Suzbijanje oštećenja bubrega povezanog s upalom nakon transplantacije korištenjem novog PrC-210 čistača slobodnih radikala kod pacova
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2,Maya M. Coumbe Gitter3i William E. Fahl1,3,*
sažetak:
Alograftbubregtransplantaciju, koja pokreće ćelijski i antitijelo posredovano odbacivanje domaćinabubreg, je glavni faktor koji doprinosi oštećenju bubrega tokom transplantacije. Ovdje smo pitali da li će PRC-210 suzbiti oštećenja uočena u transplantaciji bubrega alografta. Bubrezi Brown Norway (BN) pacova su perfuzirani in situ (UW rastvor) sa ili bez dodatka 30 mM PrC-210 i zatim odmah transplantirani u Lewis (LEW) pacove. 20 h kasnije analizirani su transplantirani BN bubrezi i LEWrat plazma.Bubreghistologija, i nivoi nekoliko citokina povezanih s upalom u bubrezima/serumu, mjereni su kako bi se procijenila patologija bubrega povezana s neusklađenošću i PrC{2}}zaštitna efikasnost. Dvadeset sati nakon transplantacije alografta: (i) značajno histološko oštećenje bubrežnih tubula i infiltracija mononuklearnih inflamatornih ćelija uočeno je u bubrezima alografta; (ii)bubregmetrika funkcija (kreatinin i BUN) bila je značajno povišena; (iii) uočene su značajne promjene ključnih citokina, tj. TIMP-1, TNF-alfa i MIP-3A/CCL20, te nivoa kaspaze aktivirane bubrezima. U PRC-210-tretiranim bubrezima i pacovima primaocima, (i) histološko oštećenje bubrega (Banffovi rezultati) i mononuklearna infiltracija su smanjeni na neliječene pozadinske nivoe; (ii) kreatinin i BUN su značajno smanjeni; i (iii) aktivirane promjene kaspaze i citokina su značajno smanjene, neke u pozadini. Zaključno, rezultati sugeriraju da bi PrC-210 mogao pružiti široko primjenjivu zaštitu organa za mnoge uslove transplantacije alografta; mogao bi zaštititi presađene bubrege tokom i nakon svih faza procesa transplantacije – od donacije organa, preko transporta, ponovne implantacije i postoperativne upale – kako bi se akutno i kronično odbacivanje svelo na minimum.
Keywords: bubregalograft; odbacivanje bubrega; ishemija
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
maca ginseng cistanche
1. Uvod
Završna bubrežna insuficijencija uzrokuje više od 1,2 miliona smrtnih slučajeva godišnje širom svijeta [1].Bubregtransplantacija je poželjna terapija za pacijente sa završnom stadijumom bubrežne bolesti. Preko 90,000 transplantacija bubrega se radi svake godine širom svijeta.
Sam proces transplantacije izaziva značajne povrede ćelija i organabubreg, što smanjuje dugotrajno preživljavanje organa. Tri primarne uvrede za bubreg tokom transplantacije alografta su (i) oštećenje izazvano reaktivnim kiseonikom i vrstama azota (ROS i RNS) tokom hladne ishemije ('hladno skladištenje) [2], (ii) oštećenje izazvano ROS nakon implantacije ('reperfuziona ozljeda') [3], i (iii) upala nakon transplantacije, koja pokreće urođeni imunološki odgovor i odbacivanje posredovano antitijelima (ABMR) [4].
Neutrofili i makrofagi migriraju u oštećeni transplant u roku od 6 h od reperfuzije i stimuliraju sintezu hemokina u rezidentnim dendritskim stanicama koje zatim aktiviraju T limfocite i regrutuju adaptivne imunološke stanice. Jednom kada se ove imunološke stanice infiltriraju u epitelne stanice proksimalnih tubula, proizvode mijeloperoksidazu u neutrofilima i nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidazu u makrofagima, a obje doprinose lokalnoj proizvodnji slobodnih radikala. Ovi upalni procesi dovode do aktivacije puta komplementa i daljeg remodeliranja i lize stanica ububregalograft [5].ABMR može nastati kao rezultat jednog ili oba prethodno formiranog aloantitijela protiv transplantata ili kroz de novo razvoj donorskog specifičnog antitijela (dnDSA) [5–7]. Akutni (min/dani), koji prelazi u kronični (dani/tjedni), upalni odgovor unutar alograftnog bubrega, s kontinuiranom proizvodnjom ROS-a i upalnih citokina, može uspostaviti ozbiljan, samo-perpetuirajući odgovor koji uzrokujebubregzatajenje organa.
Kako bi bolje razumjeli ćelijske i molekularne puteve uključene u patogenezububregupalu i odbacivanje alografta, razvili smo i okarakterizirali model štakora koji replicira većinu kliničkih kriterija urođenog imunološkog odgovora, ABMR-a i gubitka organa bubrega [8]. Ovaj model je korišten za procjenu brojnih novih post-alografskih strategija transplantacije.
Dva trenutno priznata pristupa za smanjenje akutnog i dugoročnog imunološkog odgovora nabubregalograft su: (i) za povećanje šanse za pronalaženje unakrsnog donora i (ii) za uklanjanje već postojećih antitijela protivbubregalograft koristeći protokole desenzibilizacije [9,10].
U radu opisanom u ovom rukopisu, pitali smo se da li bi treći pristup za suzbijanje akutne i dugotrajnije težine upale bio koristan. Primijenili smo hvatač slobodnih radikala trenutnog djelovanja, PRC-210, oba na implantirani alograftbubregi štakoru primaocu, kako bi se utvrdilo da li se oštećenje ROS-a povezano sa upalom može potisnuti. Iako koncept suzbijanja ROSin-a povezanih s upalombubregtransplantacija nije nova, ovdje se koristi novi PRC-210 ROSscavenger koji trenutno djeluje. I trenutno i kronično čišćenje i inaktivacija upale koja stvara i stvara slobodne radikale unutar novotransplantiranog alograftabubregwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95 posto oštećenja DNK u nezaštićenim kontrolama [16]. U dvije prethodne studije o transplantaciji bubrega kod glodara [16,17], pokazalo se da PRC-210 suzbija oštećenje bubrega izazvano ROS-om izazvano tokom (i) 30-satnog skladištenja na hladnom [17] i (ii) reperfuzijske ozljede nakon implantacije [16 ] na pozadinske nivoe, čime su uklonjena dva značajna izvora povrede transplantiranih bubrega. Takođe se pokazalo da molekul PRC-210 potiskuje povrede izazvane slobodnim radikalima u nekoliko drugih postavki organa [15,18]. Stoga smo pretpostavili da bi PrC-210 također trebao biti u stanju zaštititi alograft od oksidativnog stresa koji nastaje OBA (i) ćelijskim i (ii) procesima odbacivanja posredovanih antitijelima koji proizvode slobodne radikale kao nusproizvod.
Da bismo istražili ovu hipotezu, razvili smo novi model štakora koji je izbjegao indukciju velikih ishemijskih i reperfuzijskih događaja i davao PrC-210 i prije i nakon implantacije. Bubrezi smeđih pacova su isprani UW rastvorom koji sadrži PrC-210 i odmah transplantirani u singene Lewis pacove primaoce. Hladno ishemijsko vrijeme je praktično eliminirano. Odmah sljedeći implantat, a nakon toga 8 hbubregimplantata, pacovi primaoci primali su sistemske PrC{0}} injekcije u dozama koje bi omogućile kontinuirano uklanjanje slobodnih radikala unutar transplantiranogbubreg. Transplantirani bubrezi i krvna plazma su zatim sakupljeni 20 sati nakon transplantacije kako bi se omogućilo mjerenje i PrC-210-dodijeljenog (i) supresije nusprodukata upale i (ii)bubregzaštita.
maca ginseng cistanche
2. Materijali i metode
2.1. Životinje
Odrasli (200-250 g) mužjaci pacova Lewis i BN kupljeni su od Envigo (Indian-Napolis, IN, SAD) i smješteni u objektu za njegu životinja na Univerzitetu Wisconsin u Madisonu, WI, SAD. Sve procedure su obavljene u skladu sa Politikom njege i upotrebe životinja na Univerzitetu Wisconsin. Održavanje zdravlja životinja, uključujući uginuće životinja, sobnu temperaturu, cikluse svjetla/mraka od 12 h i čišćenje kaveza, između ostalih sanitarnih obaveza, obavljalo je svakodnevno osoblje za brigu o životinjama. Hrana i voda bili su dostupni ad libitum. Ovo istraživanje je prospektivno odobreno od strane Medicinskog fakulteta i Odbora za njegu i korištenje životinja u institucijama javnog zdravlja na Univerzitetu Wisconsin (Protokol za životinje #M005204). Sve grupe su sadržavale 4-6 životinja.
2.2. Materijali
Sinteza PrC-210 HCl aminotiola, pretkliničke molekule, opisana je odvojeno [19,20]. PrC-210 HCl kristali (3-(metilamino)-2-(metil monometil)propan-1- tiol) se čuvaju u atmosferi azota na -20 ◦C, pa čak i rutinski odmrzavanje, korištenje i ponovno skladištenje, kristalni PrC-210 je potpuno stabilan više od 4 godine prema analizi masene spektrometrije. Ostali hemijski reagensi su nabavljeni od Sigma Aldrich (St. Louis, MO, SAD). UW Organ Preservation Solution je kupljen od Bridge to Life, Columbia, SC, SAD.
2.3. Hirurški i eksperimentalni postupak
Procedura transplantacije korištena u ovim eksperimentima prikazana je na slici 1. Kod štakora donora BN, nakon dvostruke ligacije aorte, podvezivanja desne bubrežne arterije i vene i hirurškog preseka lijeve bubrežne vene, lijevi štakorbubregje perfuziran in situ koristeći 5 mL UW rastvora na sobnoj temperaturi (u periodu od 15 s). Perfuzat je bio ili sam UW otopina (za grupe "0 h" i "20 h bez tretmana"), ili UW otopina kojoj kristalni PrC-210, da se postigne 30 mM [17], dodat je, odmah rastvoren, a zatim pH podešen na početni pH rastvora UW od 7,4 dodavanjem 0,0619 µL 5N NaOH po µmolu PrC-210 HCL soli (FW: 220). Poluživot PrC-210 tiola (aktivni oblik) je približno 3,5 h u fiziološkim pH otopinama kao što je UW otopina i ljudska krv [14]. Nakon in situ perfuzije, lijevi BNbubregje hirurški odstranjen, a zatim zašiven tupom anastomozom krvnih žila i uretera na oslobođeno mjesto lijevog bubrega pacova primaoca LEW. Pravi LEWbubregje podvezan i uklonjen neposredno prije. Pet minuta nakon hirurškog zatvaranja LEW štakora, štakor je primio sistemsku dozu PrC{{0}} (121 ug PrC-210 HCl po gm tjelesne težine, što je jednako 0.24 X Maximum Tolerated Dose) intraperitonealnom injekcijom. Kao što je prikazano na šemi na slici 1, pacov je takođe primio intraperitonealne injekcije PrC-210 (0,24 MTD) u plus 4 h i plus 8 h nakon transplantacije. Pacovi su eutanazirani plus 20 h nakon transplantacije, ibubrezia uzorci plazme su prikupljeni za analizu. U svakoj tretiranoj grupi bilo je najmanje pet pacova.
2.4. Serum BUN i mjerenja kreatinina
BUN i kreatinin su mjereni u uzorcima seruma korištenjem Catalyst One AnalyzerTechnology (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA).
2.5. Enzimski Imunosorbentni testovi
Testovi su izvedeni kako je opisano u protokolima ELISA kompleta (Pacov TIMP-1, Cat# RTM- 100; Rat MIP3-A, Cat# DY540; Pacov TNF-alpha, Cat# RTA{ {5}}; R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD). Ukratko, razblaženja plazme štakora dodata su u prethodno obložene ploče, inkubirana 2 h na 37°C. Zatim su dodana antitijela konjugirana biotinom, specifična za analizirani protein, i inkubirana 1 h na 37°C, isprana, konjugirana s avidinom. dodana je peroksidaza hrena, nakon čega je uslijedilo ispiranje i dodavanje TMB supstrata. Reakcija je inkubirana 10-30 min, zaustavljena sa sumpornom kiselinom i očitana na 450 nm.
2.6. Proteome Profiler Rat Cytokine Array
Testovi su izvedeni u osnovi kako je opisano u protokolu proizvoda. Ukratko, plazma je inkubirana sa nitroceluloznim membranama uočenim antitijelima za hvatanje i kontrolu. Nakon inkubacije, membrane su isprane i inkubirane sa streptavidinom HRP. U odstupanju od protokola, koristili smo SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, SAD; Cat# 34094) za hemiluminiscentnu detekciju, jer je davao jači signal. Mrlje su vizualizirane na FotoDyne gel doc sistemu.
2.7. Histologija
fiksiran u formalinu (10 posto formalina), ugrađen u parafin,bubreziizrezani su na dijelove od 5 um. Stakalca su deparafinizovana, rehidrirana iz ksilena kroz seriju stepenovanog etanola u vodu, a zatim tretirana kao što je opisano u nastavku. Slajdovi su skenirani pomoću cilja 20- u Aperio skeneru slajdova za digitalnu patologiju. Sve H&E slajdove pregledao je dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, patolog za transplantaciju i ocijenili za PTC, glomerulitis (g), vaskulitis (v)/intimalni arteritis, intersticijsku upalu (I) i C4d bojenje, prema Banff 2009. [21].
Zasebno, slajdovima je dodijeljen zaslijepljen broj, a digitalne slike bubrežnih tubula koje se ne preklapaju su snimljene na interfejsu između medule i korteksa sa svakog H/E slajda. Vodilo se računa da se ne uključe veliki lumen krvnih sudova i glomeruli. Automatska kvantifikacija crvenih i plavih piksela u svakom 10-bubregslika je izvedena korišćenjem prilagođenog makroa napisanog u softveru ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
pristupljeno 13. aprila 2021.). Crveni pikseli reflektirali su proksimalnu debljinu cijevi uključujući ivicu četkice. Nukleusi su kvantificirani u plavom kanalu. Odnos plavih nuklearnih piksela i crvenih tubula dao je ocjenu upalne infiltracije za infiltraciju bijelih krvnih stanica nakon transplantacijebubrezi. Rezultati su usrednjeni i iscrtani pomoću Graphpad Prism.
2.8. Aktivnost enzima aktivirane kaspaze
Aktivirana aktivnost kaspaze 3 i 7 ububregsupernati homogenata određivani su korištenjem Apo-ONE fluorescentnog supstrata (Promega, Madison, WI, SAD) [16]. Ukratko, odmrznutobubrezipomiješani su sa 8-višestrukim viškom pufera za lizu koji sadrži 50 mM Na HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 posto glicerola i homogenizirani na 4 O C 30 s pomoću Omni tkivnog homogenizatora . Homogenat bubrega je centrifugiran na 4°C (16,000- g) u Eppendorf mikrofugi 20 min. Supernati su odmah ispitani na aktivnost kaspaze i sadržaj proteina po Bradford metodi koristeći goveđi serum albumin kao standard. Test aktivirane kaspaze izveden je na sljedeći način: 5 uL supernata (~40 ug supernata proteina) je razrijeđeno do ukupne zapremine od 50 uL sa gornjim puferom za lizu, pomiješano je sa 50 uL nerazrijeđenog Apo-ONE supstrata u jažici crne, neprozirne ploče sa 96 jažica za pokretanje reakcije od 60 minuta. Ploče su mućkane na 200 RPM na 37 O C tokom 60 min. Cepanje peptida supstrata DEVD kaspaze je mereno korišćenjem BMG Clariostar fluorescentnog čitača ploča na talasnoj dužini ekscitacije od 499 nm i talasnoj dužini emisije od 521 nm. Standard kaspaze je uključen u svaki eksperiment.
2.9. Mitohondrije bubrega pacova
Prečišćena mitohondrijska frakcija je pripremljena od homogenizovanog pacovabubrezistandardnom tehnikom centrifugiranja [22]. Prečišćene mitohondrije su suspendovane u 0.15 M Tris HCl puferu, pH 7,4.
Da bismo utvrdili da li dodavanje egzogenog PrC{{0}} potiskuje fragmentaciju mitohondrijske DNK izazvanu ROS-om [22], u reakcijskoj zapremini od 25 uL (u PCR epruveti), dodali smo: 1{{29} } uL pročišćenih mitohondrija, 5 uL PrC-210 razblaženja ili vode (PrC-210 je dodan 10 minuta prije Fe plus plus plus ADP plus H2O2 ●OH generatora), i 10 uL koji sadrži FeCl2 (2,5 mM; FW:127), adenozin 5′-difosfat natrijum (10 mM; FW: 427) i H2O2 (0,003 posto konačne koncentracije). Nakon 20 min na 37°C, 10 uL reakcije je pomiješano sa 5 uL 6- boje za punjenje gela koja sadrži 0,3 posto SDS; epruvete su stajale u vodi na 60 °C 1 min, 10 ul je zatim stavljeno u bunar sa 1% agaroznog TAE gela, a nakon 60 minuta na 60 volti, gelovi su obojeni i fotografisani. Urađeno je najmanje tri ponavljanja za svaku tačku analize kako bi se omogućilo statističko poređenje.
2.10. Statistička analiza
Podaci su izraženi kao srednja vrijednost plus /一 STD. Studentovi t-testovi su korišteni za određivanje statističke razlike i p vrijednosti pomoću softvera GraphPad Prism 7.03. p-vrijednosti manje od 0,05 smatrane su značajnim.
3. Rezultati
3.1. PrC-210 supresija patologije bubrežnog alografta
20 h nakon transplantacije, histologija transplantiranog BNbubrezi(Slika 2A-D) tretirana samo UW rastvorom jasno je pokazala povećane Banffove rezultate za tubulitis i peritubularni kapilaritis (crvene i žute strelice); zbrojeni rezultati patologije prikazani su na panelu E. BNbubreziperfuziran PrC{{0}}koji sadrži UW otopinu i primanje postimplantacijskih intraperitonealnih sistemskih doza PrC-210 (slika 2D) pokazao je jasno potisnutu inflamatornu patologiju bubrega i potisnutu Banffovu ocenu za tubulitis i peritubularne kapilaritis jednak Banffovim rezultatima kontrolne BN grupe "0 h" (Slika 2E). Primjena PrC-210 dovela je do značajnog smanjenja markera oštećenja bubrega i kreatina (p=0.032) i BUN (p=0.046).
3.2. Nivoi aktivirane kaspaze u bubrezima nakon transplantacije
Nivoi aktivirane kaspaze u BNbubreghomogenati su značajno smanjeni u BN alograftububrezikoji nisu bili izloženi tretmanu PrC{{0}} tokom 20 sati nakon transplantacije (Slika 5). Perfuzija BN bubrega sa PrC-210-koji sadrži UW otopinu i transplantacija u Lewis pacove koji su primili sistemske doze PrC-210 rezultirali su istom aktiviranom aktivnošću kaspaze kao i kod kontrolnih bubrega "0 h".
3.3. Nivoi inflamatornih citokina nakon BN bubrežnog alografta
U eksperimentima skrininga,bubreghomogenat supernata iz 0 h kontrola i 20 h bez tretmanabubrezisu pregledani sa Proteome Profiler 29 citokinskim nizom da bi se otkrili izmijenjeni nivoi ekspresije citokina i hemokina povezani sa upalom 20 h nakon transplantacije. Kao što je prikazano na dva umetka na slici 6, promjene su uočene u TIMP-1, TNF-alpha i MIP-3a/CCL20. Pojedinačne ELISA ploče su zatim korištene za kvantifikaciju ovih promjena u homogenatima bubrega i serumima, sada uključujući i pacove tretirane PrC-210. Nivoi TIMP-1 i TNF-alfa su povećani 20 h nakon transplantacije, au oba slučaja, njihovi nivoi su smanjeni u prisustvu PrC-210 (Slika 6A-C). Nivoi MIP-3a/CCL20 su povećani nakon 20 sati, ali su se povećali značajno više kod pacova tretiranih PrC{19}} (slika 6D).
3.4. PrC-210 Zaštita mitohondrija bubrega pacova
Održana mitohondrijska funkcija tokom i nakonbubregtransplantacija je neophodna za preživljavanje presađenog organa. ROS koji nastaje tijekom ishemije povezane s transplantacijom, ishemija-reperfuzije i postimplantacijske upale mogu utjecati na performanse mitohondrija bubrega i preživljavanje. Zbog važne mitohondrijalne uloge, izolovali smo mitohondrije iz bubrega pacova i utvrdili da li PrC-210 u dostižnim farmakološkim koncentracijama može zaštititi ove organele od inzulta ROS.
Na slici 7, pročišćeni pacovbubregmitohondrije su inkubirane sa ●OH generatorom [23]. Nakon kratke reakcije, vidjeli smo značajnu fragmentaciju ROS mitohondrijalne DNK bubrega pacova. Nakon inzulta ROS-a, alikvot mitohondrija je solubiliziran u puferu za punjenje gela koji sadrži SDS, a mitohondrijska DNK je odvojena i "dimenzionirana" pomoću hromatografije na agaroznom gelu (Slika 7). Uvreda ROS-a jasno je smanjila srednju veličinu mitohondrijske DNK bubrega štakora (traka b), a dodavanje PrC-210 u mitohondrije spriječilo je lomljenje DNK (trake c–g) u PrC-210 način ovisan o koncentraciji.
maca ginseng cistanche
4. Diskusija
Alograftbubregtransplantacija, koja izaziva odbacivanje bubrega posredovano ćelijama domaćina i antitijelima, glavni je doprinos kratkoročnom i dugoročnombubregoštećenje tokom transplantacije, a povezana funkcija odgođenog grafta se vidi u do 50 posto transplantiranih bubrega. Poduzeli smo ovu studiju kako bismo utvrdili da li bi PrC-210 bio efikasan u suzbijanju ozbiljnosti oštećenja izazvanog nakon transplantacije bubrega alograftom na modelu štakora koji u velikoj mjeri eliminira ishemijsko vrijeme transplantacije i povezan oksidativni stres. Naša pretpostavka je bila da bi nam ovaj pristup trebao omogućiti da vidimo uticaj PrC-210 na inzult inflamacije nakon transplantacije uz minimalnu interferenciju ishemije.
Povećanje TNF-alfa i značajna mononuklearna infiltracija pokazuju da transplantacija bubrega alograftom izaziva izraženu akutnu upalu 20 h nakon transplantacije, a to je u korelaciji s oštećenjem tubularnih stanica bubrega uočeno ububreghistologija (Banff Scores). TNF-alfa uglavnom proizvode aktivirani makrofagi i protein je ćelijske signalizacije uključen u akutnu upalu. Usko je povezan s patogenezom akutnog i kroničnog odbacivanja alografta [24].
Za razliku od gornjih nalaza kod neliječenog BNbubrezi, PrC-210 dat kao dio UW otopine i sistemski primijenjen pacovima nakon transplantacije smanjio je i nivo TNF-alfa i infiltraciju bubrega mononuklearnim ćelijama, što su oba znaka smanjene akutne upale. PrC-210 je smanjio oštećenje bubrega kao što se vidi u histološkim ocjenama oštećenja bubrega (Banffovi rezultati) na neliječene pozadinske nivoe i snizio nivoe oba funkcionalna rezultata patologije bubrega, kreatinina i BUN.
Upala u neliječenim BN bubrezima bila je povezana s povećanjem i TIMP-1 i MIP-3A/CCL20. Poređenja radi, vidjeli smo da je tretman PrC-210 značajno smanjio nivo TIMP-1 i značajno povećao nivo MIP-3A/CCL20.
Tkivni inhibitor metaloproteinaze-1 (TIMP-1) je važan regulator sinteze i razgradnje ekstracelularnog matriksa (ECM). Prekomjerna akumulacija ECM je glavni patološki mehanizam razvoja fibroze tokom i nakon akutne povrede bubrega. U suštini nema ekspresije TIMP-1 u normalnombubregtkiva [25], zapažanje koje je potvrđeno na našoj slici 6A, B, ali je poznato da je TIMP-1 izražen u oštećenim bubrezima, uglavnom u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama, bubrežnoj tubularnoj bazalnoj membrani i citoplazmi intersticijalne ćelije. Povećana ekspresija TIMP-1 bila je u pozitivnoj korelaciji sa istovremenim pogoršanjem bubrežne funkcije [26]. Pacovi tretirani PrC-210 pokazali su duboko smanjenje nivoa TIMP-1 (p=0.001), kako u homogenatu bubrega tako i u plazmi; ovo implicira da PrC-210 ispoljava snažan zaštitni efekat protiv reorganizacije ekstracelularnog matriksa bubrega izazvane transplantacijom.
Hemokin MIP-3a/CCL20 aktivira receptor CCR6, koji je posebno izražen na regulatornim T-ćelijama (Tregs). CCL20 je eksprimiran u tubularnim endotelnim i intersticijskim stanicama, a također je pojačan u bubrezima s akutnom ozljedom bubrega. Put CCL20-CCR6 igra vitalnu ulogu u regrutaciji T-ćelija posredovanom Treg-om u bubreg, a opisano je da Treg-ovi imaju pozitivnu ulogu ububregpopravak, tolerancija na transplantaciju i preživljavanje bubrega. Oba blokada antitijela na putu CCL20–CCR6, kao i upotreba miševa s nedostatkom CCR6- u akutnimbubregeksperimenti sa povredama, pokazali su da povećavaju ozbiljnost zatajenja bubrega i mortalitet [27]. Ovo sugerira da klinički, poboljšanje CCL20-CCR6 puta i aktivacija Treg-a mogu biti mogući terapeutski put za ograničavanje akutnih i kroničnihbubregpovreda [28]. U našoj studiji (Slika 6D), nivo MIP-3a/CCL20 bio je značajno viši kod pacova tretiranih PrC-210- nego kod netretiranih pacova. Nagađamo da je ovo jedan od razloga za (i) značajno manje angažovanje mononuklearnih ćelija u bubrezima (slika 3C) i (ii) značajno smanjeno oštećenje bubrega (slika 2) kod štakora tretiranih PrC-210- .
Normalna mitohondrijalna funkcija bubrega, i što je još važnije, uvrede tokom procesa skladištenja bubrega, implantacije i inflamacije nakon implantacije su značajne determinante povrede ROS-a i zatajenja bubrega tokom transplantacije. Stoga je bilo značajno da se pokazalo da PrC-210 daje potpunu supresiju fragmentacije mitohondrijske DNK (slika 7) u koncentracijama (2-4 mM) koje su postignute u plazmi i miševa i pacova koji su davani ili intraperitonealno ili oralne sistemske 0.5 MTD doze PrC-210 koje su bile tolerisane bez detektovane toksičnosti [29].
U našim ranijim studijama vezanim za transplantaciju bubrega [16,17], vidjeli smo značajno povećanje aktivirane kaspaze u bubrezima izloženim "hladnoj ishemiji" i ozljedi "ishemija-reperfuzije". Ovi inzulti bubrega izazvani ishemijom su svedeni na pozadinu tretmanom sa PrC-210 (Slika 8). U studijama ovog rukopisa (slika 5), u kojima su hladna ishemija i ishemija-reperfuzija u suštini eliminisane neposrednom transplantacijom, nije bilo povećanja aktivirane kaspaze u transplantiranim bubrezima. Umjesto toga, aktivirana kaspaza je značajno smanjena na plus 20 h u kontrolama "Bez liječenja lijekom", a tretman PrC{10}} je potpuno eliminirao ovo smanjenje kaspaze u plus 20 h štakora i održao nivo kaspaze stabilnim. Naše tumačenje ovih zanimljivih rezultata je da odsustvo bilo kakvog značajnog inzulta slobodnih radikala izazvanog ishemijom kroz ROS i RNS do posttransplantacijebubrezi, nema povezane stanične smrti i markera apoptoze poput aktiviranih kaspaza. Umjesto toga, u ovim alografskim transplantacijama bubrega, upalni signali iz novoizraženih cito- i hemokina sada reguliraju metabolizam stanica, što uključuje utjecaj na put apoptoze. Literatura opisuje da prekomjerna ekspresija TIMP-1 dovodi do supresije apoptoze [26]. Naši rezultati kaspaze (Slika 5) podržavaju ovaj opisani TIMP-1 efekat, i impliciraju da je TIMP-1 važan u regulaciji patofiziologije oštećenja ćelija nakon transplantacije alografta bubrega. Kao potvrđivanje ranije PrC-210 supresije ekspresije TIMP-1 (Slika 6A, B), tretman PrC-210 potpuno je uklonio promjenu kaspaze, održavajući nivoe kaspaze na istom nivou kao kod kontrolni bubrezi "0 h". Zato što smanjeni nivoi PrC-210 TIMP-1 u serumu na plus 20 h (slika 6B) tačno odražavaju značajnu supresiju alografta: (i) apoptoza (slika 5), (ii) histološka patologija (slike 2 i 3) i (iii) infiltracija inflamatornih ćelija (Slika 3), očekujemo da će praćenje nivoa TIMP-1 u serumu kod primalaca alografta bubrega biti logičan način za praćenje kliničke efikasnosti PrC-210 u budućim kliničkim ispitivanjima .
U našem dosadašnjem radu [16,17], pokazali smo da PrC-210 može zaštititi transplantirane bubrege i od hladno-ishemijskog i ishemijsko-reperfuzijskog inzulta. U ovoj studiji sada vidimo da PrC-210 također štiti bubrege alografta od neishemijskih inflamatornih inzulta koji se javljaju nakon implantacije bubrega. PrC-210 značajno smanjuje nivoe akutnih inflamatornih citokina, kao što je TNF-alfa, i potiskuje ekspresiju TIMP-1 hemokina. Oba ova događaja, i potencijalno, dodatno podržana dodatnom ekspresijom CCL20, bi se očekivalo da: (i) smanje oštećenje bubrega alograftom, (ii) potisnu regrutaciju T-ćelija u bubregu i (iii) potisnu aktivaciju urođenih i adaptivni imuni sistem. Na slici 8, sumiramo ove nalaze kako bismo podržali ulogu koju smatramo da PrC- 210 može igrati u transplantaciji bubrega kod ljudi; suzbija: (i) hladnu ishemiju oštećenja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i reaktivnih vrsta dušika (RNS) u pozadini [17],
(ii) ishemijsko-reperfuzijsko oštećenje ROS u pozadini [16], i (iii) oštećenje inflamacije alografta značajno, u nekim slučajevima, u pozadini. Budući da je primarni mehanizam djelovanja PrC-210 za PrC-210 hvatanje slobodnih radikala kisika i dušika, to implicira da ovi slobodni radikali značajno doprinose oštećenju bubrega koje se vidi u neishemijskim stanjima, tj. upala povezana sa alograftom proučavana u ovom rukopisu.
Ukratko, ovo sugerira da bi PrC-210 mogao pružiti široko primjenjivu zaštitu organa za mnoge uslove transplantacije alografta; mogao bi zaštititi transplantirane bubrege tokom i nakon svih faza procesa transplantacije – od donacije organa, preko transporta, re-implantacije i postoperativne upale – kako bi se akutno i kronično odbacivanje svelo na minimum.
Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak
Doprinosi autora:U izvođenju istraživanja i analize podataka učestvovali su NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV i MMCG; TRG i NAW su učestvovali u dizajnu istraživanja i analizi podataka; WEF i TRG su učestvovali u dizajnu istraživanja, izvođenju istraživanja, analizi podataka i pisanju rada. Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.
finansiranje:Ovo istraživanje je financirao UW Institut za klinička i translacijska istraživanja i grant UL1TR002373 UW ICTR-u od NIH/NCATS, Američkog društva transplantacijskih hirurga (133 AAA1552), Američkog koledža hirurga (133 AAB2176) i grant podrške WEF-u (# R03CA176799).
Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Ovo istraživanje je prospektivno odobrio institucionalni odbor za negu i upotrebu životinja Medicinskog fakulteta i javnog zdravlja na Univerzitetu Wisconsin (Protokol o životinjama #M005204).
Izjava o dostupnosti podataka:Podaci studije su u potpunosti dostupni u ovom rukopisu. Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Reference
1. Wang, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Barber, RM; Bhutta, ZA; Casey, DC; Charlson, FJ; Chen, AZ; Coates, MM; Coggeshall, M.; et al. Globalni, regionalni i nacionalni očekivani životni vijek, smrtnost od svih uzroka i smrtnost od specifičnih uzroka za 249 uzroka smrti, 1980–2015: Sistematska analiza za Globalnu studiju o teretu bolesti 2015. Lancet 2016, 388, 1459–15. [CrossRef]
2. Treat, E.; Chow, E.; Peipert, JD; Waterman, A.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Bowring, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et al. Dostava bubrega živih donora i ishoda primatelja transplantacije. arapski. Archaeol. Epigr. 2017, 18, 632–641. [CrossRef] [PubMed]
3. Težina, SC; Bell, PR; Nicholson, ML Renalna ishemija-reperfuzijska povreda. Br. J. Surg. 1996, 83, 162–170. [PubMed]
4. Sellarés, J.; De Freitas, DG; Mengel, M.; Reeve, J.; Reinecke, G.; Sis, B.; Hidalgo, LG; Famulski, K.; Matas, A.; Halloran, PF Razumijevanje uzroka neuspjeha transplantacije bubrega: Dominantna uloga odbacivanja i nepridržavanja posredovanih antitijelima. Am. J. Transplant. 2012, 12, 388–399. [CrossRef]
5. Siedlecki, A.; Irish, W.; Brennan, DC Odgođena funkcija grafta u transplantaciji bubrega. arapski. Archaeol. Epigr. 2011, 11, 2279–2296. [CrossRef]
6. Hidalgo, LG; Campbell, PM; Sis, B.; Meinecke, G.; Mengel, M.; Chang, J.; Sellars, J.; Reeve, J.; Halloran, PF; Hidalgo, LG; et al. De Novodonor-specifična antitijela u vrijeme biopsije transplantacije bubrega susreće se s mikrovaskularnom patologijom i kasnom neuspjehom grafta. arapski. Archaeol. Epigr. 2009, 9, 2532–2541. [CrossRef]
7. Loupy, A.; Hill, GS; Jordan, SC Utjecaj donorskih specifičnih anti-HLA antitijela na kasno zatajenje alografta bubrega. Nat. Rev. Nephrol. 2012, 8, 348–357. [CrossRef]
8. Huang, G.; Wilson, NA; Reese, SR; Jacobson, LM; Zhong, W.; Djamali, A. Karakterizacija transfuzijom izazvanog akutnog odbacivanja posredovanog antitijelima u modelu transplantacije bubrega kod pacova. arapski. Archaeol. Epigr. 2014, 14, 1061–1072. [CrossRef] [PubMed]
9. Jordan, SC; Pescovitz, MD Presenzibilizacija: problem i upravljanje njime. Clin. J. Am. Soc. Nefrol. 2006, 1, 421–432. [CrossRef] [PubMed]
10. Stegall, M.; Gloor, J.; Winters, J.; Moore, S.; DeGoey, S. Poređenje plazmafereze u odnosu na desenzibilizaciju visoke doze IVIG-a kod primatelja renalnog alografta s visokim nivoom aloantitijela specifičnih za donor. arapski. Archaeol. Epigr. 2006, 6, 346–351. [CrossRef] [PubMed]
11. Peebles, DD; Soref, CM; Fahl, WE ROS-čistač i radioprotektivna efikasnost novog PrC-210 aminotiola. Radiat. Res. 2012, 178, 57–68. [CrossRef]
12. Soref, CM; Haker, TA; Fahl, MI Novi oralno aktivan, aminotiol radioprotektor bez nuspojava mučnine i hipotenzije u svojim najvećim radioprotektivnim dozama. Int. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701–e707. [CrossRef]
13. Techapiesancharoenkij, N.; Fiala, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforaphane, sredstvo za hemoprevenciju raka, inducira puteve povezane s biosintezom membrane kao odgovor na oštećenje tkiva aflatoksinom B1. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015, 282, 52–60. [CrossRef] [PubMed]
14. Jermusek, F.; Benedict, C.; Dreischmeier, E.; Brand, M.; Under, M.; Jeffery, JJ; Ranallo, FN; Fahl, WE Značajno suzbijanje oštećenja DNK izazvanog CT zračenjem u normalnim ljudskim ćelijama od strane PrC-210 radioprotektora. Radiat. Res. 2018, 190, 133–141. [CrossRef] [PubMed]
15. Hacker, TA; Diarra, G.; Fahl, BL; Natrag, S.; Kaufmann, E.; Fahl, WE Značajno smanjenje ishemijsko-reperfuzijske ćelijske smrti kod infarkta miokarda miša korištenjem PrC-210 ROS čistača neposrednog djelovanja. Pharmacol. Res. Perspect. 2019, 7, e00500. [CrossRef]
16. Bath, NM; Fahl, WE; Redfield, RR Značajno smanjenje mišje bubrežne ishemije-reperfuzijske ćelijske smrti korištenjem PrC-210 reaktivnih vrsta kisika s trenutnim djelovanjem. Transplant. Direktno. 2019, 5, e549–e555. [CrossRef] [PubMed]
17. Verhoven, BM; Karim, AS; Bath, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Redfield, RR; Fahl, WE značajno poboljšanje u hladnom skladištenju bubrega pacova koristeći UW rješenje za očuvanje organa dopunjeno PrC-210 čisticom slobodnih radikala trenutnog djelovanja. Transplant. Direktno 2020, 6, e578. [CrossRef]
18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Ward, JA; Choo, DI; Riazuddin, S.; Ahmed, ZM Radioprotektivni efekat aminotiola PrC-210 na ozračeno unutrašnje uho zamorca. PLOS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]
19. Copp, RR; Peebles, DD; Fahl, WE Sinteza i regulatorna aktivnost prototipa člana nove porodice aminotiol radioprotektora. Bioorganic Med. Chem. Lett. 2011, 21, 7426–7430. [CrossRef]
20. Fahl, WE; Peebles, D.; Copp, RR Amino tiol spojevi i kompozicije za upotrebu u kombinaciji s terapijom raka. US Patent 7,314,959, 12. april 2004.