MSC-a, dalje smo koristili napredni bio-informatički pristup. Cilj analize je bio da se otkriju moguće transkriptomske karakteristike koje posreduju o tipu ćelije u zavisnosti od rezistencije na ouabain ili -senzitivnosti senescentnih ćelija. Drugim riječima, postavili smo pitanje: kako se starenje END-MSC-a (ćelije otporne na ouabain) razlikuje od starenja A549 (ćelije osjetljive na ouabain)? Da bismo odgovorili na ovo pitanje, koristili smo tri nezavisna skupa podataka za sekvenciranje RNA (RNA-Seq). Prva je bila RNA-Seq analiza

Slika 6. Validacija modela starenja A549 izazvanog etopozidom. Senescent A549 ćelije pokazuju gubitak proliferacije, b dobijaju povećanu veličinu ćelije, c nivo autofluorescencije, i d SA-b-Gal aktivnost u poređenju sa kontrolnim. e Nivoi fosforilacije p53 i Rb i nivoi ekspresije p21 i HMGBI proteina u kontrolnom i senescentnom A549. Prikazane vrijednosti su srednja vrijednost±SD. Za više grupa primijenjena su poređenja na jednosmjernoj ANOVA, n=3, ns nije značajno,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonoidiSkalirane trake za slike su 500 μm. GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja kontrolnih i ostarjelih END-MSC-a koje smo izvršili. Drugi je skup podataka za kontrolni i stari A549 preuzet sa GEO [43]. Treba napomenuti da su se uslovi koji izazivaju starenje poklopili sa onima primenjenim u ovoj studiji i u pilot studijama seno-lize izazvane srčanim glikozidima. I treći skup podataka bio je za kontrolni i senescentni IMR-90 dobijen direktno iz studije o srčanim glikozidima kao senolitičkim jedinjenjima [25]. Važno je da se pokazalo da je IMR-90 sklon analizi izazvanoj ouabainom. Treba napomenuti da bi poređenje samo dva skupa podataka relevantnih za END-MSC i A549 u konačnici dovelo do nepravilnih rezultata, jer bi se u takvoj analizi tražena razlika između procesa starenja u END-MSC-ovima i A549 ne razlikovala od varijacija posredovanih različiti tehnički efekti serije (tj. tip mašine za sekvenciranje, uslovi uzorka). Kako bismo sveli na minimum sve efekte serije, uporedili smo jedan skup podataka za ćelije otporne na ouabain (END-MSC) i dva za ćelije osjetljive na ouabain (A549, IMR-90). Da bismo potvrdili relevantnost dalje komparativne analize, izvršili smo analizu glavnih komponenti za podskup gena koji se odnosi na GO termin "ćelijsko starenje" (GO 0090398) na osnovu sažetog skupa podataka koji sadrži uzorke iz sva tri opisana eksperimenta. Zaista, za svaki tip ćelije uzorci su grupirani u dvije odvojene grupe – kontrolnu i one stare (Sl. 10d).

cistanche može protiv starenja

Da bismo izvršili analizu diferencijalno eksprimiranih gena (DEG) tokom starenja ćelija otpornih na ouabain i -osjetljivih, generirali smo statistički model koji je sumirao dva prediktora i njihovu interakciju. Šematski prikaz analize prikazan je na slici 10c. Ukratko, prvi prediktor u modelu je podijelio sve uzorke po kontrolnim i podgrupama starenja, drugi—po otpornosti na ouabain ili osjetljivosti na ouabain, a posljednja komponenta u modelu odražava interakcija oba prediktora. Rezultat testiranja diferencijalnog izraza za posljednju varijablu prikazan je u dodatnoj tabeli 1.

Zatim smo sproveli analizu obogaćivanja skupa gena (GSEA) u terminima genske ontologije (GO) za biološke procese (BP) (dodatna tabela 2). Značajno, među značajno obogaćenim procesima, otkrili smo da se 'uvoz jona kalija' i 'pozitivna regulacija transmembranskog transporta kationa povećavaju tokom starenja END-MSC-ova otpornih na ouabain u poređenju sa starenjem stanica osjetljivih na ouabain (Slika 10e). ). Liste gena za obogaćivanje jezgra koji se odnose na ove procese uključuju KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4 koji su značajno povećani u starim END-MSC (slika 10f). Proteini koje kodiraju KCNJ geni su kalijumski kanali unutrašnjeg ispravljača, koji imaju veću tendenciju da dopuste da kalijum teče u ćeliju, a ne iz ćelije.hesperidin koristiSLC12 porodica kloridnih transportera sa kationom. WNK4 gen kodira serin/treonin kinazu koja djeluje kao aktivator kotransportera hlorida vezanih za natrijum i inhibitor kotransportera hlorida vezanih za kalij. Zajedno, ovi nalazi su omogućili da se sugeriše da stari END-MSC-i mogu efikasnije da povrate osiromašene intracelularne K plus nivoe nego stare A549 ćelije i tako mogu da upravljaju ionskim disbalansom izazvanim ouabainom.

Stariji prikaz END-MSC-a je povišen

otpornost na apoptozu u poređenju sa kontrolnim, dok stari A549 nema

Uloga intracelularnog K plus in u regulaciji ćelijske smrti je dobro utvrđena [46]. Otkrivene razlike između starijih END-MSC i A549 ćelija u sposobnosti održavanja unutarćelijske K plus homeostaze potaknule su nas da uporedimo ukupnu otpornost na stres stečenu tokom starenja oba tipa ćelija. Poznato je da su egzogeni stresovi praćeni poremećajem ionske homeostaze, što dovodi do brze razmjene različitih jona, uključujući K plus između ćelije i njene okoline [46]. Ishodi stresnih uticaja u velikoj meri zavise od sposobnosti ćelija da obnove odgovarajuću intracelularnu ionsku ravnotežu. Kao što je prikazano na slici 10e,f, starenje END-MSC-ova je praćeno povećanjem regulacije K plus uvoza što sugeriše da tokom

Slika 10 Stareće END-MSC rezistentne na ouabain su u stanju da povrate poremećaj K plus/Nat homeostaze uzrokovane ouabainom putem efektivnog uvoza K plus, dok senescentnim ćelijama osetljivim na ouabain nedostaje ova sposobnost. a Određivanje membranskog potencijala kontrolnih i senescentnih END-MSC i A549 ćelija prije i 24 h nakon tretmana ouabainom, korištenjem fluorescentne sonde DiBAC4(3). b Procjena potencijala mitohondrijalne membrane kontrolnih i senescentnih END-MSC i A549 ćelija prije i 24 h nakon tretmana ouabainom, korištenjem fluorescentne sonde JC-1. c Dizajn komparativne bioinformatičke analize tri nezavisna RNA-Seq skupa podataka.d Analiza glavne komponente za podskup gena koji se odnosi na GO termin "ćelijsko starenje" (GO 0090398) na osnovu kombinovanih podataka iz tri nezavisna seta podataka RNA-Seq . Rezultati GSEA za različito eksprimirane gene između ćelija otpornih na analizu posredovanu ouabainom (END-MSC) i onih osjetljivih na analizu posredovanu ouabainom (A549 i IMR-90) za 'pozitivnu regulaciju transmembranskog transporta kationa' i „Biološki procesi uvoza jona kalijuma. f Toplotna karta koja odražava gene za obogaćivanje jezgra za biološke procese 'Pozitivne regulacije transmembranskog transporta katjona' i 'Uvoza jona kalijuma'. Vrijednosti su srednje vrijednosti±SD. Statistička značajnost procijenjena je Studentovim t-testom: ns nije značajno,*p<><><>

razvoj starenja END-MSC povećavaju svoju sposobnost vraćanja nivoa K plus. Zanimljivo je da nismo bili u mogućnosti da otkrijemo sličnu tendenciju starenja A549, pa se činilo da A549 ne dobija nikakve specifične karakteristike vezane za uvoz K* tokom progresije starenja. Prema literarnim podacima, smanjenje intracelularnog K* izazvano stresom i nemogućnost vraćanja njegovog nivoa pogoduju aktivaciji kaspaza i nukleaza i stoga se predlažu kao pro-apoptotički faktor [46].

U skladu s ovim prijedlogom, korištenjem bioinformatičke analize gornjih RNA-seq skupova podataka otkrili smo značajnu regulaciju naniže procesa povezanih s apoptozom tokom starenja END-MSC-a u poređenju sa A549 i IMR-90 (slika lla) . Štaviše, starenje A549 i IMR-90 karakteriše značajna regulacija pro-apoptotičkih gena, uključujući BAD, BAX, BOK, BAK-1 i NOXA (slika 11b). Ovi podaci ukazuju da END-MSC stiču fenotip otporan na apoptozu tokom starenja, dok su senescentni IMR-90 i A549 postali skloni apoptozi (Sl.11b). Da bismo ojačali ovo zapažanje, dodatno smo analizirali skup podataka mikromreža za kontrolne i replikativne starenje AD-MSC-a koji su takođe sačuvali rezistenciju na ouabain tokom starenja kao što je gore navedeno (Slika 4g). Kada smo analizirali nivoe ekspresije gena povezanih sa apoptozom, uočili smo različit fenotip otporan na apoptozu senescentnih AD-MSC-ova sličan onom kod senescentnih END-MSC (dodatna slika S8a,b).

Da bismo potvrdili rezultate transkriptomske analize, procijenili smo nivoe ekspresije gena povezanih sa apoptozom i uvozom K plus u oba tipa staračkih ćelija—END-MSC i A549 pomoću RT-PCR (dodatna slika S9). Dodatno, analizirali smo ekspresiju iste liste gena koristeći druge ćelijske modele otporne na ouabain i ouabain osjetljive, stare DP-MSC tretirane doksorubicinom, odnosno starenje SK-Help tretirane sa etopozidom (dodatna slika S9). Kao što je prikazano na Dodatnoj slici S9, oba tipa END-MSC-ova i DP-MSC-ova koji su senescentni na ćelije otporne na ouabain pokazali su slične obrasce ekspresije gena, konkretno KCNJ2, SLC12A i WNK4 koji su učestvovali u obnavljanju K plus su bili povećani, proapoptotički BAX je bio smanjen, dok je antiapoptotički MCL-I je bio povišen. Štaviše, obrazac ekspresije istih gena razlikovao se od onih uočenih za A549 i SK-Hep1 osjetljiv na ouabain. Ovi rezultati potvrđuju naše transkriptomske podatke i potvrđuju zaključak u vezi sa različitim profilima apoptoze stečenim tokom starenja različitih tipova ćelija.

Zatim smo testirali da li uočene razlike u pozadini apoptoze tokom starenja END-MSC i A549 mogu imati uticaj na ukupnu otpornost ćelija na stres. Da bismo to učinili, procijenili smo vitalnost stanica nakon oksidativnog stresa i staurosporina, koji se obično primjenjuje za indukciju apoptoze. Zaista, pokazalo se da su senescentni END-MSC znatno otporniji na oba napona u poređenju sa svojim kontrolnim kolegama (slika 1lc). Suprotno tome, A549 ćelije su pokazale suprotnu situaciju, jer su stare ćelije pokazivale tendenciju da budu osetljivije na ćelijsku smrt izazvanu stresom (slika 11d). Ovo zapažanje mijenja postojeću paradigmu da je povećana otpornost na smrt zajednička karakteristika bilo koje vrste starenja ćelija, pokazujući njenu očiglednu ćelijsku specifičnost.

Na osnovu gore navedenih podataka, pretpostavili smo da bi smanjenje "odbrane" apoptoze stare END-MSC trebalo da stvori povoljne uslove za dalju analizu. U tom smislu, fokusirali smo se na dobro poznatog antiapoptotičkog člana BCL-2 porodice proteina—MCL-1, budući da je njegova ekspresija povećana u senescentnim END-MSC otpornim na apoptozu (Slika 1lb i Dodatak Sl. S9a). U tu svrhu, prethodno smo tretirali kontrolne i stare END-MSC sa A-1210477 specifičnim MCL-1 inhibitorom, a zatim primijenili srčane glikozide da induciraju analizu. Treba napomenuti da sam A-1210477 nije imao uticaja na kapacitet proliferacije kontrolnih ćelija i na održivost starih, kao što je prikazano na krivuljama rasta (slika 1le). Naknadna primena srčanih glikozida dovela je do smanjenja broja živih ćelija, međutim efekat je bio izraženiji kod senescentnih ESC (Sl.11f). Stoga, inhibiranje MCL-1 sa A-1210477 predisponira starenje ESC-a ka smrti izazvanoj ouabainom, što ukazuje na analizu. Potonji dokaz za otpornost na apoptozu stečen tokom starenja END-MSC-a predstavlja suštinsku barijeru za efikasnu analizu koju pokreću srčani glikozidi.

Diskusija

U okviru ove studije testirali smo senolitičke efekte srčanih glikozida, odnosno ouabaina i bufalina, na hMSC. Nedavno je utvrđeno da oba jedinjenja imaju selektivni citotoksični efekat na starenje ćelija (modeli starenja izazvane onkogenom/terapijom) različitog porekla, uključujući primarne ćelije IMR-90,HUVEC, ARPE-19,T/ C-28 i ćelije raka SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26].Neočekivano, mi nisu mogli otkriti nikakve preferencijalne citotoksične efekte ni ouabaina ni bufalina na stare END-MSC u odnosu na kontrolne. Važno je da je odsustvo analize potvrđeno korištenjem hMSC-a dobivenih iz masnog tkiva, zubne pulpe i Wartonovog želea, te različitih modela starenja. Potonje nas je dovelo do sugestije da bi otpornost na analizu izazvanu srčanim glikozidima mogla biti zajednička karakteristika hMSC-a. U isto vrijeme, uspjeli smo inducirati apoptozu prvenstveno kod senescentnog A549 i SK-Helpa, reproducirajući senolitički učinak srčanih glikozida opisanih u relevantnim člancima [25,26]. S dostupnim ćelijama otpornim i osjetljivim na analizu izazvanu ouabainom (rezistentna na ouabain/ouabain-osjetljiva), pokušali smo razjasniti osnovne uzroke ove razlike. Uobičajeni molekularni mehanizam djelovanja srčanih glikozida je vezivanje za Nat/K plus -ATPazu i blokiranje njene aktivnosti. Hidrolizom ATP-a ovaj enzim osigurava pumpanje Na plus iz ćelije i uvoz K plus u ćelije i na taj način održava fiziološki elektrohemijski gradijent, ionsku homeostazu, ćelijski pH i volumen ćelije koji su neophodni za opstanak i funkcionisanje ćelije [47]. Stoga smo spekulirali da bi senolitička sposobnost ouabaina mogla ovisiti o ozbiljnosti K plus/Nat disbalansa u tretiranim stanicama. U skladu s ovom sugestijom, otkrili smo da je ouabain inducirao izraženiju depolarizaciju plazma membrane i pad MMP u senescentu A549 osjetljivom na uabain.

Uopšteno govoreći, pokazalo se da je uticaj inhibicije Nat/K plus -ATPaze na preživljavanje ćelija specifičan za tip ćelije. Na primjer, pokazalo se da ouabain potencira apoptozu u limfocitima, Jurkat stanicama i epitelnim stanicama pasa, dok nije uspio inducirati smrt u epitelnim stanicama iz aorte štakora, stanica cerebralnih granula pacova i proksimalnih tubularnih LLC-PK1 limfocita svinjske bubrege usprkos sličnoj modulaciji. kationskog omjera [48-54]. Jedan od predloženih mehanizama proapoptotičkog djelovanja ouabaina je iscrpljivanje intracelularnog što pogoduje apoptotičkom skupljanju, aktivaciji kaspaza i započinjanju apoptotičkog programiranja [46, 47]. Uzimajući u obzir uporedivi gubitak K plus, ali suprotan efekat na indukciju smrti dobijen za modele otporne na ouabain i na ouabain osjetljive, predložili smo razlike u kompenzacijskim sistemima katjona. Pad intracelularnog K plus nivoa bi u suštini trebalo da dovede do aktivacije uvoza K plus iz ekstracelularnog prostora kako bi se nadoknadio nedostatak ovog kationa. Stoga, efikasnost K plus restauracije može biti u osnovi predispozicije za apoptozu nakon liječenja ouabainom. Da bismo testirali ovu sugestiju, primijenili smo kompleksnu bioinformatičku analizu upoređujući promjene u transkriptomskim potpisima tokom starenja ćelija otpornih na ouabain (END-MSC) i ćelija osjetljivih na ouabain (A549 i IMR-90). Uočili smo snažnu regulaciju procesa vezanih za uvoz jona kalijuma tokom starenja END-MSC, dok su tokom starenja A549 i IMR{18}} osjetljivih na oua-bain ovi procesi ostali nepromijenjeni ili čak smanjeni. Na osnovu toga možemo spekulisati da se END-MSC-ovi koji se staraju mogu efikasno da se nose sa smanjenjem K plus izazvanim ouabainom preko sistema aktivnog uvoza katjona, koji sprečava indukciju apoptoze. Suprotno tome, stari A549 i IMR-90 osjetljivi na naš bain izgleda da su manje sposobni da prevladaju gubitak K plus, pa su stoga skloni apoptozi. U korist ove pretpostavke, ouabain je inducirao značajniju depolarizaciju plazma i mitohondrijalnih membrana u stare A549 ćelije, pokazujući izražen ionski disbalans tipičan za umiruće ćelije.

Umjesto da bude jedinstvena karakteristika apoptoze izazvane ouabainom, pad intracelularnog K plus sadržaja je vjerovatno uobičajena karakteristika apoptotske smrti izazvane različitim stresovima, npr. tretmanom staurosporinom i oksidativnim stresom [46]. Shodno tome, smanjena sposobnost starenja A549 da obnovi citoplazmatski K plus bi u konačnici trebala dovesti do pada ukupne otpornosti na stres. Međutim, ovaj pojam je u suprotnosti sa modernom definicijom ćelijskog starenja, koja kaže da su starenje ćelije visoko otporne na apoptozu [16]. Posebno treba naglasiti da je povećana otpornost na apoptozu bila osnova za razvoj analitike [16, 17].

Prvi spomen povećane otpornosti ćelija na stres datira iz 1995. godine kada je utvrđeno da su replikativni senescentni fibroblasti otporniji na povlačenje seruma u odnosu na kontrolne [55]. Ovu početnu studiju pratio je ograničen broj istraživanja koja su pokazala da su stare ćelije otpornije na UV-svjetlo, staurosporin, tapsigargin i druge stresove od njihovih proliferirajućih kolega [56, 57]. Međutim, daleko smo od toga da smo prvi koji su postavili pitanje povećane otpornosti na apoptozu kao općeg obilježja senescentnih stanica. Tako je u pregledu objavljenom 2003. godine objavljeno da "...otpornost na apoptozu nije opšta karakteristika starejućih ćelija, koje takođe mogu biti sklone apoptotici u zavisnosti od tipa ćelije i apoptotičkih stimulansa..."[58]. Zaista, nekoliko podataka je pokazalo veću osjetljivost staračkih ćelija na apoptozu izazvanu stresom nego kontrolnih ćelija [59-61]. Na primjer, stare HUVEC su sklonije apoptozi izazvanoj oksidiranim LDL ili TNFa u poređenju sa kontrolnim stanicama[61]. Unatoč očiglednoj kontroverzi, posljednja sumnja pojavila se 2015. i zvučala je ovako: "Čini se sumnjivim da je globalna otpornost na apoptozu opća karakteristika stanica starenja"[62]. Iste godine objavljena je prva studija koja je otkrila analizu [16 ]. U okviru ove studije, autori su istakli povećanu ekspresiju genskih mreža za preživljavanje u ostarjelim stanicama što je doprinijelo njihovoj pojačanoj otpornosti na apoptozu. Stoga su u početku senolitici predstavljali lijekove za ciljanje proteina koji štite stare stanice od apoptoze. Otkriće analitike zajedno sa impresivnim rezultatima uklanjanja starih ćelija pomoću INK-ATTAC transgenih miševa pokrenulo je niz studija u potrazi za novim spojevima s hemolitičkom aktivnošću [16-26,63]. U posljednje dvije godine objavljeno je dosta recenzija o analitici [13-15,64-66]. Međutim, od 2015. povećana otpornost stanica na apoptozu nije bila predmet rasprave, iako, u stvari, nije testirana u okviru ovih studija.

Zanimljivo je da upoređujući transkriptomske potpise ćelija otpornih na ouabain (END-MSC) i ćelija osjetljivih na ouabain (A549 i IMR-90), otkrili smo da je samo starenje END-MSC praćeno stjecanjem vidljivih anti-apoptotički profil. Naprotiv, starenje A549 i IMR-90 karakteriše značajna regulacija pro-apoptotičkih gena, uključujući BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA, i tako dalje. Važno je da su ovi rezultati prošireni upotrebom drugih DP-MSC ćelija otpornih na ouabatin. S jedne strane, ovi rezultati pružaju dodatno molekularno objašnjenje za odsustvo analize izazvane ouabainom u hMSC-ima, a s druge strane jasno pokazuju da A459 i IMR-90 postaju predisponirani na apoptozu tokom starenja. Napominjemo da su se naši podaci o transkriptomskim promjenama u genima povezanim s apoptozom u senescentnom IMR-90 poklopili s rezultatima predstavljenim, ali o kojima se još nije raspravljalo, u članku koji su objavili Guerrero et al., kao skupovi podataka za kontrolni i senescentni IMR{ {19}} ćelije potiču iz ove studije [25]. Precizna analiza toplotne mape koja je data u okviru ove studije otkrila je povećanu regulaciju BAX, BAD, BAD, BAKI i NOXA u starijoj IMR-90 u odnosu na kontrolne ćelije. Nadalje, Baar et al. također je otkrio "neočekivanu" regulaciju proapoptotičkih i snižavanje antiapoptotičkih gena u senescentnom IMR-90, navodeći da se senescentni IMR-90 treba pripremiti da se podvrgne apoptozi [21].

Da bismo pojačali naše zapažanje, uporedili smo otpor kontrolnih i senescentnih END-MSC-a i A459 sa najčešćim stimulans-oksidativnim stresom koji indukuje apoptozu i staurosporinom. Prema rezultatima naše bioinformatičke analize, pokazalo se da su senescentni END-MSC daleko otporniji na stres od kontrolnih ćelija. U isto vrijeme, stari A549 pokazao je suprotnu reakciju koja je nešto osjetljivija od kontrolnih stanica na obje vrste stresnih stimulansa. Stoga bi senolitičko djelovanje srčanih glikozida, barem za A549, moglo biti posredovano predispozicijom senescentnih stanica ovog porijekla na apoptozu u poređenju sa njihovim kontrolnim kolegama, dok bi se odsustvo senolize izazvane ouabainom u hMSC-ima moglo objasniti povećanjem ukupna apoptotska rezistencija tokom starenja ovih ćelija. Štaviše, slabljenje "antiapoptotske odbrane" inhibicijom MCL-1 predisponira END-MSC na senolizu izazvanu srčanim glikozidima. Iako smo uspjeli postići željenu senolizu END-MSC inhibicijom MCL-1, strategija za modulaciju ekspresije konkretnih anti-apoptotičkih gena da predisponira stare hMSC na senolizu ne izgleda mnogo obećavajuće, jer ekspresija dinamika konkretnih anti- ili pro-apoptotičkih gena može se razlikovati između ćelija različitog porijekla. Vjerujemo da je za rezistenciju na ouabain odgovorno sticanje takozvanog "anti-apoptotičkog" profila tokom starenja ćelije, a ne promjene u konkretnim anti- ili pro-apoptotičkim genima, s tim u vezi mogućnost promjene cijelog profila može izgleda razumnije.

Naši zaključci koji ističu otpornost na apoptozu stečenu tokom starenja hMSC-a kao intrinzičnu barijeru za efikasnu analizu mogli bi se proširiti daleko izvan srčanih glikozida. Posebno je utvrđeno da su senescentni hMSC otporni na druga senolitička jedinjenja. Zaista, analizom postojećih dokaza otkrili smo da različita jedinjenja sa navedenom senolitičkom aktivnošću, uključujući navitoklaks, nikotinamid ribozid, danazol geldanamicin, ganetespib, fisetin, BCL-XL inhibitore, kvercetin, etomoksir, antimicin A, FOXO4-DRI ,17-DMAG se pokazao neefikasnim za ciljano uklanjanje starih ljudskih preadipocita (ćelija prekursora sličnih fibroblastima izvedenih iz ljudskog masnog tkiva) i hMSC-a iz koštane srži [17-19, 36, 40]. Podaci o odsustvu analize u hMSC-ima donekle su u suprotnosti sa inspirativnim rezultatima dobijenim korišćenjem in vivo modela miševa, pokazujući pozitivne rezultate sistemske primene analitike [37, 38]. Na primjer, pokazano je da čišćenje matičnih stanica žlijezde pljuvačne u starijoj dobi pomoću ABT263 može spriječiti kserostomiju izazvanu radioterapijom [38]. Nadalje, uklanjanje MSC-a iz koštane srži koji se stare kvercetin poboljšava formiranje koštane srži [37]. Važno je da je pokazano da senescentni miševi i MSC pacova za razliku od hMSC reaguju na analitiku. Na primjer, kvercetin, kvercetin-kalaj＋dasatinib i ABT263 značajno su uklonili stare MSC miševa [16]. Također, pokazalo se da 17-DMAG u velikoj mjeri smanjuje starenje bmMSC u progeroidnom modelu miša [19]. Stoga se spekuliše da su poboljšanja u funkcionisanju različitih organa i sistema opisana u ovim studijama posledica ciljanog uklanjanja ostarelih mišjih matičnih ćelija. Međutim, ove analize još nisu pokazale nikakvo funkcionalno podmlađivanje hMSC-a. Ovakva očigledna razlika između odziva miševa i ljudskih MSC-a na analizu sugerira da poboljšanja od senolitičke terapije možda neće biti sačuvana među vrstama. Rezultati dobijeni za senolitičko jedinjenje UBX0101 mogu se smatrati dobrom ilustracijom koja potvrđuje posljednju tvrdnju. Pokazalo se da ovaj agens čisti starenje stanica na mišjem modelu osteoartritisa, što je značajno smanjilo bol i promoviralo popravak oštećene hrskavice [20]. Nažalost, UBX0101 nije uspio da ublaži progresiju bolesti i bol kod pacijenata sa umjerenim bolnim osteoartritisom tokom faze II kliničkih ispitivanja [67-69]. Slične zabrinutosti izazivaju senolitička kombinacija dasatinib ＋querce-tin[68].

Ukratko, iz dobijenih podataka proizilaze dva važna zaključka. Prvi je pokazao da srčani glikozidi nisu u stanju očistiti senescentni hMSC. Odsustvo analize moglo bi biti posredovano efikasnim K plus ćelijskim uvozom i povećanom otpornošću na apoptozu u senescentnim hMSC-ima. Potonje je fundamentalnije i otkriva da otpornost na apoptozu nije opća karakteristika starejućih ćelija, jer tokom starenja neke ćelije dobijaju fenotip 'otporan na apoptozu', dok druge ne. Važno je da samo stare A549 ćelije sklone apoptozi mogu biti efikasno očišćene srčanim glikozidima. Na osnovu toga možemo spekulisati da bi efikasnost drugih senolitičkih pristupa mogla zavisiti od toga da li su stare ćelije zaista otporne na apoptozu u poređenju sa svojim kolegama koji se razmnožavaju. Konačno, iako je 'analitika' vruća tema i mnogo inspirativnih podataka se objavljuje, zaključke o djelotvornosti analize treba donositi s oprezom jer heterogenost ćelijskog starenja i dalje ostaje 'zagonetka'.

Ovaj članak je preuzet iz Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x